方法文章

低输入细胞核分离和多路复用小鼠交感神经节条形码抗体进行单核RNA测序

DOI：

10.3791/63397

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2022年3月23日

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1Department of Anatomy & Embryology, Leiden University Medical Center, 2Department of Cardiology, Leiden University Medical Center, 3Department of Medical Statistics and Bioinformatics, Leiden University Medical Center

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该协议描述了用于单核测序的详细，低输入样品制备，包括小鼠上颈神经节和星状神经节的解剖，细胞解离，冷冻保存，细胞核分离和标签条形码。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

心脏自主神经系统在控制心功能（如心率和心脏收缩力）方面至关重要，分为交感神经和副交感神经分支。通常，这两个分支之间存在平衡以维持体内平衡。然而，心肌梗死、心力衰竭和高血压等心脏病状态可诱发心脏神经支配中涉及的细胞重塑，这与不良临床结果相关。

虽然心脏自主神经系统的组织学结构和功能有大量的数据，但其在健康和疾病中的分子生物学结构在许多方面仍然是神秘的。单细胞RNA测序（scRNA-seq）等新技术有望以单细胞分辨率对组织进行遗传表征。然而，相对较大的神经元尺寸可能会阻碍这些技术的标准化使用。在这里，该协议利用基于液滴的单核RNA测序（snRNA-seq），这是一种表征心脏交感神经元在健康和疾病中的生物学结构的方法。证明采用逐步方法对从成年小鼠中解剖的双侧上颈椎（SCG）和星状神经节（StG）进行snRNA-seq。

这种方法能够长期保存样品，当无法在短时间内一次收集来自多个个体/实验的样品时，保持足够的RNA质量。使用标签寡核苷酸（HTO）对细胞核进行条形码，可以在测序后对不同的神经节样本进行解复用和追溯。随后的分析显示，交感神经节的神经元、卫星神经胶质和内皮细胞成功捕获细胞核，经 snRNA-seq 验证。总之，该协议为交感神经外源性心神经节的snRNA-seq提供了一种逐步的方法，该方法有可能在其他器官和组织的神经支配研究中得到更广泛的应用。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

自主神经系统（ANS）是维持身体稳态的周围神经系统的重要组成部分，包括对环境条件和病理学的适应1。它参与调节全身的多个器官系统，如心血管，呼吸，消化和内分泌系统。ANS分为交感神经和副交感神经分支。交感神经系统突触的脊柱分支在交感神经链的神经节中，双侧位于椎旁位置。双侧颈神经节和胸神经节，尤其是 StG，是参与心脏交感神经支配的重要组成部分。在疾病状态下，例如心脏缺血，可能发生神经元重塑，导致交感神经过驱2。神经元重塑已经在人类和其他几种动物物种的多项组织学研究中得到证实3，4，5，6。目前缺乏心脏缺血诱导的心脏交感神经节中神经元重塑的详细生物学表征，并且心脏交感神经系统（SNS）内特化神经元细胞类型或亚型的基本生物学特征尚未完全确定在健康和疾病7中。

新技术，如scRNA-seq，为单细胞水平8，9上小组织的遗传表征打开了大门。然而，相对较大的神经元尺寸可能会阻碍这些单细胞技术在人类中的优化使用10。此外，由于测序过程中的高损耗，单细胞测序需要高通量细胞来恢复足够的细胞数量。当研究难以在一个会话中捕获的小组织并且需要多个样品来引入足够的单个细胞进行测序时，这可能具有挑战性。最近开发的基于液滴的snRNA-seq技术（即10x Chromium平台）允许研究单核11，12之间的生物学差异。对于大细胞（>30μm），snRNA-seq比scRNA-seq具有优势，这些细胞可能无法在乳液（GEMs）的凝胶珠中捕获，并且与广泛的解离和/或长期保存的相容性得到改善13，14，15。

异质性，神经元细胞的数量以及心脏SNS中富集的其他细胞是ANS在健康和疾病状态下表征的重要方面。此外，每个交感神经节的器官或区域特异性神经支配也会导致 SNS 的复杂性。此外，交感神经链的颈椎、星状和胸神经节已被证明可以支配心脏的不同区域16。因此，有必要对来自单个神经节的神经节细胞进行单核分析，以研究其生物学结构。

基于液滴的 snRNA-seq 允许同时对来自多个样品的数千个细胞池进行转录组范围的表达谱分析，并且成本低于基于板的测序平台。这种方法使基于液滴的snRNA-seq更适合于SCG和StG内细胞的细胞表型分类和新亚群鉴定，值得注意的是，该协议为交感神经外源性心神经节的鉴定，分离和单核RNA测序提供了一种简洁的逐步方法，该方法具有广泛应用在神经节支配的其他相关器官和组织表征研究中的潜力 健康和疾病。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该协议描述了小鼠宫颈和/或宫颈胸（星状）神经节的snRNA-seq所需的所有步骤。使用雌性和雄性C57BL / 6J小鼠（15周龄，每个性别n = 2）。另外一只Wnt1-Cre;mT/mG小鼠用于可视化神经节以进行解剖17，18。这只额外的小鼠是由 B6.Cg-Tg（Wnt1-cre）2Sor/J小鼠和B6.129（Cg）-Gt（ROSA）26Sortm4（ACTB-tdTomato，-EGFP）Luo/J小鼠的杂交杂交产生的。所有动物实验均根据NIH出版并经莱顿大学动物伦理委员会批准的《实验动物护理和使用指南》（许可证号AVD1160020185325，荷兰莱顿）进行。有关协议中使用的所有材料，设备，软件和动物的详细信息，请参阅材料 表 。

1. 准备工作

注意:所有步骤都在细胞培养流柜中执行。

  1. 通过将仪器浸入70%乙醇中20分钟来清洁镊子和剪刀。
  2. 准备由补充有B-27加（1x），L-谷氨酰胺（2mM）和1%抗生素抗真菌剂的神经基培养基组成的神经节培养基。在室温下预热神经节介质。
  3. 制备消化溶液:将0.25%胰蛋白酶-EDTA（1:1）和1，400 U / mL胶原酶2型溶解在神经节培养基中。
  4. 制备新鲜，冷（4°C）细胞洗涤缓冲液（0.4%牛血清白蛋白[BSA]）和裂解缓冲液（10mM Tris-HCl，10mM NaCl，3mM MgCl2和0.1%非离子洗涤剂，40 U / mL RNAse在无核酶水中）用于细胞核分离。
  5. 制备细胞核洗涤缓冲液（1x磷酸盐缓冲盐水[PBS]与2.0%BSA和0.2U / μL RNase抑制剂）。
  6. 制备ST染色缓冲液（ST-SB）（10mM Tris-HCl，146mM NaCl，21mM MgCl2，1 mM CaCl2，2%BSA，0.02%吐温-20在无核酸酶水中）。

2. 成年小鼠上颈神经节（SCG）的解剖

  1. 对小鼠实施安乐死，并将它们放在冰上。
    注意:在目前的研究中，共有4只C57BL6 / J小鼠通过CO2 窒息安乐死。或者，当需要收集大量血液用于其他研究目的时，可以使用异氟醚，然后放血。
  2. 将小鼠固定在带有针脚的解剖板上，并用70%乙醇浇注，以尽量减少毛皮的分散（不需要剃须）。
  3. 在立体显微镜下，用剪刀进行中线切口，打开颈部区域的皮肤，将下颌下腺移开，然后取出胸骨肌以暴露并定位颈总动脉及其分叉（图1A，B，见箭头）。
  4. 解剖左右颈动脉分叉及其附着的组织。将每个解剖的组织转移到含有冷PBS的单独的3.5厘米培养皿中。
  5. 寻找附着在颈动脉分叉上的SCG。通过移除培养皿中的动脉和其他附着的组织来进一步清洁SCG（图1E）。

3. 成年小鼠星状神经节（StG）的解剖

  1. 要剖析StG，请在腹部进行中线切口，然后打开横膈膜和腹侧胸壁。
  2. 切除心脏和肺部，露出胸背。在第一肋骨水平处寻找左和右StG前外侧至肌肉碰撞长肌（MCL）（图1C，D，用虚线表示）。
  3. 用镊子解剖左右StG，并将它们分别转移到含有冷PBS的3.5厘米培养皿中（图1F）。
    ​

4. 小鼠神经节细胞的分离和冷冻保存

图 2 总结了步骤 4-6。

  1. 小心地将所有单独的 SCG 和 StG 转移到带有镊子的分离 1.5 mL 微量离心管中。
    注意:不要使用移液器吸头来转移神经节，因为神经节容易粘附在塑料移液器吸头的壁上。
  2. 向每个微量离心管中加入500μL0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，并在37°C的振荡水浴中孵育40分钟。
    注意:此步骤旨在促进以下胶原酶2型溶液中的消化和细胞释放。
  3. 为每个样品准备一个含有5 mL神经节培养基的15 mL管。让神经节在微量离心管的底部沉降。收集含有极少数神经节细胞的上清液，将上清液转移到制备的15mL管中，并标记每个管。或者，为了节省一些时间，在不收集的情况下吸出胰蛋白酶- EDTA上清液，因为可以在其中检测到很少的解离细胞。
    注意:少量胰蛋白酶-EDTA溶液（~10-30μL）可以留在微量离心管中，以避免去除神经节。避免在此步骤中移液，因为它可能会损伤神经节并导致神经节细胞的低输出。
  4. 将500μL胶原酶2型溶液加入每个微量离心管中，并在37°C的振荡水浴中孵育35-40分钟。尝试在35分钟后重悬神经节;如果神经节仍然完好无损且不解离，请根据需要延长孵育时间或增加胶原酶2型溶液的浓度。
    注意:孵育时间可能因神经节大小而异。
  5. 通过上下移液约10次或直到不再检测到组织团块，将神经节重悬于胶原酶溶液中。
  6. 将细胞悬浮液转移到先前使用的15mL管中，该管含有来自同一神经节的神经节培养基和胰蛋白酶-EDTA悬浮液。在室温下用摆动的桶形转子离心机旋转10分钟，300× g 。小心地丢弃细胞上清液。
    注意:由于神经节细胞与单个神经节解离，因此细胞沉淀可能太小而无法用眼睛检测到;少量上清液可以留在管中，以避免意外去除细胞沉淀。
  7. 将神经节细胞重悬于270μL胎牛血清（FBS，低内毒素）中，并将每个细胞FBS悬浮液转移到1mL冷冻管中。
  8. 为了计数细胞，将5μL神经节细胞悬浮液与5μL0.4%台盼蓝染料混合，并将混合物加载到血细胞计数器中。在显微镜下计算总细胞数和活细胞数。
    注意:使用这种解离方案，细胞活力（活细胞计数/总细胞计数=活力%）通常高于90%。当从12至16周龄的小鼠中分离出神经节时，单个神经节（SCG或StG）的活细胞计数通常在9，000-60，000个细胞的范围内。
  9. 向冷冻管中的每个细胞FBS悬浮液中加入30μL二甲基亚砜（DMSO），充分混合，并将冷冻管转移到细胞冷冻容器中，该容器保持在室温下。将冷冻装载的容器在-80°C下储存过夜，并在第二天将冷冻管转移到液氮中，以便在测序前长期保存。

5. 细胞核分离

注意:从4只小鼠（共8个样品）中分离的左右SCG作为以下细胞核分离和测序制备的实例。在整个过程中将所有东西都放在冰上。由于小核沉淀的隐蔽性，强烈建议使用带有摆动桶的离心机，以促进整个过程中的上清液去除。

  1. 准备15 mL管，顶部有过滤器（30μm），并用1mL神经节培养基预冲洗滤网。
  2. 从液氮中取出冷冻管，并立即在37°C的水浴中解冻。 当一小粒冰留在冷冻室中时，将冷冻管从水浴中取出。
  3. 通过将1mL神经节培养基滴入每个冷冻管中，同时用手仔细摇动来恢复神经节细胞。 可选:为了评估细胞恢复，请在回收后混合细胞悬浮液，并取出5μL细胞悬浮液进行活细胞计数，如步骤4.8中所述。
  4. 将每个神经节细胞悬浮液加载到单独的过滤器（在步骤5.1中制备）上，并用4-5mL神经节培养基冲洗每个过滤器。
  5. 将过滤的细胞悬浮液在300× g下离心5分钟，小心地除去上清液，并将细胞重悬于50μL细胞洗涤缓冲液中。
  6. 将细胞悬浮液转移到低结合DNA / RNA 0.5mL微量离心管中。
  7. 在4°C下以500× g 离心细胞悬浮液5分钟。
  8. 在不接触管底部的情况下除去45μL上清液，以避免移位细胞沉淀。
  9. 加入45μL冷冻裂解缓冲液，并使用200μL移液器吸头轻轻上下移液。
  10. 将细胞在冰上孵育8分钟。
  11. 向每个管中加入50μL冷核洗涤缓冲液。 不要混合。
  12. 在4°C下以600× g 离心细胞核悬浮液5分钟。
  13. 除去95μL上清液而不破坏细胞核沉淀。
  14. 向沉淀中加入45μL冷却的细胞核洗涤缓冲液。 可选:取5μL细胞核悬浮液，与5μL0.4%台盼蓝混合计数，并用血细胞计数器在显微镜下检查细胞核的质量。
  15. 在4°C下以600× g 离心细胞核悬浮液5分钟。
  16. 在不接触管底部的情况下除去上清液，以避免移位细胞核沉淀。

6. 具有主题标签寡核苷酸（HTO）和多路复用的核条形码

注意:根据Gaublomme等人先前在皮质组织中的应用，修改并优化了HTO染色步骤，以对非常少量的（神经节）细胞核进行核标记。

  1. 向细胞核沉淀中加入50μLST-SB缓冲液，轻轻移液8-10次，直到细胞核完全重悬。
  2. 每50μLST-SB /核混合物加入5μLFc封闭试剂，并在冰上孵育10分钟。
  3. 每管ST-SB /核混合物加入1μL（0.5μg）单核标签抗体，并在冰上孵育30分钟。
    注意:较短的孵育时间导致标签标记的效率降低，如代表性结果所示。
  4. 向每个试管中加入100μLST-SB。 不要混合。
  5. 在4°C下离心细胞核悬浮液5分钟，600× g 。
  6. 除去145μL上清液而不破坏细胞核沉淀。
  7. 重复步骤 6.4 和 6.5。在不接触管底部的情况下尽可能去除上清液，以避免移位细胞核沉淀。
  8. 将细胞核沉淀重悬于50μLST-SB中，并轻轻混合细胞核。
  9. 取5μL细胞核悬浮液，并将其与5μL0.4%台盼蓝混合，在显微镜下计数细胞核。参见 图3A ，了解与台盼蓝混合并装入血细胞计数器的细胞核的代表性图像。
  10. 在4°C下以600× g 离心细胞核悬浮液5分钟。
  11. 根据相应的细胞核计数，将细胞核重悬于ST-SB中，使每个样品的目标细胞核浓度达到1，000-3，000个细胞核/μL。
  12. 将样品池化以达到所需的细胞数。
    注意:例如，在该实验中，将8个样品平均合并以达到总共25，000个细胞核，然后立即进入10x基因组学铬和snRNA-seq。当从12至16周龄的小鼠中分离神经节时，细胞核计数通常在6，000-40，000个细胞的范围内。只有大约一半的总上样核可以通过基于液滴的snRNA-seq捕获。例如，制备了25，000个细胞核混合物以确保捕获10，000个细胞核，这是进一步文库制备和测序所必需的。

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结果

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单核cDNA文库制备和snRNA-seq的质量控制分析
代表性结果描述了单个池中10，000个捕获的细胞核的测序结果，该池具有25，000次读取/细胞核基因表达库和5，000次读取/核主题标签库。 图3B 显示了用生物分析仪检查的第 一链cDNA，基因表达（GEX）文库和HTO文库的质量控制结果。HTO衍生的cDNA预计小于180 bp，而mRNA衍生的cDNA大于300 bp。高质量GEX库可以被检测为从300到1，000 bp的宽峰，HTO库被检测为194 bp的特定峰值。Seurat R包19 随后用于质量控制和下游分析。

通过使用Seurat内置的解复用策略鉴定HTO来执行snRNA-seq数据的解复用。每个HTO的解复用能力首先通过HTO表达文件可视化（补充图S1）。在 图4A的热图中，单链蛋白被检测为具有特定H...

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讨论

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在这里，描述了一个详细的方案，重点是i）解剖成年小鼠上颈椎和星状交感神经节，ii）神经节细胞的分离和冷冻保存，iii）细胞核分离，以及iv）使用HTO标记进行细胞核条形码以进行多重检测和snRNA-seq。

通过该方案，可以使用常用的胰蛋白酶和胶原酶解离单个神经节，从而轻松获得交感神经节细胞。通过补充10%DMSO的FBS中冷冻细胞，也很容易实现分离的神经节细胞的长期保存，其解冻后显示出高质量的恢复。此外，与传统的单细胞RNA测序相比，使用基于液滴的单鼠交感神经节的snRNA-seq结合HTO染色的细胞核条形码具有以下优点:i）样品可以长期保存，直到所有样品都准备好进一步分离细胞核;ii）从多个小尺寸神经节中分离出的高质量细胞核可以合并在一起进行测序，而不会因分离的样品制备而产生批次效应;iii）通过使用细胞核条形码在测序后追溯明显神经节起源的能力;和iv）成本效益，因为只需要单个文库准备。重要的是，所描述的分离和细胞培养方案为小鼠宫颈和星状神经节提供了单一的统一方法，并且可能适用于其他神经节，例如背根神经节和其他物种，例如人神经节。

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢Susan L. Kloet（荷兰莱顿LUMC人类遗传学系）在实验设计和有用讨论方面的帮助。我们感谢Emile J. de Meijer（荷兰莱顿LUMC人类遗传学系）在单核RNA分离和测序文库准备方面的帮助。这项工作得到了荷兰科学研究组织（NWO）的支持[016.196.346 to M.R.M.J.]。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>化学品和试剂
0.25% 胰蛋白酶-EDTA、Thermo Fisher Scientific25200056
0.4% 台盼蓝染料Bio-Rad1450021
抗生素-抗真菌剂Gibco15240096
B-27GibcoA3582801
2 型胶原酶WorthingtonLS004176使用 1,400 U/mL
二甲基亚砜Sigma Aldrich67685
乙醇无水 ≥99.5%VWRVWRC83813.360
胎牛血清（低内毒素）BiowestS1810-500
L-谷氨酰胺Thermo Fisher Scientific25030024
Neurobasal 培养基Gibco21103049
牛血清白蛋白 10%Sigma-AldrichA1595-50ML细胞洗涤缓冲液
DPBS （Ca2+，Mg2+free）Gibco14190-169细胞洗涤缓冲液
氯化镁溶液，1 MSigma-AldrichM1028细胞核裂解缓冲液
Nonidet P40 替代品（非离子去污剂）Sigma-Aldrich74385细胞核裂解缓冲液
无核酸酶水（未经 DEPC 处理）InvitrogenAM9937细胞核裂解缓冲液
保护者 RNase 抑制剂，40 U/µLSigma-Aldrich3335399001细胞核裂解缓冲液
氯化钠溶液，5 MSigma-Aldrich59222C细胞核裂解缓冲液
Trizma 盐酸盐溶液，1 M，pH 7.4Sigma-AldrichT2194细胞核裂解缓冲液
血清白蛋白 10%Sigma-AldrichA1595-50ML细胞核洗涤
DPBS （Ca2+，Mg2+free）Gibco14190-169细胞核洗涤
保护剂 RNase 抑制剂，40 U/µLSigma-Aldrich3335399001细胞核洗涤
血清白蛋白 10%Sigma-AldrichA1595-50MLST 染色缓冲液 （ST-SB）
氯化钙溶液，1 MSigma-Aldrich21115-100 MLST 染色缓冲液 （ST-SB）
氯化镁溶液，1 MSigma-AldrichM1028ST 染色缓冲液 （ST-SB）
无核酸酶的水（非 DEPC）处理过）InvitrogenAM9937ST 染色缓冲液 （ST-SB）
氯化钠溶液，5MSigma-Aldrich59222CST 染色缓冲液 （ST-SB）
Trizma 盐酸盐溶液，1M，pH 7.4Sigma-AldrichT2194ST 染色缓冲液 （ST-SB）
Tween-20Merck Millipore822184ST 染色缓冲液 （ST-SB）
TotalSeq-A0451 抗核孔复合蛋白 Hashtag 1 抗体Biolegend682205Hashtag 抗体
TotalSeq-A0452 抗核孔复合蛋白 Hashtag 2 抗体Biolegend682207Hashtag 抗体
TotalSeq-A0453 抗核孔复合蛋白 Hashtag 3 抗体Biolegend682209Hashtag 抗体
TotalSeq-A0461 抗核孔复合蛋白 Hashtag 11 抗体Biolegend682225Hashtag 抗体
TotalSeq-A0462 抗核孔复合蛋白 Hashtag 12 抗体Biolegend682227Hashtag 抗体
TotalSeq-A0463 抗核孔复合蛋白 Hashtag 13 抗体Biolegend682229Hashtag 抗体
TotalSeq-A0464 抗核孔复合蛋白 Hashtag 14 抗体Biolegend682231Hashtag 抗体
TotalSeq-A0465 抗核孔复合蛋白 Hashtag 15 抗体Biolegend682233Hashtag 抗体
TruStain FcX （human）Biolegend422302FC 受体阻断液
<强>设备及耗材
明线 血细胞计数器MerckZ359629-1EA
离心机 5702/R A-4-38Eppendorf 
CoolCell LX 细胞冷冻容器康宁CLS432003-1EA
冷冻管Thermo Scientific479-6840
DNA LoBind 0.5 mL Eppendorf 管EppendorfEP0030108035-250EA
Eppendorf Safe-Lock 管 1.5 mLEppendorf30121872
Falcon 35 mm 非 TC 处理培养皿Corning
Falcon 15 mL锥形离心管Fisher scientific10773501
镊子 Dumont #5精细科学工具11252-40
硬化精细剪刀精细科学工具14091-09
 冰盘，矩形 4 L 橙色康宁CLS432106-1EA
徕卡 MS5徕卡显微镜
Moria MC50 剪刀精细科学工具15370-50
Noyes 弹簧剪刀精细科学工具15012-12
奥林巴斯 CK2 ULWCD奥林巴斯显微镜
P10吉尔森F144802
P1000GilsonF123602
P200GilsonF123601
预分离过滤器（30 µm）Miltenyi biotecMiltenyi biotec130-041-407
摇水浴GFL1083
硅胶板RubberBV3530解剖板
软件及软件包
Cell rangerV4.0.0
R编程V4.1.1
R sudioV1.3.1073
修拉V4.0
tydiverseV1.3.1
Animals
B6.Cg-Tg（Wnt1-cre）2Sor/J 小鼠杰克逊实验室JAX 原液 #022501
B6.129（Cg）-Gt（ROSA）26Sortm4（ACTB-tdTomato，-EGFP）罗/J 小鼠杰克逊实验室JAX 原液 #007576
C57BL/6J 小鼠Charles River
数据分析代码
牛液 液牛EP022629905351008https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE

参考文献

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