本方案详细描述了单细胞核测序的低起始量样本制备流程，包括小鼠颈上神经节和星状神经节的解剖、细胞解离、冷冻保存、细胞核分离以及标签条形码标记。
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本文内容
摘要
摘要
心脏自主神经系统在调控心脏功能（如心率和心肌收缩力）方面起着关键作用，可分为交感神经和副交感神经两个分支。正常情况下，这两个分支之间保持平衡，以维持内环境稳定。然而，心肌梗死、心力衰竭和高血压等心脏疾病状态可诱导参与心脏神经支配的细胞发生重构，这种重构与不良的临床预后相关。
尽管关于心脏自主神经系统的组织学结构和功能已有大量数据，但其在健康和疾病状态下的分子生物学结构在许多方面仍不明确。单细胞RNA测序（scRNA-seq）等新技术有望实现对组织在单细胞分辨率水平上的遗传学表征。然而，神经元相对较大的体积可能阻碍这些技术的标准化应用。本文介绍了一种基于液滴的单细胞核RNA测序（snRNA-seq）方法，用于解析健康和疾病状态下心脏交感神经元的生物学结构。本方案逐步展示了如何对成年小鼠双侧颈上神经节（SCG）和星状神经节（StG）进行分离，并开展snRNA-seq分析。
该方法可实现样本的长期保存，在无法于短时间内一次性收集多个个体/实验的样本时，仍能维持足够的RNA质量。使用标签寡核苷酸（HTOs）对细胞核进行条形码标记，可在测序后实现多重样本的解离与各个神经节样本的溯源。后续分析表明，已成功捕获交感神经节中的神经元、卫星胶质细胞和内皮细胞的细胞核，并通过单核RNA测序（snRNA-seq）加以验证。总之，本方案提供了针对心脏外源性交感神经节进行单核RNA测序（snRNA-seq）的分步操作流程，该方法有望广泛应用于其他器官和组织神经支配研究中。
引言
自主神经系统（ANS）是周围神经系统的关键组成部分，负责维持机体的内环境稳态，包括对环境变化和病理状态的适应1。它参与调控全身多个器官系统，如心血管系统、呼吸系统、消化系统和内分泌系统。自主神经系统分为交感神经和副交感神经两个分支。交感神经系统的脊髓分支在位于椎旁双侧的交感干神经节内形成突触。双侧的颈段和胸段神经节，尤其是星状神经节（StG），是心脏交感神经支配的重要组成部分。在疾病状态下，例如心肌缺血时，可发生神经重塑，导致交感神经过度激活2。这种神经重塑已在人类以及多种其他动物物种的多项组织学研究中得到证实3,4,5,6。目前尚缺乏对心肌缺血诱导的心脏交感神经节内神经重塑的详细生物学特征描述，且在健康与疾病状态下，心脏交感神经系统（SNS）内特化神经元细胞类型或亚型的基本生物学特性也尚未完全明确7。
新型技术（如单细胞RNA测序，scRNA-seq）为在单细胞水平上对微小组织进行遗传学表征开辟了途径8,
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方案
本方案描述了小鼠颈段和/或颈胸段（星状）神经节进行单核RNA测序（snRNA-seq）所需的全部步骤。实验使用了雌性和雄性C57BL/6J小鼠（15周龄，每种性别n = 2）。另使用一只Wnt1-Cre;mT/mG小鼠以可视化神经节，辅助解剖操作17,18。该小鼠由B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J小鼠与B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J小鼠杂交获得。所有动物实验均依照美国国立卫生研究院（NIH）发布的《实验动物护理与使用指南》进行，并经荷兰莱顿大学动物伦理委员会批准（许可证编号AVD1160020185325，莱顿，荷兰）。有关本方案中使用的所有材料、设备、软件和动物的详细信息，请参见材料表。
1. 准备工作
注意：所有步骤均在细胞培养超净工作台中进行。
- 将镊子和剪刀浸入70%乙醇中20分钟，进行清洁。
- 制备神经节培养基：在Neurobasal培养基中添加B-27 Plus（1倍浓度）、L-谷氨酰胺（2 mM）和1%抗生素-抗真菌剂。将神经节培养基于室温预温。
- 制备消化液：在神经节培养基中....
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结果
单核cDNA文库构建与单核RNA测序的质量控制分析
代表性结果描述了单个混合样本中10,000个捕获细胞核的测序数据，其中基因表达文库深度为25,000 reads/细胞核，标签序列文库深度为5,000 reads/细胞核。 图3B 展示了1的质控结果st 链cDNA、基因表达（GEX）文库和HTO文库，并使用Bioanalyzer进行检测。HTO来源的cDNA预期小于180 bp，而mRNA来源的cDNA则大于300 bp。高质量的GEX文库在300至1,000 bp范围内呈现一个宽峰，HTO文库则在194 bp处显示一个特异性峰。默认使用Cell Ranger进行样本去混样、fastq文件生成及序列比对。Seurat R软件包19 随后用于质量控制和下游分析。
使用 Seurat 内置的去多重化策略通过识别 HTO 来对 snRNA-seq 数据进行去多重化。首先通过 HTO 表达文件可视化每种 HTO 的去.......
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讨论
本文详细描述了一种实验方案，重点包括：i）成年小鼠颈上神经节和星状神经节的分离，ii）神经节细胞的分离与冷冻保存，iii）细胞核的提取，以及 iv）利用HTO标记对细胞核进行条形码标记，以实现多重检测和单核RNA测序（snRNA-seq）。
通过本方案，可利用常用的胰蛋白酶和胶原酶消化单个神经节，从而轻松获得交感神经节细胞。通过在添加10% DMSO的胎牛血清（FBS）中冷冻保存分离的节细胞，也可实现细胞的长期保存，并在解冻后表现出较高的复苏质量。此外，与传统的单细胞RNA测序相比，采用基于液滴的单细胞核RNA测序（snRNA-seq）结合HTO染色介导的细胞核条形码技术对单个小鼠交感神经节进行分析具有以下优势：i）样本可在所有样本收集完毕前长期保存，直至进行后续细胞核分离；ii）来自多个小型神经节的高质量细胞核可合并进行测序，避免因分批制备样本而引入批次效应；iii）利用细胞核条形码可在测序后追溯各个神经节的明确来源；iv）具有成本效益，仅需进行一次文库构建。重要的是，所述的分离与细胞培养方案为小鼠颈上神经节和星状神经节提供了一种统一的标准化方法，且该方法可能适用于其他神经节（如.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢 Susan L. Kloet（荷兰莱顿莱顿大学医学中心人类遗传学系）在实验设计和有益讨论方面提供的帮助。感谢 Emile J. de Meijer（荷兰莱顿莱顿大学医学中心人类遗传学系）在单细胞核 RNA 分离及测序文库制备方面提供的协助。本工作由荷兰科学研究组织（NWO）[项目编号 016.196.346，资助对象 M.R.M.J.] 资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>化学品与试剂 | |||
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | 赛默飞世尔科技 | 25200056 | |
| 0.4% 台盼蓝染料 | 伯乐（Bio-Rad） | 1450021 | |
| 抗生素-抗真菌剂 | Gibco | 15240096 | |
| B-27 | Gibco | A3582801 | |
| 胶原酶 II 型 | 沃辛顿 | LS004176 | 使用 1,400 U/mL |
| 二甲基亚砜 | Sigma Aldrich | 67685 | |
| 乙醇，绝对 ≥99.5% | VWR | VWRC83813.360 | |
| 胎牛血清（低内毒素） | Biowest | S1810-500 | |
| L-谷氨酰胺 | 赛默飞世尔科技 | 25030024 | |
| Neurobasal 培养基 | Gibco | 21103049 | |
| 10% 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | 细胞洗涤缓冲液 |
| DPBS（Ca）2+，Mg2+无（游离） | Gibco | 14190-169 | 细胞洗涤缓冲液 |
| 1 M 氯化镁溶液 | Sigma-Aldrich | M1028 | 细胞核裂解缓冲液 |
| Nonidet P40 替代品（非离子去垢剂） | Sigma-Aldrich | 74385 | 细胞核裂解缓冲液 |
| 无核酸酶水（非DEPC处理） | Invitrogen | AM9937 | 细胞核裂解缓冲液 |
| Protector RNase 抑制剂，40 U/μLµL | Sigma-Aldrich | 3335399001 | 细胞核裂解缓冲液 |
| 5 M 氯化钠溶液 | Sigma-Aldrich | 59222C | 细胞核裂解缓冲液 |
| Trizma 盐酸盐溶液，1 M，pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | 细胞核裂解缓冲液 |
| 10% 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | 细胞核洗涤 |
| DPBS（Ca）2+，Mg2+无（游离） | Gibco | 14190-169 | 细胞核洗涤 |
| Protector RNase 抑制剂，40 U/μLµL | Sigma-Aldrich | 3335399001 | 细胞核洗涤 |
| 10% 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | ST染色缓冲液（ST-SB） |
| 1 M 氯化钙溶液 | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | ST染色缓冲液（ST-SB） |
| 1 M 氯化镁溶液 | Sigma-Aldrich | M1028 | ST染色缓冲液（ST-SB） |
| 无核酸酶水（非DEPC处理） | Invitrogen | AM9937 | ST染色缓冲液（ST-SB） |
| 5M 氯化钠溶液 | Sigma-Aldrich | 59222C | ST染色缓冲液（ST-SB） |
| Trizma 盐酸盐溶液，1 M，pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | ST染色缓冲液（ST-SB） |
| Tween-20 | 默克密理博 | 822184 | ST染色缓冲液（ST-SB） |
| TotalSeq-A0451 抗核孔复合体蛋白条形码1抗体 | Biolegend | 682205 | #抗体 |
| TotalSeq-A0452 抗核孔复合体蛋白标签2抗体 | Biolegend | 682207 | 抗体 |
| TotalSeq-A0453 抗核孔复合体蛋白Hashtag 3抗体 | Biolegend | 682209 | 抗体标记 |
| TotalSeq-A0461 抗核孔复合体蛋白条形码11抗体 | Biolegend | 682225 | #抗体 |
| TotalSeq-A0462 抗核孔复合体蛋白标签12抗体 | Biolegend | 682227 | 抗体标记 |
| TotalSeq-A0463 抗核孔复合体蛋白条形码13抗体 | Biolegend | 682229 | 抗体标记 |
| TotalSeq-A0464 抗核孔复合体蛋白条形码14抗体 | Biolegend | 682231 | 抗体标记 |
| TotalSeq-A0465 抗核孔复合体蛋白条形码15抗体 | Biolegend | 682233 | #抗体 |
| TruStain FcX（人源） | Biolegend | 422302 | Fc受体封闭液 |
| <强>仪器与耗材 | |||
| 亮线 血细胞计数板 | 默克 | Z359629-1EA | |
| Centrifuge 5702/R A-4-38 | Eppendorf | EP022629905 | |
| CoolCell LX 细胞冻存容器 | 康宁 | CLS432003-1EA | |
| 冻存管 | 赛默飞世尔科技 | 479-6840 | |
| DNA LoBind 0.5 mL Eppendorf管 | Eppendorf | EP0030108035-250EA | |
| Eppendorf Safe-Lock 离心管 1.5 mL | Eppendorf | 30121872 | |
| Falcon 35 mm 未经TC处理的培养皿 | 康宁 | 351008 | |
| Falcon 15 mL 圆锥形离心管 | Fisher Scientific | 10773501 | |
| Dumont #5 镊子 | 精细科学工具 | 11252-40 | |
| 硬化精细剪刀 | 精细科学工具 | 14091-09 | |
| 冰盘，矩形，4 L，橙色 | 康宁 | CLS432106-1EA | |
| Leica MS5 | Leica | 显微镜 | |
| Moria MC50 剪刀 | 精细科学工具 | 15370-50 | |
| 诺伊斯弹簧剪 | 精细科学工具 | 15012-12 | |
| 奥林巴斯 CK2 ULWCD | Olympus | 显微镜 | |
| P10 | Gilson | F144802 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| P200 | Gilson | F123601 | |
| 预分离滤器（30 µm) | Miltenyi Biotec | Miltenyi Biotec 130-041-407 | |
| 摇床水浴箱 | GFL | 1083 | |
| 硅片 | 橡胶BV | 3530 | 解剖板 |
| <强>软件和程序包 | |||
| 细胞游走器 | V4.0.0 | ||
| R 编程 | V4.1.1 | ||
| R Studio | V1.3.1073 | ||
| Seurat | V4.0 | ||
| tydiverse | V1.3.1 | ||
| <强>动物 | |||
| B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J 小鼠 | 杰克逊实验室 | JAX 货号 #022501 | |
| B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J 小鼠 | 杰克逊实验室 | JAX 货号 #007576 | |
| C57BL/6J 小鼠 | 查尔斯河实验室 | ||
| <强>数据分析代码 | |||
| https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE |
参考文献
- McCorry, L. K. Physiology of the autonomic nervous system. American Journal of Pharmaceutical Education. 71 (4), 78(2007).
- Li, C. -Y., Li, Y. -G. Cardiac sympathetic nerve sprouting and susceptibility to ventricula....
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