快速高尔基染色法用于海马和前额叶皮层树突棘的可视化

摘要

该方案描述了快速高尔基染色法的一种改良方法，可适用于神经系统的任何部分，用于对大鼠海马和内侧前额叶皮层中的神经元进行染色。

摘要

高尔基浸染法采用高尔基染色试剂盒并稍作改进，用于浸染大鼠海马和内侧前额叶皮层中的树突棘。该技术相较于以往的高尔基浸染方法具有显著改进：预混试剂更安全，神经元浸染效果稳定且良好，背景杂质显著减少，并且在特定脑区，不同实验间树突棘密度的差异极小。此外，脑组织可在某一阶段后积累并冷冻保存，待后续再行处理。利用该方法可研究任何感兴趣的脑区。染色并封片后，通过计算单位长度树突上的树突棘数量来确定树突棘密度，结果以每10 µm树突上的树突棘密度表示。

引言

使用重铬酸钾和硝酸银标记神经元的方法最早由卡米洛·戈尔吉（Camillo Golgi）描述^1,2，随后被圣地亚哥·拉蒙·卡哈尔（Santiago Ramon y Cajal）用于大量研究工作，以区分不同类型的神经元和胶质细胞。目前已有收录其插图的出版专著³。在拉蒙·卡哈尔发表这些研究（距今已超过100年）之后，戈尔吉浸渍法极少被使用。戈尔吉浸渍是一种费力的过程，但可借助光学显微镜实现神经元的三维可视化。多年来，该方法经历了诸多改进，以简化操作流程并提高染色的一致性⁴。1984年，加博特（Gabbott）和索莫吉（Somogyi）⁵提出了单切片戈尔吉浸渍法，使处理过程更为快速。该方法需使用4%多聚甲醛和1.5%苦味酸进行灌注，固定后经振动切片机将组织切片置于3%重铬酸钾溶液中。切片被贴附于载玻片上，盖玻片四角用胶水封固，以便在浸入硝酸银溶液时实现缓慢扩散。随后移除盖玻片，对切片进行脱水，并最终用封片介质永久封片。该技术已成功用于标记海马区的神经元和胶质细胞^6,7,8。本文所述的快速戈尔吉法进....

方案

所有实验程序均经圣心大学机构动物照护与使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》的规定。

1. 脑组织的分离与灌注

1. 使用前24小时将高尔基染色试剂盒中的溶液A和B预先混合，并保存于避光瓶中或置于暗处。配制约80 mL的A和B混合液，以便在24小时后更换溶液。储存于密封瓶中。
   注意：无需用生理盐水或甲醛溶液灌注。
2. 采用二氧化碳安乐死后，立即用断头器处死大鼠，并在数秒内取出脑组织。如有需要，可用生理盐水冲洗脑组织，但通常无需此步骤。
   1. 将脑组织腹面朝下放置于非多孔表面，使下丘脑可见（因为切面需位于其前后两侧），然后按照 图1 所示，将脑组织切成前部（包含前额叶皮层）和后部（包含海马）两个组织块。
3. 将组织块放入预先混合的A和B溶液中，确保完全浸没。确保A和B溶液的体积足以完全覆盖组织块。将组织块储存于棕色瓶中，或用铝箔包裹的透明瓶中（以避光），并在室温下避光保存。
4. 24小时后更换新溶液，并继续在室温下避光保存13天。
   注意：若用于小鼠脑组织，无需切块，可将整个脑组织直接放入溶液中。若染色的脑区大小不同，则在A和B溶液中的处理时间可能需要通过反复试验确定。
5. 两周后，组织块已充分渗透A和B溶....

结果

采用快速高尔基染色法，细胞染色效果稳定且充分，可提供充足的细胞用于分析。这显著优于以往的方法，过去需要合并多个实验才能获得足够的分析数据。因此，现在可以一次性处理更多样本，且脑组织可在冷冻状态下保存直至处理。图 3 展示了海马 CA1 区经高尔基染色的细胞在低倍和高倍镜下的图像。对特定区域树突棘的计数结果具有一致性，标准误较小。这一点也十分重要，因为它使得不同实验之间可以进行有效比较。图 4 展示了一项实验结果：在环境富集（EE）后，青春期雄性和雌性大鼠的 CA1 区和内侧前额叶皮层（mPFC）中的锥体细胞基底树突棘密度均有所增加。简而言之，雄性和雌性大鼠在出生后第 21 天断奶，并被分配至对照组或环境富集组。环境富集组在出生后第 24 至 42 天期间，每天有 2 小时处于富集环境中，而对照组在此期间饲养于普通笼具中。结果表明，环境富集可诱导两性青春期大鼠在 CA1 区和 mPFC 中的基底树突棘密度增加。请注意，所有树突棘数值的平均值标准误（SEM）均较小。

讨论

本实验方案描述了一种高尔基染色方法，可实现多个切片的快速同步处理。该方法改进了此前报道的⁵更为耗时费力的技术，能够稳定地获得可用于分析的染色神经元。此外，该方法减少了实验人员接触高尔基染色过程中所用有毒化学试剂的机会。该操作过程中最具挑战性的环节是使切片在载玻片上保持平整，这需要大量实践才能掌握。使用冷冻喷雾使所有操作尽可能保持低温至关重要。

一旦切片干燥并可进行分析，选择计数细胞时保持一致性非常重要。海马体锥体细胞应选自CA1区。对于包含多个亚区的内侧前额叶皮层（mPFC），应选用其中下边缘皮层的锥体细胞。原因尚不明确，mPFC中的染色细胞数量通常少于海马体CA1区。此外，由于操作上的限制，若无法同时处理所有切片，可将实验分批进行。为保证一致性，同一组细胞应由同一个人完成计数。

该方法的局限性与其他高尔基浸渍法相似。仅少量细胞被染色这一特点实际上是一种优势，因为被浸渍的细胞数量较少，便于对整个细胞进行三维观察。高尔基法的缺点在于，尚不清楚被标记的是哪一类细胞亚群。因此，在实验中.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
纸板载玻片托盘	Fisher Scientific	12-587-10
盖玻片 24 × 60 mm	Fisher Scientific	12-545-M
FD Rapid GolgiStain 试剂盒	FD Neurotechnologies	PK 401	避光室温下可长期稳定；Golgi 染色试剂盒
冷冻喷雾剂	Fisher Scientific	23-022524
HISTO-CLEAR	Fisher Scientific	50-899-90147	透明剂
NCSS 软件	Kaysville, UT, USA
Permount	Fisher Scientific	SP-15-100	封片介质
Superfrost Plus 显微载玻片	Fisher Scientific	12-550-15
Tissue Tek CTYO OCT 包埋剂	Fisher Scientific	14-373-65	用于将脑组织固定在冷冻切片机样品夹头上