低成本氧气显微镜辅助的多细胞球体生物制造

摘要

本方案描述了利用标准荧光显微镜对球状体的氧合状态和细胞死亡进行多参数分析，从而实现用于生物打印的高通量球状体制备。该方法可用于控制球状体的活力并实现标准化，这对于构建三维组织、肿瘤微环境以及成功进行（微）组织生物制造具有重要意义。

摘要

多细胞球体是研究三维组织和癌症生理学的重要工具，也常被用作组织工程中生物制造的组织组装单元。尽管球体模型的主要优势在于模拟组织微尺度下的理化梯度，但球体内部真实的生理环境（包括代谢活性、氧合、细胞死亡和增殖的动态变化）通常被忽视。与此同时，培养基成分和成球方法对最终球体表型的影响已有充分报道。因此，为确保研究结果的可重复性和透明度，有必要对球体表型进行表征和标准化。对球体平均氧合水平及氧分压（O₂）₂ 三维（3D）梯度可作为一种简单且通用的类球体表型表征方法，能够反映其代谢活性、整体存活能力以及再现潜能 体内 组织微环境。3D 氧合状态的可视化可轻松结合其他生理参数的多参数分析（如细胞死亡、增殖和细胞组成），并可用于连续氧合监测和/或终点测量。O 的加载₂ 在类球体形成阶段进行探针检测，可与多种类球体生成方案兼容。该方案包含一种高通量类球体生成方法，并引入了发射红色和近红外光的比率型荧光氧探针₂ 纳米传感器以及生物打印前后类球体氧合状态和细胞死亡的多参数评估描述。实验示例展示了对比的 O₂ 同质和异质细胞球体以及基于球体的生物打印结构中的梯度分析。该方案适用于配备多种荧光滤光片和发光二极管光源的常规荧光显微镜。

引言

分子氧（O₂）₂) 是调控细胞和组织存活、功能及死亡的关键代谢物之一。在生理条件下，局部组织的氧合状态由组织血管化、血流和细胞代谢动态调节，在某些情况下可导致 O₂ 梯度、缺氧微环境和/或氧化应激^1,2细胞感知 O₂ 通过分子O的直接参与形成梯度₂ 在信号功能中（通过 缺氧诱导因子（HIF）介导的信号通路、组蛋白赖氨酸去甲基化酶 KDM 以及其他途径），细胞氧化还原电位的变化（活性氧₂ 通过Nrf2/Keap1信号通路或铁调节蛋白感应物种，并随之调节其代谢、增殖、干性和分化³因此，细胞和组织氧合的异质性、氧梯度及其相关现象在组织发育和稳态维持中发挥着重要作用。不同组织和细胞类型通常需要不同的“正常”生理氧浓度₂ 水平，用于定义 具有按组织氧含量定位细胞的特殊组织结构₂ 微梯度⁴某些细胞类型对 O₂ 减少（例如神经元、肝细胞、胰岛细胞或肌细胞）^5,6，而其他一些生物则能耐受极端缺氧环境并形成陡峭的氧梯度₂ 梯度（例如，在肠道和结肠上皮中）⁷随着组织生物工程和生物制造技术的进步，O₂ 微聚集体和球形三维组织构建体中的定量分析变得愈发重要。其中一个关注点是多细胞球体模型生理参数的标准化，这些参数依赖于球体生成方法和培养条件⁸此外，未受控地施用O₂ 释放生物材料或O₂ 缺乏功能性血管化的微组织中，灌注可能对细胞产生毒性作用，导致其代谢重编程，并降低移植后的存活率^9,10. O 的可信度₂ 通过多能干细胞来源的肝类球体作为示例，利用数学建模方法，最近已证实测量手段及氧合环境的优化可实现生理相关微聚集体的高效培养¹¹. 另一个需要了解组织氧合水平的领域₂ 癌症治疗中已认识到的水平^12,13肿瘤缺氧的异质性可能影响抗癌治疗的效果。在患者治疗期间或构建肿瘤缺氧模型时，精确测量和调控氧合水平，有助于优化个体化和精准化的治疗策略。¹⁴因此，对生物制造结构和三维肿瘤模型中动态氧合状态进行定量监测，是生理学分析其呼吸活性、代谢过程，以及优化组织培养、制备条件或缺氧介导治疗反应基础研究的重要工具。

多种方法可用于类球体和微聚集体组织构建物中细胞氧合状态的多重（或多参数）分析。该技术最初在神经球和肿瘤类球体中建立。^15,16,17基于磷光寿命成像显微技术（PLIM）的方法能够直接定量活体微组织中的细胞氧合状态，并建立其与细胞活力、增殖或功能细胞类型分布之间的关联。尽管该方法具有强大优势，但即便在主流显微镜供应商中，PLIM显微镜的升级配置仍未得到广泛普及。^18,19幸运的是，已有相当数量的细胞穿透性O₂敏感的纳米粒子探针也可用于基于荧光强度的比率测量模式^{15,17,20,21,22,23,24}通常，探针会显示两个发射波长，即 O₂-敏感与非敏感（对照）样本，可在荧光显微镜、高内涵筛选成像系统或微孔板读板仪上进行检测。此类 O₂-传感纳米颗粒可通过沉淀技术与生物相容性聚合物O制备₂-传感以及覆盖可见光和近红外光谱的参考染料，或可直接购买商用产品^2,25由于对较厚的三维微组织进行分析时可受益于红移荧光染料的使用，因此采用比率型O₂-传感纳米粒子探针多模态红外编号1（MMIR1），由O组成₂-传感型 PtTPTBPF²⁶ 以及参照 aza-BODIPY²⁷ 将染料浸渍于带正电荷的甲基丙烯酸酯类共聚物中构建而成²⁸采用这种设计，一个O₂-敏感信号（近红外，激发（exc.）= 635 nm，发射（em.）= 760 nm；I_感觉) 受 [O₂浓度 通过 磷光猝灭过程，而红色参比染料的强度（激发 = 580 nm，发射 = 650 nm；I_参考文献）保持不变（图1A因此， 我_参考文献 / I_感觉 染色细胞中的比率（R）可用于实现 O₂ 校准²².

本文介绍了一种用于监测类球体及生物打印结构中活细胞氧合状态的半定量方法，有助于在终点和动力学测量中估算 O₂ 梯度。此类 O₂ 成像可结合其他类型的比率型 O₂ 探针进行（图1B），并可根据可用光源和荧光滤光片的数量，与其他染料联用，以获取有关活/死细胞、线粒体功能及其他细胞类型的示踪信息。也可采用荧光寿命成像显微技术（FLIM）等高级测量模式¹⁹。使用细胞染色染料和 O₂ 敏感性纳米颗粒时最大的挑战在于染色方案的优化。对于 MMIR1 探针及相关纳米颗粒，可在类球体形成过程中对细胞进行预染色或共孵育。在本方案中，O₂ 探针染色的类球体是在低黏附性琼脂糖表面生成的^29,30,31,32（图1C），该方法便于后续基于类球体的生物打印，并实现对 O₂ 水平和细胞死亡的多参数分析。为展示该方法的适用性，利用常规荧光显微镜比较了同源或异源细胞（通过添加人脐静脉内皮细胞 HUVEC 构建）的人牙髓干细胞（hDPSC）类球体在生物打印前后的氧合水平。

方案

1. 高通量生成含O的类球体₂-敏感探针

1. 制备微图案化琼脂糖包被的组织培养板
   注意：微图案化琼脂糖包被的组织培养板用于同时生成大量球状体（每块PDMS印章可生成1585个，见 材料表用于生物打印及其他需要多个实验重复或大量类球体的应用。
   1. 尽可能通过高压灭菌法对所有无菌材料和器械（刮刀和镊子）进行灭菌处理，或采用过滤除菌法。清洁可重复使用的PDMS印章³³ 从琼脂糖中取出并在70%乙醇中无菌保存。此步骤需在类球体生成前至少1天完成。
   2. 将微图案化PDMS印章从储存瓶转移至无菌培养皿中，在无菌层流条件下光滑面朝上晾干10分钟。
   3. 将每个印章的微图案面朝上（光滑面朝下）置于12孔无菌组织培养板各孔中央，敞盖晾干1-2分钟。
      注意：必须将多余的液体完全蒸发，因为只有干燥的印模才能牢固地粘附在塑料表面，并在操作过程中保持附着。
   4. 称取1.5 g琼脂糖至一个洁净的200 mL玻璃瓶中，加入50 mL无菌蒸馏水，盖上瓶盖，放入微波炉中加热熔化，制成50 mL 3%的均一琼脂糖溶液。
      警告：琼脂糖溶液温度极高，操作时需格外小心。熔化后若立即晃动，热的琼脂糖溶液可能产生气泡并喷溅出容器。为避免意外烫伤，请使用足够大的容器，并且琼脂糖溶液的体积不得超过容器容量的50%。
   5. 使用无菌刻度移液管，立即向12孔细胞培养板的每个孔中加入约2 mL热琼脂糖溶液，以完全覆盖插入的PDMS印章。将培养板盖打开，置于无菌气流下孵育20分钟，使琼脂糖凝固。
      注意：琼脂糖层的厚度应至少为PDMS印章厚度的两倍，以确保在移除PDMS印章后琼脂糖微孔结构的完整性图1C).
   6. 使用无菌的小刮铲，将每个孔中嵌有PDMS印章的琼脂糖凝胶小心翻转，使光滑的印章表面朝上。在印章光滑的上表面加入约200 µL无菌水，用刮铲轻轻将印章从琼脂糖上剥离，并从孔中取出。注意避免损坏微孔。
   7. 向琼脂糖印章中加入1 mL相应的无菌细胞培养基以直接使用。盖上培养皿盖，在4 °C下孵育过夜。长期保存时（可在4 °C下保存长达2周）使用PBS溶液（而非培养基）。切勿让琼脂糖干燥。使用前，将琼脂糖微图案化培养皿在CO₂培养箱中于37 °C预热1小时。₂ 培养箱
      注意：需要孵育以平衡琼脂糖微孔并去除其中的气泡。继续进行方案步骤 1.2。
2. 制备O₂ 探针负载的球状体
   1. 使用添加10%胎牛血清（FBS）的α-最低必需培养基（MEM）培养hDPSC细胞系，使用添加生长因子的内皮细胞生长培养基2（endothelial cell growth medium 2）培养HUVEC细胞系。通过将HUVEC和hDPSC的培养基按1:1比例混合，制备hDPSC/HUVEC异细胞球体生长培养基。
   2. 准备70%-90%汇合度的细胞培养物（约培养3-4天）。为生成异细胞类球体，分别准备人牙髓干细胞（hDPSC）和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）培养物。
      注意：HUVEC 和 hDPSC 的传代次数不得超过 8 代。为确保细胞培养物快速生长，应每隔 3 至 4 天使用新的培养瓶，当细胞融合度达到 70%–80% 时，按总培养细胞量的 1/3 进行传代。
   3. 用预热（37 °C）的 PBS 洗涤 70%–90% 汇合度的细胞培养物（每 75 cm² 加 10 mL）² 烧瓶）。加入消化酶溶液（0.05% 胰蛋白酶和 1 mM EDTA；每 75 cm² 加 1 mL）² 烧瓶）并在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 3–5 分钟₂，95% 湿度条件下孵育以促进细胞脱落，并在显微镜下观察细胞脱落情况。一旦完成，使用含 10% FBS 的完全细胞培养基（每 1 mL 解离液加入 5 mL 培养基）中和胰蛋白酶。
      注意：避免细胞过度暴露于解离酶溶液中，以免影响其活力。
   4. 对于在低FBS培养基中培养的HUVEC，通过向经胰蛋白酶处理的细胞培养物中加入0.5 mL 100% FBS进行胰蛋白酶中和，随后离心，将细胞转移至其生长培养基中。
      注意：所得细胞悬液应含有约 100 万个细胞/1 mL。如有需要，可在方案中增加一次离心步骤，以浓缩细胞悬液。
   5. 使用10 mL血清移液管顶部连接1000 µL移液器吸头，通过吹打分散细胞团块，获得单细胞悬液。采用计数室（如血球计数板或同类替代产品）对每1 mL细胞悬液中的细胞数量进行计数³⁴将细胞悬液稀释至每毫升500,000个细胞。对于1:1比例的异细胞hDPSC/HUVEC球形体，取等体积对应的细胞悬液混合，使最终细胞浓度为每毫升500,000个细胞。
      注意：通过调整加入微图案化琼脂糖印章的细胞悬液浓度，可改变所生成球体的平均大小，球体大小取决于琼脂糖印章中每个微孔的细胞数量。在所述实验条件下，将含有500,000个细胞的1 mL悬液加入具有1585个微孔的琼脂糖印章，可生成约含300个细胞的球体。
   6. 加入浓O₂ 将探针（纳米颗粒，1 mg/mL 储液）溶液加入制备好的细胞悬液中，使其终浓度为 5 µg/mL。
      注意：在存在 O 的情况下进行球状体形成₂-传感纳米颗粒可实现高效染色，且染色效果至少可维持5天（图1D相比之下，对预先形成的多细胞球体进行纳米颗粒染色的效率较低¹⁵.
   7. 在12孔琼脂糖包被的细胞培养板的微图形化孔中（参见步骤1.1.7），将1 mL旧培养基更换为1 mL制备好的细胞悬液（每1 mL含500,000个细胞，含5 µg/mL O₂ 探针）。在CO₂培养箱中培养类球体₂ 在持续存在 O 的条件下，在培养箱中孵育 2–5 天₂ 探针用于确保其在球体形成和压缩过程中的加载情况。
      注意：在球体培养过程中避免培养基过度蒸发。如有需要，小心地（切勿扰动微孔中的球体）加入 0.2–0.5 mL 含额外 O 的培养基₂ 探针稀释
   8. 类球体形成后，将培养基更换为不含探针的新鲜培养基。所生成的类球体中的探针染色可保留7-14天或更长时间，从而实现对类球体中探针信号的长期监测。

2. 类球体生物打印

注意：类球体使用基于甲基丙烯酰胺修饰的明胶（GelMA）生物墨水进行生物打印。以下是生物墨水成分、生物墨水制备步骤以及生物打印过程的说明。

1. 生物墨水制备
   1. 在超净工作台中，配制2 mL 10% (w/v) GelMA溶液于培养基中³⁵ 如下所述：在15 mL离心管中称取0.2 g取代度为78的无菌GelMA，加入1.9 mL α-MEM，于37 °C在旋转摇床上混合溶解（约2 h）。
      注意：不要加入全部培养基，因为后续还需添加类球体和光引发剂 Li-TPO-L 等其他成分。
   2. 用移液器吹打将类球体从微图案化孔中重悬，并收集至15 mL离心管中。用PBS进行额外冲洗，以确保从琼脂糖微孔中收集全部类球体。避免触碰或损伤琼脂糖微孔，以免琼脂糖碎片在生物打印过程中堵塞针头。
   3. 在15 mL离心管中通过离心收集球状体，离心条件为300 x g 在20 °C下孵育5分钟。用移液器吸去上清液，向类球体中加入50 µL培养基，并通过轻柔吹打重悬。
   4. 将类球体混合物加入温热的 GelMA 溶液中，通过轻柔吹打混匀。用于生物打印的生物墨水中的类球体浓度应维持在每毫升 6340–12860 个类球体（来自 4–8 个微图案）。避免使用过高的类球体浓度，因其容易导致打印针头堵塞。
   5. 加入过滤除菌的光引发剂 Li-TPO-L 储存液（32 mg/mL），使其终浓度为双键数量的 2 mol%，并用移液器轻轻吹打混匀^36,37.
      注意：Li-TPO-L 的用量可根据以下公式计算：
      光引发剂（PI）体积 = （0.000385 mol NH₂-（GelMA 质量 / 294.10 g Li-TPO-L / mol × 0.78 × 0.02）/（0.032 g Li-TPO-L / mL × 0.2 g GelMA）= 0.0107 mL Li-TPO-L 储液
2. 生物打印流程
   1. 参见以下步骤 补充方案 1 用于在CAD中设计支架。要进行生物打印，请遵循以下步骤。
   2. 用无菌的3 cc卡式管，以针帽（鲁尔锁）封闭管口，通过移液将生物墨水注入管中。将推杆插入卡式管内。将卡式管倒置，取下针帽，推动推杆向生物墨水方向，直至完全排出管内空气。
      注意：避免 GelMA 生物墨水与 cartridge 侧壁接触，因为生物墨水发生凝胶化可能导致推杆运动受阻。
   3. 让生物墨水在生物打印机加热套中冷却至23 °C（20–30 分钟）。在墨盒顶部旋紧压力适配器。关闭进样管上的夹子，防止生物墨水泄漏，然后在墨盒上安装22 G锥形聚乙烯针头。根据支架设计以及类球体的直径和浓度调整针头尺寸和直径。
      注意：佩戴口罩并喷洒手套以防止污染。
   4. 用70%乙醇喷洒生物打印机，并用吸水纸擦干。将 cartridge 安装至挤出式打印头的加热套中。堵住压力入口，并打开入口处的夹子。将设计的G代码文件载入打印软件。
   5. 开始测量针头长度。通过在无菌培养皿中挤出少量生物墨水来调节打印压力。对于基于GelMA的生物墨水，打印压力通常为0.025–0.045 MPa。³⁸.
   6. 安装6孔板，打开孔板，关闭生物安全柜，开始打印。打印完成后，将支架在5 °C下物理交联10分钟，并使用紫外LED灯（365 nm；500 mW，根据制造商说明）照射打印的支架60秒。
      注意：紫外光交联时间取决于紫外光源的特性、光引发剂的类型和浓度、所需的支架交联程度、溶胀性以及弹性模量。
   7. 立即向所有含有生物打印网格的孔中加入相应的生长培养基，培养基中需含有100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素（P/S）（每孔2 mL，使用6孔细胞培养板）。
   8. 37 °C CO₂培养箱中培养₂ 将样品置于培养箱中，直至开始显微成像。对于生物打印结构的显微观察，将打印好的华夫格阵列转移至显微成像培养皿中，加入成像培养基，然后按照步骤3.2和3.3进行操作。
      注意：对于悬浮的生物打印结构，需将其固定在显微镜培养皿中，同时不影响细胞活性，例如使用细胞相容性胶水。若使用倒置显微镜进行观察，应将生物打印结构直接打印至底部为玻璃的显微镜培养皿中，并加入成像培养基（约200–500 µL，成像培养基成分见步骤3.1的注释），以避免样品发生非预期的漂浮。在将生物打印结构转移至显微镜培养皿前，可在细胞培养皿中使用额外的荧光探针进行染色（见步骤3.1.6）。

3. 生物制造组织中类球体氧合状态的比率荧光活体显微成像

注意：为了将 O₂ 探针的比率强度响应（R）转换为实际的缺氧水平，必须使用文献²⁴中描述的方法对探针响应进行校准。然而，由于比率校准依赖于特定仪器，且需要配备温控/ O₂/CO₂ 控制的培养箱（并非总是具备），因此推荐采用半定量的比率检测方法。

1. 用于活体成像分析的类球体准备
   1. 为使类球体在此步骤中能够贴附，请预先用IV型胶原蛋白和/或聚-D-赖氨酸包被无菌显微镜培养皿，或使用市售产品³⁹。检查显微镜培养皿是否与显微镜物镜的工作距离及其他特性兼容。
      注意：对于多参数成像，所有额外染色步骤必须在培养板中进行，且需加入足量培养基以保护细胞免受蒸发、渗透压冲击或其他应激影响。使用前请预先配制并预热成像培养基：DMEM补充碳酸氢钠（1.2 g/L）、HEPES-Na（pH 7.2，10 mM）、丙酮酸钠（1 mM）、L-谷氨酰胺（2 mM）和葡萄糖（5 mM），不含酚红。
   2. 使用1 mL移液器，将预先用O₂-探针染色的类球体从琼脂糖微孔中轻柔冲洗出来。当类球体仍悬浮于培养基中时，将其转移至15 mL锥底离心管中。
   3. 为确保从微图案化孔中完全收集所有类球体，用额外的1 mL培养基冲洗孔1至3次，并将所有类球体悬液合并至同一管中。将管子垂直静置最多10分钟，使类球体沉降至管底形成可见沉淀。
   4. 小心移除离心管中的培养基，避免扰动类球体。将其轻柔重悬于适量新鲜培养基中，确保每份显微镜样品皿中至少含有20个类球体。这将最小化培养基用量，并简化成像过程中类球体的定位。
      注意：使用µ-腔室12孔板的可高压灭菌硅胶部件（见材料表），将其粘附于盖玻片上作为显微镜样品皿（24 × 60 mm，厚度#1），每孔最大培养基体积为300 µL。该培养腔的硅胶部分可灭菌，并可在粘附至培养皿后与任何其他塑料或玻璃表面重复使用。
   5. 立即将等体积的类球体悬液加入每个显微镜培养皿/孔中。将类球体在37 °C、CO₂培养箱中孵育1小时，使其贴附于显微镜培养皿表面。若需结合其他染料进行氧合分析，请继续执行步骤3.1.6；若仅进行简单氧合分析，请继续执行步骤3.1.7。
      注意：孵育时间不足（<1小时）可能导致在换液过程中类球体偶尔脱落或丢失，从而中断实验。同时，孵育时间过长（>3小时）可能导致类球体部分或完全失去其三维结构，因细胞从类球体迁移至显微镜培养皿表面，影响实时氧合状态。
   6. （可选）小心更换为含有荧光探针（稀释至染色浓度）的培养基，并继续孵育1小时以达到最佳染色强度。为避免换液过程中类球体脱落，使用200 µL移液器从显微镜培养皿边缘小心吸出培养基，并从侧面加入新培养基。随后进行步骤3.1.7。
      注意：对于在多细胞聚集体中扩散性较差的探针，可延长负载浓度和/或时间。在正式实验前，应在预实验中确定最佳探针负载参数。
   7. 从显微镜培养皿中移除培养基，并用成像培养基清洗一次。向样品中加入精确体积的成像培养基（例如，12孔培养板中每个µ-腔室300 µL）。继续进行步骤3.2。
2. 图像采集
   1. 成像前30分钟开启显微镜及连接设备（如激发光源、相机、计算机、培养箱及其他电子控制模块），使其预热并达到测量条件平衡（温度、不同O₂浓度、5% CO₂、必要时湿度）。启动与具体显微镜配置配套的显微镜操作软件。
      注意：本方案适用于CellSens Dimension软件v.3。
   2. 为所选荧光（或磷光）探针选择合适的激发（光源、功率）和发射滤光片以及曝光时间。对于多参数、三维及延时显微分析，在显微镜操作软件中编写自动测量序列协议。
   3. 在预实验中经验性确定每种探针、实验模型和细胞系的最佳成像设置。确保设置在参考通道（I_ref）和O₂传感通道（I_sens）中产生最小光漂白，并对强度比值（R = I_ref / I_sens）影响最小，尤其在三维和延时测量实验中。
   4. 将染色后的类球体培养皿置于显微镜载物台上。使用低倍物镜在透射光下预览样品，初步聚焦于类球体并将其定位在图像中心。
      注意：标准4x至10x空气物镜足以用于预聚焦；而对于实际测量，建议使用20x至40x、数值孔径（NA）≥0.6（空气或水浸）且具有足够工作距离以适应贴附于培养皿的类球体的物镜。
   5. 将所需高倍物镜移至工作位置。在透射光模式下聚焦于类球体的中部（赤道）横截面。三维物体中的氧合状态直接依赖于成像截面的深度。为确保一致性，应在组内和组间分析相似的横截面，例如类球体的中部、顶部或底部横截面。
      注意：为详细精确分析和重建O₂梯度，建议使用共聚焦、光片或双光子（最佳选择）显微镜进行扫描并生成Z堆栈图像。对于传统宽场显微镜，由于所有横截面信号将同时被采集，只能通过中部横截面进行平均估计，而非精确分析O₂梯度。此时，中部横截面定义为类球体直径最大且边缘清晰聚焦的焦平面。
   6. 调整设置以采集O₂探针的参考和敏感光谱通道及其他用于多参数成像的荧光探针的荧光/磷光信号。
   7. 为进行基于强度的定量比较，对组内所有测量对象应用相同的成像设置，包括曝光时间、激发光源功率、分辨率、扫描速度和针孔大小。
      注意：许多厂商提供的显微镜软件版本支持自动计算强度比值。在成像软件的实验管理器中编写图像采集程序时，应用“合并”功能处理O₂探针的参考通道和敏感通道的强度测量。
   8. 对O₂探针的参考和敏感光谱通道，以及必要时的其他荧光通道，采集同一光学截面的图像。本方案使用MMIR1探针，其红色参考光谱（激发=580 nm，发射=650 nm）和近红外O₂-敏感光谱（激发=635 nm，发射=760 nm）。
   9. 重复步骤3.2.5–3.2.8，以收集足够数量的数据点用于统计分析。对于药物、线粒体解偶联剂或电子传递链抑制剂及其他快速作用化合物处理后快速变化的细胞反应的动态分析，使用延时测量模式（步骤3.2.10）。
   10. 在成像培养基中、37 °C条件下，对样品进行周期性照明，并采集目标荧光团信号（例如O₂探针的参考和传感通道），例如每10秒采集一次，持续超过2分钟。
   11. 周期性测量完成后，对每个类球体进行一次焦点检查，以确保成像过程中无焦点漂移。如有需要，重复测量。随后进行步骤3.3的数据分析。
       注意：在无细胞刺激和药物添加的情况下，可进行延时测量以评估光稳定性，并与参考染料（如荧光素、钙黄绿素绿AM或四甲基罗丹明甲酯）进行比较。
3. 图像呈现
   注意：此处描述如何使用成像软件中的比值分析功能自动计算类球体中O₂探针的强度比值（R），并应用逐像素R计算生成类球体显微截面的伪彩R分布图像。也可通过应用简单公式R = I_ref/I_sens^24,34，从类球体图像同一感兴趣区域（ROI）的参考和敏感光谱通道强度数据中手动计算R。若无法从原始图像中提取相应显微镜软件的强度数据，可使用ImageJ或Fiji等程序获取强度数据（见讨论）。
   1. 打开以合并模式采集的O₂-探针参考和敏感光谱通道强度数据的.vsi文件。从测量菜单中打开比值分析功能窗口。选择参考通道强度作为R计算的分子，敏感通道强度作为分母。
      注意：也可采用参考与敏感信号的反向比值计算R，但此时R将随O₂增加而减小。
   2. 为每个光谱通道设置相应的强度阈值，以从合并强度图像中扣除背景。持续提高阈值直至图像背景均匀为黑色。在用于比较分析的数据集中，对所有类球体图像统一应用相同的阈值参数。
      注意：使用预览窗口通过观察类球体的初步计算伪彩R图像优化阈值设置。阈值字段中强度低于当前值的所有像素将从R分析中移除并显示为黑色斑点。阈值应用后，仅应显示对应于类球体荧光的区域。独立光谱通道中无类球体区域的平均背景强度的初步估计有助于选择合适的图像阈值。此外，将从相应透射光类球体图像中识别的类球体ROI边界应用于合并荧光图像，有助于准确确定阈值参数，防止过度扣除非背景信号强度。
   3. 将分子和分母强度的背景设置保持为0，因为背景已通过阈值应用扣除。
   4. 调整比值图像的缩放因子（Scale），直至预览图像提供所需的R梯度分辨率。在用于比较分析的数据集中，对所有类球体图像统一应用相同的缩放参数。
      注意：缩放参数应足够大（至少1,000），以确保R图像包含尽可能多的信息，并可视为R数值数据的分辨率因子。
   5. 点击应用按钮将调整后的参数应用于类球体图像。在工具窗口菜单的“调整显示”窗口中调整图像的亮度和对比度。
   6. 在“调整显示”窗口中使用固定缩放选项，手动确定比值分布直方图的连接和断开限值。这将决定R参数呈现的伪彩条范围。
      注意：为比较不同组间的类球体图像，重要的是为所有分析样品保持相似的彩条范围。由于各组间R参数的变化范围可能不同，所选伪彩条范围应在所有分析组的分布直方图中通用。
   7. 类球体通常并非理想球形，假设类球体直径为通过其中心（常为缺氧核心）的最长直线。使用测量菜单中的线性标尺功能确定类球体直径。将数据导出为电子表格文件。
   8. 选择所需大小（尽可能小）和形状（如圆形）的ROI，并将其应用于类球体的外围和缺氧核心。将ROI转换为测量对象，以分析所选ROI内的平均R值（外围R-R_p和核心R-R_c）。将数据导出为电子表格兼容的表格格式。
      注意：类球体组内O₂分布并不完全相同，缺氧核心也不完全与类球体中心共定位。为简化和标准化分析，假设最缺氧区域对应于类球体中心的理想核心。在这些区域测得的R_c用于计算O₂梯度范围（R_p-R_c）和陡度（R_p-R_c）/r，其中r（理想情况下为外围与缺氧核心ROI之间的距离）是根据直径测量值计算的类球体近似半径（单位：µm）。可选地，类球体O₂梯度可表示为沿类球体直径的R参数变化的线性轮廓图（测量菜单中的线轮廓窗口）。此数据也可导出为电子表格文件。
   9. 对类球体的每个显微截面进行测量，以获得类球体直径、R_c和R_p的数据集，用于进一步计算和统计比较。将所有数据合并至一个电子表格文件中。
   10. 对于光漂白或对不同刺激的动态响应的延时分析，将选定的ROI应用于图像集中的每个图像的相同坐标。为比较R参数，将其表示为延时图像集中第一个周期R值的百分比。
   11. 对于光漂白分析，使用多个ROI的R值计算每个延时周期的平均R百分比，并追踪其变化。
   12. 假设光漂白效应不显著，如果连续照明12个周期后初始强度下降小于5%。始终将动态变化与作为对照的光漂白曲线进行比较，以确保比率式延时响应的显著性（见图2A、B）。
   13. 根据获得的参数，计算数据集中每个类球体的r、（R_p-R_c）和（R_p-R_c）/r。通过Kolmogorov-Smirnov或相关检验分析数据分布的正态性。选择适当的数据分析统计方法，并进行数据呈现图的制作。
       注意：此处呈现的数据呈正态分布，组间统计比较采用独立t检验（p = 0.05）。

结果

使用微图案化琼脂糖方法高通量制备预染O₂探针的球状体，其过程在图1C中示意图展示，图中显示了无或含有预染球状体的琼脂糖微孔实例。细胞在琼脂糖涂层上形成球状体的效率及其形态/球形度可能具有细胞类型特异性。例如，人结肠HCT116细胞使用琼脂糖微孔法从未形成理想的球形结构，这与脂质涂层表面的结果相反¹⁷；而hDPSCs单独培养或与HUVEC共培养时，均能形成形状和大小高度可重复的球状体，其尺寸与细胞组成、初始细胞数量以及球状体形成/生长时间成正比。所有测试的细胞类型在球状体形成过程中均能高效积累O₂探针纳米颗粒（图1B），且染色信号至少可维持5天，从而可用于生物打印以及后续对生物打印组织氧合状态的监测（图1D）。

图1：O₂探针功能原理及其在类球体染色与生物打印中的应用。（A）简化的Yablonski能级图，解释了磷光纳米粒子（NP）探针对O₂的传感机制。在禁阻的三重激发态（T）期间，能量向分子O₂转移，导致磷光强度下降，该下降与磷光寿命tau（τ）成反比（从0% O₂时的τ₁变化至21% O₂时的τ₂），τ是指从单重激发态（S₁）激发到返回基态（G₀）的时间间隔⁴²。可通过比率法测量或直接测量τ（磷光寿命测量）实现O₂的定量检测。（B）人牙髓干细胞（hDPSC）类球体经不同类型纳米O₂探针染色后的成像示例，显示在透射光、参考通道及O₂敏感荧光染料通道下的图像。比例尺为100 µm。（C）利用微图案化琼脂糖方法高通量生成预先染色O₂探针类球体的示意图。从左至右：置于培养板孔中的PDMS硅胶印章、琼脂糖中微孔阵列图案示例（4倍放大），以及HCT116人结肠癌细胞在微图案化琼脂糖上接种后第2天形成的MMIR1预染类球体示例（4倍放大）。比例尺为100 µm。（D）从左至右：生物打印的华夫格结构，以及MMIR1预染类球体生物打印结构在生物打印后第1天和第5天的显微镜分析结果。荧光信号对应于MMIR1纳米粒子中的O₂敏感磷光染料（激发波长 = 635 nm，发射波长 = 760 nm）。比例尺为400 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

在所述显微镜系统（配备发光二极管（LED）作为光源的传统宽场荧光显微镜）中，红光/近红外MMIR1探针在其参考染料和敏感染料的光稳定性方面表现最佳，其初始强度比（R = I_参考文献/I_感受器经过12个周期的持续光照后。这使得可利用MMIR1探针对人牙髓干细胞球体在经线粒体解偶联剂（FCCP）和电子传递链复合物I抑制剂（鱼藤酮）处理后的快速呼吸反应进行动态实时研究。图2A，B）。我们发现，在干细胞衍生的球体中，FCCP 仅表现出轻微的解偶联效应，在加入该药物后约 80 秒内细胞呼吸略有下降，这与先前报道的 DPSC 代谢特征一致⁴⁰另一方面，鱼藤酮强烈抑制呼吸作用，导致类球体重新氧合（表现为R值升高）_p - 类球体边缘比率和R_c - 类球体核心比率）及外围至核心的O₂ 刺激后约 80 秒内形成梯度图2A）。MMIR1探针比率（R）在高氧（大气环境）和低氧（成像培养基中含亚硫酸钠和葡萄糖氧化酶）条件下的两点半校准₂ 水平证实了R的降低，这与经抗霉素A/鱼藤酮混合物处理后呼吸作用预先受到抑制的球状体中氧合程度的降低相关（图 2C），说明了如何利用MMIR1探针R的测量值在三维条件下对长期稳态和快速氧合反应进行半定量监测。

图 2：O₂ 探针对不同刺激响应的动力学分析。（A）静息状态下及经 FCCP 和鱼藤酮处理后 hDPSC 类球体氧合成像的代表性结果。比例尺为 100 µm。（B）MMIR1 强度比对 FCCP 和鱼藤酮处理的动力学响应，与初始光漂白强度比动力学（%）相比较。（C）hDPSC 类球体中 MMIR1 探针在富氧状态（添加抗霉素 A + 鱼藤酮）和缺氧状态（添加葡萄糖氧化酶）下强度比图像的变化。颜色条表示 O₂ 探针强度比（R = I_ref / I_sens）在图像中的分布。请点击此处查看该图的放大版本。

为了展示MMIR1探针在活体代谢成像中的应用，我们对同源hDPSC与异源hDPSC/HUVEC（1:1）类球体中的O₂梯度进行了比较分析。利用可用的蓝色和绿色荧光光谱通道，与Hoechst 34580（HXT）和SYTOX Green（SYTOX）共染色，以展示O₂探针在多参数研究中的应用（图3）。通过成像软件提供的逐像素强度比自动计算流程，生成了类球体中R分布的伪彩比率图像，实时可视化了所有类型类球体中从外周到核心的O₂梯度：外周富氧，中心存在缺氧微区（图2和 图3A）。然而，R_p和R_c值以及中间横截面上O₂梯度的陡峭程度在不同类型的类球体中有所不同：参见hDPSC与hDPSC/HUVEC类球体、以及hDPSC与生物打印hDPSC类球体中间横截面的线性分布图（图3B、C）。由于目前尚无广泛接受的O₂梯度描述方法，我们引入了若干参数，以便于比较并详细描述类球体整体的氧合状态：R_p和R_c，以及用于表征O₂梯度的两个指标——富氧区与缺氧区之间的差值（R_p-R_c），以及每微米平均氧合变化（R_p-R_c）/r，其中r为外周至缺氧核心的距离，在中间横截面中与类球体半径相对应（图3D）。对这些参数进行统计比较，并结合SYTOX在类球体中显示的坏死死亡细胞数据，有助于我们初步推断类球体细胞类型特异性O₂分布梯度的成因。

图 3：类球体中氧合梯度的比较分析。（A）同细胞hDPSC类球体在打印前后的氧合状态（MMIR1的比率荧光显微成像）以及活/死细胞染色（Hoechst 34580、HXT，蓝色；SYTOX Green，SYTOX）的代表性活体显微图像，以及异细胞hDPSC/HUVEC（1:1）类球体。所有类型类球体中的hDPSC均来自同一批细胞培养。类球体在形成过程中预先用5 µg/mL的MMIR1探针染色2天，随后用于成像或生物打印（仅hDPSC类球体），并在生物打印后第1天进行后续成像分析。MMIR1染色类球体的强度比（I_ref/I_sens）假彩色图像反映了其从边缘到核心的O₂ 梯度。比例尺为100 µm。颜色条表示O₂探针强度比（R = I_ref/I_sens）在图像中的分布情况。直径截面编号1和2对应于B和C中所示的强度分布曲线。（B,C）均质hDPSC类球体与异质hDPSC/HUVEC类球体之间的强度比分布比较（B），以及hDPSC类球体在生物打印前后的强度比分布比较（C）。分布曲线基于A图中所示类球体的横截面测量获得。（D）用于描述类球体从边缘到核心O₂梯度的参数示意图，其中r为类球体半径，R_p和R_c分别为类球体边缘区和核心区的强度比。颜色条示意性地表示理想球形类球体中O₂梯度从高（红色）到低（蓝色）的分布。（E,F）hDPSC/HUVEC与hDPSC类球体之间（E），以及hDPSC类球体在生物打印前与生物打印后第1天（F）的边缘至核心O₂梯度（R_p-R_c）/r值的比较分析。统计分析基于一次实验重复（n = 18–23）。方框表示标准差。星号表示组间统计学差异（p = 0.05）；** = p < 0.0005。请点击此处查看该图的放大版本。

与同源性hDPSC球体相比，hDPSC/HUVEC球体具有显著更陡的氧梯度：(R_p-R_c) / r 参数及其范围（R_p-R_c）的数值更高（图3F）。同时，其外围（R_p）和核心（R_c）的氧合水平也更高（图4A，表1）。有趣的是，这些异质球体在统计学上也显著更大（图4A，表1），提示其氧合差异可能源于不同的细胞生物能量特征。这些数据与HUVEC细胞已知的代谢特性一致：HUVEC细胞通常呼吸活性较低，主要依赖糖酵解和磷酸戊糖途径作为ATP和NAD(P)H的主要生物能量来源⁴¹。与此同时，异质球体中显著的由外周至核心的O₂梯度可能由其中的hDPSC所驱动，因为hDPSC具有线粒体超极化和活跃的电子传递链特征⁴⁰，并且根据hDPSC球体氧合实验结果，表现出较强的呼吸活性（图3、图4A和表1）。因此，hDPSC/HUVEC球体总体更高的存活率——通过SYTOX染色显示死细胞信号强度更低所证实（图3A）——可能与其更高的氧合水平相关。

为了说明活体显微成像在生物制造中用于类球体氧合状态分析的适用性，本研究使用经MMIR1 O₂-探针预染色的类球体，将其在GelMA生物墨水中进行生物打印，并比较了人牙髓干细胞（hDPSC）类球体在打印前与打印后第1天的O₂梯度变化（图3A、C、F，图4B以及表2）。与打印前的类球体相比，生物打印后的hDPSC类球体外围区域显著更富氧（R_p更高），而其核心区域的氧合水平则相近（图4B）。外围氧合状态的变化影响了从外围到核心O₂梯度的范围（(R_p-R_c)增大）和陡度（(R_p-R_c)/r增加），这些参数与打印前测量的hDPSC类球体相比具有统计学差异（图3F和图4B）。生物打印类球体中的死细胞染色通常更明亮，提示类球体活力下降可能参与了其氧合状态的改变（图3A）。

图 4：MMIR1 染色球体直径与强度比的比较分析。（A）异源性 hDPSC/HUVEC 与同源性 hDPSC 球体之间的比较。（B）生物打印前后同源性 hDPSC 球体的比较。R_p 和 R_c 分别表示球体外围和核心的强度比；(R_p-R_c) 表示强度比的差异，对应于球体内 O₂ 梯度的范围。统计分析基于一次实验重复（n = 18–23）。方框表示标准差。星号表示组间统计学差异（p = 0.05），其中 * = p < 0.005，** = p < 0.0005。请点击此处查看该图的放大版本。

类球体类型 (N)	直径 [µm]	Rp [a.u.]	Rc [a.u.]	Rp-Rc [a.u.]	(Rp-Rc)/r [a.u./µm]
hDPSC / HUVEC (18)	113.2 ± 10.6	0.779 ± 0.034	0.398 ± 0.055	0.982 ± 0.051	0.00677 ± 0.00091
hDPSC (18)	88.1 ± 9.9	0.558 ± 0.025	0.331 ± 0.034	0.227 ± 0.032	0.00520 ± 0.00090
p值	1.5 x 10-8 *	1.5 x 10-21 *	1.3 x 10-4 *	1.4 x 10-12 *	9.2 x 10-6 *

表1. 异质性hDPSC/HUVEC和同质性hDPSC类球体的类球体直径、类球体核心处的强度比（R_c）与边缘处的强度比（R_p）、强度比之差（R_p-R_c）以及（R_p-R_c）/r值。对N个类球体进行t检验所得的p值用于表示统计学差异，并以星号标示。

类球体类型 (N)	直径 [µm]	Rp [a.u.]	Rc [a.u.]	Rp-Rc [a.u.]	(Rp-Rc)/r [a.u./µm]
hDPSC (18)	88.1 ± 9.9	0.558 ± 0.025	0.331 ± 0.034	0.227 ± 0.032	0.00520 ± 0.00090
生物打印 hDPSC (23)	80.9 ± 12.5	0.584 ± 0.023	0.323 ± 0.038	0.261 ± 0.039	0.00658 ± 0.00144
p 值	0.054	0.0024 *	0.46	9.9 x 10-4 *	6.3 x 10-6 *

表2. 同质hDPSC类球体在生物打印前后其直径、类球体核心处的强度比（R_c）与边缘处的强度比（R_p）、强度比之差（R_p−R_c）以及（R_p−R_c）/r 值。统计分析的p值（N个类球体）。统计学差异以星号标示。

讨论

意义。 组织氧合水平的测量能够揭示细胞和特定组织的代谢、组织生长与发育、存活能力、肿瘤发生及细胞迁移，以及与微生物和其他病原体相互作用的情况。本文介绍的方法为深入理解多细胞球状体培养物的生理特性提供了新工具：利用比率型纳米颗粒 O₂ 探针进行氧合分析，可在广泛使用的低成本荧光显微镜上实现缺氧评估、特定能量生成途径依赖性的可视化，并补充建模研究及其他代谢成像方法^43,44。比率型测量可在荧光宽场显微镜（推荐使用脉冲LED激发）、激光扫描共聚焦显微镜、光片显微镜和双光子显微镜上进行，理想情况下配备温度（T）和 O₂ 控制的培养箱。重要的是，本文所述的 O₂ 显微测量方法可轻松结合多种生理参数和细胞示踪剂（针对异细胞组成球状体培养物）的活细胞多参数分析、细胞活力检测（活/死染色）、脂质代谢（脂质感应型荧光探针）、pH 动态变化（染料、纳米颗粒和荧光蛋白）或 [Ca²⁺] 检测，这些可在现有的荧光光谱通道中依次或并行完成，从而全面揭示球状体、生物打印结构以及潜在组织移植物中细胞功能的实时动态。

类球体培养物被广泛应用于癌细胞、肿瘤和干细胞微环境、类肿瘤体、药物有效性和毒性筛选等研究，实际上也可作为组织生物制造和自组装的组织构建单元⁴⁵。可通过多种不同方法，利用多种细胞类型生成类球体⁴⁶。类球体模型的广泛应用迫切需要从研究规范性和数据分析改进的角度对其进行标准化，近期已尝试建立首个类球体数据库以实现这一目标⁸。

本方案有望帮助更好地理解活体类球体的代谢过程，标准化此类实验模型，并进而提高其在生物打印及可植入材料中的长期稳定性、可重复性和存活率。

修改说明。本方案描述了使用微图案化琼脂糖低黏附表面（基于微模具成型²⁹）高效生成负载O₂探针的类球体，用于氧合分析。其他类球体生成方法，如悬滴法、超低吸附培养板、脂质涂层或悬浮培养法，也可与建议的O₂探针负载方案兼容。本方案已针对人牙髓干细胞（hDPSC）类球体以及hDPSC与HUVEC（1:1）的共培养类球体进行优化。其他细胞系同样适用^15,17,47,48；但由于不同细胞的黏附特性、培养条件、代谢底物需求以及对纳米颗粒染色的兼容性存在差异，可能需要对方案进行一定优化。选择合适的基于比率型纳米颗粒的O₂敏感探针时，需根据具体的细胞模型，并结合所用显微镜系统的光漂白特性（光源强度与类型、相机光谱灵敏度）以及是否有合适的激发/发射滤光片，用于探针相应的参考通道和O₂敏感光谱通道。

一些比率型O₂ 探针可商业获得²或者，可通过参考物质与O的共沉淀法在实验室自行制备。₂-敏感性染料与聚合物的使用方法，详见其他文献^24,25,49对于每个独立的模型，应首先进行预实验，以确定合适的探针和最佳显微镜观察条件，并尽量减少探针光漂白或光诱导氧₂ 比率测量期间的消耗。先前关于O₂-sensing 纳米颗粒表现出较低的细胞毒性，可在较宽的染色浓度范围（1–20 µg/mL）内应用。由于部分阳离子纳米颗粒在储存过程中可能发生自聚集，建议尽量保持较低的加载浓度，以最小化其对类球体形成可能产生的影响。可选地，纳米颗粒悬浮液可通过过滤（0.2 µm）或离心（10,000 x）去除杂质或沉淀 g使用前需离心（5 分钟）以去除悬液中的所有聚集体。

尽管BioCAD和HMI软件专用于本文所述的生物打印机，但本实验方案同样适用于其他生物打印机，因为文中提供了生物墨水的制备、组件组装、标准 cartridge 的填充以及多孔水凝胶支架的设计方法。此外，不同基于挤出式的生物打印机在打印速率和温度等打印参数方面应具有可比性。打印压力和丝状结构直径取决于针头类型与直径、生物墨水成分、温度及其相应的黏度，但这些参数可作为优化不同生物打印机上 GelMA 基生物墨水打印参数的起点，尽管某些生物打印机采用螺杆驱动而非气压来挤出生物墨水⁵⁰。

关键步骤与故障排除。其中一个关键步骤是选择O₂探针，该选择基于以下考虑因素：首先，所用荧光显微镜系统的配置（即激发光源、激发和发射滤光片、相机灵敏度、物镜的光谱透过率和数值孔径），这些因素可能限制可用探针的数量，具体涉及探针的光稳定性、亮度以及潜在的光毒性。还需注意，某些类型的浸油（在使用油浸物镜时）可能会干扰红色和近红外荧光信号。我们认为光稳定性测试极为重要，必须在初始系统搭建和预实验阶段进行。必须考虑不同荧光通道与染料之间的潜在光谱串扰。实际上，在优化实验方案时，必须评估O₂探针及其他所选染料针对特定细胞模型可能存在的暗毒性和光诱导毒性⁵¹。对于纳米颗粒而言，一个特定问题是其可能发生自聚集，可通过优化其工作浓度、染色介质的组成（如血清含量）、在与培养基混合前对纳米颗粒进行超声处理，或在类球体形成过程中改用预先染色并洗涤过的细胞来加载O₂探针，而非在类球体形成和致密化过程中进行探针加载，从而缓解该问题。

在所述的类球体模型中，我们未观察到与光穿透深度相关的问题，但在选择比率型强度信号、类球体尺寸和生物制造结构（组织移植物）以及优化细胞染色所用染料时，仍需考虑这一因素。MMIR1探针的红色和近红外发射波长非常接近，与其他发红光/蓝光或绿光的荧光生物传感器探针相比，预期可提供最低的背景信号和最佳的组织光穿透能力。

比率图像的生成与处理（以及可能的光谱解混或去卷积）可在厂商提供的软件中完成，也可使用开源工具如 ImageJ、Fiji^52,53、napari（https://napari.org）、MATLAB 等实现。关键步骤包括扣除背景信号，并在线性范围内测量信号强度的变化。

O₂ 探针的校准：鱼藤酮和抗霉素 A 分别是线粒体电子传递链复合物 I 和复合物 III 的抑制剂，可阻断细胞呼吸^54,55,15，并诱导类球体中的 O₂ 梯度消散，使其与环境 O₂ 浓度达到平衡。因此，改变环境 O₂ 浓度（即 20%、15%、10%、5%、2.5%、1%、0% O₂）可实现细胞内 O₂ 敏感探针对比强度或磷光寿命的校准。通常情况下，O₂ 控制培养箱无法达到绝对的 0% O₂，在某些情况下，需要快速测试探针对去氧的响应。此时，需向样品中添加 25–100 µg/mL 葡萄糖氧化酶，或 Na₂SO₃/K₂HPO₄ 混合物（每种化合物各 50 mg/mL，用蒸馏水配制成 10 倍浓缩液）。值得注意的是，若细胞系存在显著的非线粒体 O₂ 消耗，在进行呼吸抑制和校准实验时应考虑这一因素。

局限性与未来研究方向。 所提出方法以及比率检测方法总体上的主要局限在于，需将观测到的比率水平校准并转换为实际的 O₂ 水平，而由于硬件设备和用户图像采集设置的固有差异，该比率校准过程将依赖于特定仪器和特定细胞类型。重要的是，对于宽场荧光显微镜及本文所述的实验装置，所获得的比率图像反映的是综合投影而非理想的光学切片，因此进行 O₂ 校准并无意义。另一方面，我们证明了半定量的比率测量能够对来自不同来源且在氧合状态上存在差异的类球体提供具有统计学意义、易于测量的比较性表型分析。

未来的研究将致力于开发更易于获取且成本更低的显微成像技术，适用于活体三维样本，例如SPIM、光片显微镜、theta显微镜、双光子显微镜以及结合机器学习的发光寿命成像^{56,57,58,59,19}，这将有助于推动多参数O₂成像在更多定量应用中的发展。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25300-054	Sigma 也提供该产品
12 孔细胞培养板，无菌	Greiner bio-one	665-180	Sarstedt、Corning 及其他公司也提供类似产品。
12 孔可拆卸腔室载玻片	Ibidi	81201	Grace Bio-Labs、ThermoFisher Scientific 及其他公司也提供该产品
15 mL 离心管	Nerbe plus	02-502-3001	Sarstedt、Corning、VWR 及其他公司也提供类似产品
3 cc 卡式筒，UV 防护，鲁尔锁扣	RegenHU	C-033CC-UV	Cellink 及其他公司也提供该产品
3D Discovery 生物打印机	RegenHU	N/A	配备基于挤出的打印头、加热套、UV-LED 固化灯、3D Discovery HMI 软件（带直接机器控制的 CAD/CAM 软件）和 BioCAD 软件（版本 1.1-12）的生物打印机
6 孔细胞培养板，无菌	Greiner bio-one	657160	Sarstedt、Corning、VWR 及其他公司也提供类似产品
链霉菌来源的抗霉素 A	Sigma-Aldrich	A8674-25MG	用作线粒体电子传递链复合体 III 的抑制剂，阻断细胞呼吸
B-Braun 鲁尔锁扣尖端帽	RegenHU	TC-BB-B	Regemat、Cellink 及其他公司也提供该产品
细胞观察培养皿，聚苯乙烯材质，35/10 mm，玻璃底，单室，无菌	Greiner bio-one	627861	用于生物打印类球体的显微观察
人胎盘来源 IV 型胶原蛋白	Sigma	C5533	用于制备 0.07 mg/mL 胶原蛋白和 0.03 mg/mL 多聚-D-赖氨酸包被的显微观察培养皿
D(+)-葡萄糖	Merck	8342	配制 1 M 储存液，使用时稀释 1/100 以制备成像培养基（终浓度 10 mM）
无酚红、无葡萄糖、无丙酮酸、无谷氨酰胺的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Sigma-Aldrich	D5030-10X1L	用于制备成像培养基
内皮细胞生长培养基 2	PromoCell	C-22011	Lonza 及其他公司也提供该产品
内皮细胞生长补充剂混合物	PromoCell	C-39216	Lonza 及其他公司也提供该产品
FCCP，羰基氰化物-4-(三氟甲氧基)苯腙	Sigma-Aldrich	C2920-10MG	用作线粒体解偶联剂
胎牛血清	Gibco	10270-098	Sigma 也提供该产品
GelMA	N/A	N/A	GelMA 由 PBM 团队（根特大学 Peter Dubruel 博士教授和 Sandra Van Vlierberghe）合成 [https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961213011782]，但 Xpect Inx 也可提供
黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶（10000 u）	Sigma-Aldrich	G7141	用于测试探针对脱氧的响应
GlutaMAX 100x 补充剂	Gibco	35050-038	使用时稀释 1/100 以制备成像培养基（终浓度 2 mM）
HEPES（1 M）	Gibco	15630-080	使用时稀释 1/100 以制备成像培养基（终浓度 10 mM）
Hoechst 34580	Invitrogen (Life Technologies)	H21486	Sigma、BDBiosciences 及其他公司也提供该产品
人牙髓干细胞（hDPSC）	Lonza	PT-5025	ATCC 或其他供应商也提供该产品
人脐静脉内皮细胞（HUVEC）	Lonza	CC-2517	ATCC 或其他供应商也提供该产品
KH2PO4（磷酸二氢钾）	Merck	4873	用于配制亚硫酸钠溶液（5 mg/mL Na2SO3 和 5 mg/mL KH2PO4）。每日使用 10 倍浓缩储存液新鲜配制。
Li-TPO	N/A	N/A	Li-TPO-L 由 PBM 团队（根特大学 Peter Dubruel 博士教授和 Sandra Van Vlierberghe）合成  [https://link.springer.com/referenceworkentry/10.1007%2F97 8-3-319-45444-3_15) , https://asmedigitalcollection.asme.org/nanoengineeringmedical/article/6/2/021001/376814/Hybrid-Tissue-Engineering-Scaffolds-by-Combination]，但 Sigma 也提供类似的光引发剂
含 GlutaMAX 的 MEM α 培养基（最低必需培养基）	Gibco	32561-029	Sigma 及其他公司也提供该产品
微图案化 3D 打印 PDMS 印模，孔径 400 µm，厚度，总孔数 1585	自行制备		该印模由微系统技术中心（根特大学 Jan Vanfleteren 博士教授）自行制备，但也可从默克公司（Z764094，Microtissues 3D Petri Dish micro-mold mixed spheroid kit）商业购买
Na2SO3（亚硫酸钠）	Sigma-Aldrich	239321-500G	用于配制亚硫酸钠溶液（5 mg/mL Na2SO3 和 5 mg/mL KH2PO4）。每日使用 10 倍浓缩储存液新鲜配制。
O2 探针：MMIR1、SI-0.2+、SII-0.2+	N/A	N/A	可使用市售染料、聚合物和沉淀法在‘实验室内部’制备 [https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/nn200807g https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/adfm.201201387 ]。部分纳米颗粒可商业购买，详见 [https://link.springer.com/article/10.1007/s00018-018-2840-x ]
青霉素-链霉素溶液：青霉素（10,000 U/mL）/ 链霉素（10,000 μg/mL）100 倍浓缩液	Gibco	15140-122	Sigma 也提供该产品。使用时按 1:100 稀释
培养皿，无菌	Greiner bio-one	633181	Sarstedt、Corning、VWR 及其他公司也提供类似产品
3 cc 卡式筒活塞	RegenHU	P-03CC-UV	Cellink、Regemat 及其他公司也提供该产品
多聚-D-赖氨酸	Sigma	P6407-5mg	用于制备 0.07 mg/mL 胶原蛋白和 0.03 mg/mL 多聚-D-赖氨酸包被的显微观察培养皿
PVDF 注射器滤器，0.22 µm	Novolab	A35149	Sarstedt、Corning、VWR 及其他公司也提供类似产品
鱼藤酮	Sigma-Aldrich	R8875-1G	用作线粒体电子传递链复合体 I 的抑制剂，阻断细胞呼吸
丙酮酸钠（100 mM）	Gibco	11360-070	使用时稀释 1/100 以制备成像培养基（终浓度 1 mM）
SYTOX Green	Invitrogen (Life Technologies)	S7559	Sigma、Promega 及其他公司也提供该产品
22 号锥形尖端（锥形聚乙烯针头）	Amada Myachi Europe	22K62222	RegenHU、Cellink、Regemat 及其他公司也提供类似产品
组织培养瓶（75 cm²）	VWR	734-2313	Sarstedt、Corning、VWR 及其他公司也提供类似产品
超纯琼脂糖	Invitrogen (Life Technologies)	16500-500	其他类型的琼脂糖，如低熔点琼脂糖（A-9414，Sigma）、常规用途琼脂糖（A-9539，Sigma）
宽场荧光倒置显微镜	Olympus	N/A	IX81 倒置荧光显微镜，带电动 Z 轴控制，CoolLED pE4000（16 通道，365–770 nm），ORCA-Flash4.0LT（Hamamatsu）cMOS 相机，Okolab 玻璃加热板，CellSens Dimension v.3 软件，以及 4x/0.13 UPlanFLN 和 40x/0.6 LUCPlanFLN 干物镜。（可选，用于高分辨率成像）60x/1.0 LUMPLFLN 水镜