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方法文章

用于生物标志物检测的电解质门控石墨烯场效应晶体管的开发与功能化

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DOI：

10.3791/63393

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2022年2月1日

 ,  , 
1Lane Department of Computer Science and Electrical Engineering, West Virginia University, 2Beijing Graphene Institute

本文内容

摘要

本实验方案展示了电解质门控石墨烯场效应晶体管（EGGFET）生物传感器的构建及其在生物标志物免疫球蛋白G（IgG）检测中的应用。

摘要

在本研究中，石墨烯及其衍生物已被探索并应用于诸多领域，包括电子学、传感、能量存储和光催化。高质量、高均匀性且低缺陷石墨烯的合成与制备，对于高性能和高灵敏度器件至关重要。在众多合成方法中，化学气相沉积法（CVD）被认为是制备石墨烯的领先方法，可控制石墨烯层数并获得高质量石墨烯。CVD生长的石墨烯需要从其生长所用的金属基底转移至 绝缘基底，以实现实际应用。然而，将石墨烯完整地分离并转移至新基底上，同时不破坏或影响其结构与性能，以获得均匀的单层，仍具挑战性。此外，电解质门控石墨烯场效应晶体管（EGGFET）因其高灵敏度和标准器件结构，在多种生物分子检测中展现出广泛应用前景。本文展示了聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）辅助的石墨烯转移方法、石墨烯场效应晶体管（GFET）的制备以及生物标志物免疫球蛋白G（IgG）的检测。采用拉曼光谱和原子力显微镜对转移后的石墨烯进行表征。该方法被证明是一种实用的策略，可在保持石墨烯晶格结构完整的前提下，将洁净且无残留的石墨烯转移至用于电子或生物传感应用的绝缘基底上。

引言

石墨烯及其衍生物已被研究并应用于诸多领域，包括电子学1,2、传感3,4,5、能量存储6,7以及光催化1,6,8。高质量、高均匀性且低缺陷的石墨烯的合成与制备，对于高性能和高灵敏度器件至关重要。自2009年化学气相沉积（CVD）技术发展以来，该方法展现出巨大前景，并已成为石墨烯制备技术中不可或缺的重要组成部分9,10,11,12,13。CVD石墨烯通常在金属基底上生长，随后为实际应用需要被转移至绝缘基底上14。近年来已有多种转移方法被用于CVD石墨烯的转移。其中，聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）辅助转移法是目前应用最广泛的技术。该方法因其可实现大规模生产、成本较低以及转移后石墨烯质量较高，特别适用于工业应用14,15。该方法的关键在于彻底去除转移后残留的PMMA，因为残留物可能导致石墨烯电子性能下降14,15,16，影响生物传感器的灵敏度与性能17,18，并引起器件间显著的性能差异19。

在过去几十年中，基于纳米材料的生物传感器得到了广泛研究，包括硅纳米线（SiNW）、碳纳米管（CNT）和石墨烯20。由于石墨烯具有单原子层结构和独特的性质，表现出优异的电子特性、良好的生物相容性以及易于功能化的特点，使其成为开发生物传感器的理想材料14,21,22,23。由于场效应晶体管（FET）具有高灵敏度、标准构型以及成本低廉、适合大规模生产等优势21,24，相较于其他基于电子器件的生物传感设备，FET在便携式和即时检测（point-of-care）应用中更受青睐。电解质门控石墨烯场效应晶体管（EGGFET）生物传感器即是上述FET的典型代表21,24。EGGFET能够检测多种目标分析物，如核酸25、蛋白质24,26、代谢物27以及其他具有生物学意义的分析物28。本文所述技术实现了化学气相沉积（CVD）石墨烯在无标记生物传感纳米电子器件中的应用，相较于其他生物传感设备，具有更高的灵敏度和精确的时间检测能力29。

本研究展示了一种开发EGGFET生物传感器并实现其生物标志物检测功能化的整体流程，包括将化学气相沉积（CVD）石墨烯转移至绝缘基底上，以及对转移后的石墨烯进行拉曼光谱和原子力显微镜（AFM）表征。此外，还讨论了EGGFET的制备及其与聚二甲基硅氧烷（PDMS）样品输送井的集成、生物受体的功能化，以及通过加标回收实验成功检测血清中人免疫球蛋白G（IgG）的方法。

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方案

1. 石墨烯的化学气相沉积转移

  1. 使用剪刀将铜基底上的石墨烯片裁剪成两半（2.5 cm × 5 cm）。用耐高温胶带固定石墨烯方片的四个角于旋涂仪垫圈上（见材料表）。
    注意：购买的石墨烯尺寸为 5 cm × 5 cm（见材料表）。
  2. 在石墨烯片上旋涂一层薄的 PMMA 495K A4（100–200 nm），先以 500 rpm 旋转 10 秒，再以 2000 rpm 旋转 50 秒。然后将样品在 150 °C 下烘烤 5 分钟。
  3. 使用氧气等离子体（见材料表）在 30 W、15 sccm 条件下处理 5 分钟，去除石墨烯背面。
  4. 将经等离子体处理的石墨烯方片裁剪为更小的尺寸（1 cm × 2 cm），用于器件制备。
  5. 将预清洁的基底（SiO2）切割成约 2.5 cm × 2 cm 的小片。
  6. 使用商用石墨烯蚀刻剂（氯化铁）蚀刻去除铜层（见材料表）。不要稀释蚀刻剂。将样品以铜面朝下、PMMA 面朝上的方式漂浮在液态蚀刻剂中。
  7. 铜层蚀刻完成后，用经等离子体处理的基底缓慢提起石墨烯薄膜。
  8. 将转移后的石墨烯在空气中干燥 2 小时，然后在 80 °C 下烘烤 15 分钟。
  9. 按照以下步骤去除 PMMA：
    1. 在 70 °C 下用丙酮蒸气预处理样品。将 PMMA 面朝下，保持样品距丙酮蒸气上方约 2 cm 处 4 分钟。然后将样品浸入丙酮中 5 分钟。
    2. 小心地用去离子水清洗样品，并在显微镜下观察转移后的石墨烯。最后用 N2 轻柔吹干样品。
    3. 进行原子力显微镜（AFM）观察，确认石墨烯表面无 PMMA 残留。若图像中可见 PMMA 残留，则重复一次丙酮蒸气清洗和浸泡步骤。
  10. 进行拉曼光谱和原子力显微镜（AFM）表征，以确认石墨烯单层的转移情况并观察其表面特性（图 1A、B）。

2. 石墨烯场效应晶体管（GFET）的制备

  1. 使用丙酮、异丙醇（IPA）和去离子水（DI 水）清洗已转移石墨烯的基底，然后在热板上于 75 °C 烘烤 30 分钟（图 2A）。
  2. 使用电子束蒸发仪30（见材料表），在石墨烯样品上沉积 5 nm 镍和 45 nm 金（图 2B）。
  3. 使用掩模 A（补充图 1）进行第一次光刻30，以图形化电极（图 2C）。
  4. 在样品上旋涂正性光刻胶（AZ 5214E，见材料表）（2000 rpm 旋涂 45 秒），并在 120 °C 下烘烤 1 分钟。
  5. 将样品置于紫外泛光曝光系统中，在 200 mJ/cm2 条件下曝光约 10 秒。
  6. 使用光刻胶显影液（AZ300 MIF，见材料表）显影约 2 分钟，然后用去离子水冲洗。
  7. 将样品浸入金刻蚀液中刻蚀金层 10 秒；用去离子水冲洗，并将样品浸入丙酮中 10 分钟以去除残留的光刻胶层（图 2C）。
  8. 使用丙酮、异丙醇和去离子水清洗样品；在热板上于 75 °C 烘烤 30 分钟。然后使用掩模 B（补充图 1）进行第二次光刻，以图形化石墨烯通道。
    注意：除掩模对准器中的紫外曝光系统外，其余工艺参数与第一次光刻相同（步骤 2.4–2.6）（图 2D）。
  9. 将样品浸入 60 °C 的镍刻蚀液中刻蚀镍层 10 秒；用去离子水冲洗，并用 N2 吹干（图 2D）。
  10. 将样品放入等离子体灰化仪中，使用氧气等离子体（氧气流速 49 sccm，功率 100 W，时间 90 秒）去除暴露的石墨烯；随后将样品浸入丙酮中 10 分钟以去除光刻胶层（图 2E）。
  11. 使用丙酮、异丙醇和去离子水清洗样品；在热板上于 75 °C 烘烤 30 分钟，并使用掩模 C（补充图 1）进行第三次光刻，以图形化钝化光刻胶层，从而保护基底上层的石墨烯。除掩模对准器中的紫外曝光系统外，其余工艺参数与第一次光刻相同（步骤 2.4–2.6）（图 2F）。
  12. 完成第三次光刻后，将样品在 60 °C 的镍刻蚀液中浸渍 10 秒以去除残留的镍层；然后用去离子水冲洗，并用 N2 吹干（图 2G）。最后，在热板上于 120 °C 烘烤 30 分钟（图 2H）。

3. 用于IgG检测的GFET功能化

  1. 组装样品递送通道。
    1. 使用软光刻技术在 PDMS 中制备样品递送通道31。
    2. 将石墨烯器件浸入 0.1 M 的 NaOH 溶液中 30 秒；用去离子水冲洗，并在器件表面保留一层薄水层，以辅助 PDMS 井的对准和键合。然后使用氧气等离子体活化 PDMS 井的表面。
    3. 在显微镜下对准样品递送通道与石墨烯器件；将对准后的器件置于 60 °C 的烘箱中 3 小时，以完成键合。组装后的器件如图 3A所示。
  2. 对 GFET 进行功能化修饰。
    1. 使用 IgG 适体对石墨烯表面进行功能化修饰（参见材料表）。使用移液器从 PDMS 井中加载和移除每种试剂或缓冲液。示意图过程如图 4所示。
      注：以下步骤均在室温下操作。
    2. 用 DMSO 冲洗石墨烯表面三次后，加入 1-吡rene丁酸 N-羟基琥珀酰亚胺酯（PBASE，10 mM 溶于 DMSO，参见材料表），孵育 2 小时。
    3. 用 DMSO 冲洗后，加入 5' 氨基修饰的 IgG 适体（20 µM 溶于 1x PBS），孵育 3 小时，再用 1x PBS 冲洗三次。
    4. 在石墨烯表面加入牛血清白蛋白（BSA，10% w/v 溶于 1x PBS），孵育 1 小时，再用 1x PBS 冲洗三次。

4. IgG 检测

  1. 用 0.01x PBS 冲洗装置三次。将 PDMS 微腔中充满 0.01x PBS（检测缓冲液）（图 3A、B）。
  2. 将电极连接至高性能参数分析仪（见材料表）。将源极接地，漏极和栅极分别连接至参数分析仪配备的源测量单元（SMU 1 和 SMU 2）（图 3C）。
  3. 设置测量参数并启动采样过程。
  4. 通过连续监测漏极电流来测试 EGGFET 对 IgG 的响应。将 IgG 溶解于不同浓度的 0.01x PBS 中，将溶液加入检测室，并持续监测漏极电流。保存数据。

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结果

代表性结果分别展示了通过拉曼光谱和原子力显微镜（AFM）表征的转移后化学气相沉积（CVD）石墨烯。拉曼成像中的G峰和2D峰提供了有关转移单层石墨烯存在性及其质量的全面信息32（图1）。如图2所示，采用标准光刻工艺30,31制备石墨烯场效应晶体管（GFET）器件。图3展示了制备完成的GFET器件，其上组装了聚二甲基硅氧烷（PDMS）样品进样井以及实验装置。PDMS以10:1的质量比混合后倒入培养皿中，随后将含有PDMS混合物的整个培养皿置于60 °C烘箱中加热3小时。固化后的PDMS从培养皿上剥离，并裁剪成一个立方体（1 cm × 1 cm × 1 cm）。然后使用打孔器在PDMS立方体上打出一个直径为6 mm的孔作为进样井。

用于IgG检测的...

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讨论

购买的铜膜上化学气相沉积石墨烯需要裁剪至合适尺寸，以用于后续制备步骤。切割薄膜可能导致褶皱，需避免此现象。可参考制备步骤中提供的参数进行石墨烯的等离子体刻蚀，但使用不同仪器时这些数值可能需要调整。刻蚀后的样品必须密切监控和检查，以确保石墨烯完全被刻蚀。可采用多种预清洗方法清洁基底，例如在丙酮、异丙醇（IPA）和去离子水中分别超声处理5分钟，用去离子水冲洗，并用氮气吹干或进行O2等离子体处理（300 W，流量约100 sccm，持续5分钟）。使用商用氯化铁铜刻蚀液时，铜的刻蚀速率约为1.25–1.67 微米/分钟。刻蚀过程需密切观察。刻蚀完成后，需用去离子水充分冲洗。

本方案中提到的丙酮清洗技术是最优的残留物清洗方法。等离子清洗有可能损伤单层石墨烯，因此对石墨烯层最友好的清洗技术是丙酮清洗。但去除PMMA残留同样至关重要，因为它会影响后续工艺。进行拉曼光谱分析和原子力显微镜（AFM）检测可以实时评估石墨烯的质量以及PMMA残留情况。本方案中使用的仪器和化学品非常关键，会直接影响所制备器件的质量，因此需要定期检查并更新仪器的性能状态和化学品的有效性。

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披露

作者声明无任何竞争利益或利益冲突需要披露。

致谢

实验在西弗吉尼亚大学进行。我们感谢西弗吉尼亚大学共享研究设施中心在器件制备和材料表征方面的支持。本工作由美国国家科学基金会资助，项目编号NSF1916894。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1-芘丁酸 N-羟基琥珀酰亚胺酯Sigma Aldrich457078-1G功能化
Asylum MFP-3D 原子力显微镜Oxford Instruments石墨烯表征
AZ 300 MIFMicroChemicalsAZ 300 MIF光刻胶显影液
AZ 300 MIFMicroChemicalsAZ 300 MIF光刻胶
牛血清白蛋白Sigma Aldrich810014封闭
Branson 1210 超声波清洗机SONITEK样品清洗
铜刻蚀液Sigma Aldrich667528-500ML去除铜膜以释放石墨烯
二甲基亚砜 (DMSO)VWR97063-136功能化
一次性活检打孔器，Integra MiltexVWR21909-144在PDMS中创建样品井
金刻蚀液Gold Etch, TFA, Transene658148刻蚀
石墨烯Graphene supermarket2" x 2" 片材器件的生物传感元件
IgG 适配体Base Pair Biotechnologies定制生物受体
Keithley 4200A-SCS 参数分析仪Tektronix测量与检测
KMG CR-6KMG chemicals64216铬刻蚀液
Kurt J. Lesker 电子束蒸发仪Kurt J. Lesker金属沉积
Laurell Technologies 400 旋涂机Laurell TechnologiesWS-400BZ-6NPP/LITE薄膜涂覆
March PX-250 等离子体灰化仪March Instruments样品清洗
镍刻蚀液Nickel Etchant, TFB, Transene600016000刻蚀液
OAI 漫曝光系统OAI光刻
磷酸盐缓冲液 (PBS)Sigma Aldrich806552-500ML缓冲液
PMMA 495K A4MicroChemicalsPMMA 495K A4辅助石墨烯转移的光刻胶
聚二甲基硅氧烷 (PDMS)Sigma AldrichSylgard 184样品输送井
Renishaw InVia 拉曼显微镜Renishaw石墨烯表征
氢氧化钠 (NaOH)Sigma Aldrich221465-25G功能化
Suss Microtech MA6 掩模对准仪Suss MicroTec光刻
Thermo Scientific Cimarec 加热板Thermo ScientificSP131635样品与器件烘烤

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