快速高尔基染色法用于海马和前额叶皮层树突棘的可视化

摘要

该方案描述了快速高尔基染色法的一种改良方法，可适用于神经系统的任何部分，用于对大鼠海马和内侧前额叶皮层中的神经元进行染色。

摘要

高尔基浸染法采用高尔基染色试剂盒并稍作改进，用于浸染大鼠海马和内侧前额叶皮层中的树突棘。该技术相较于以往的高尔基浸染方法具有显著改进：预混试剂更安全，神经元浸染效果稳定且良好，背景杂质显著减少，并且在特定脑区，不同实验间树突棘密度的差异极小。此外，脑组织可在某一阶段后积累并冷冻保存，待后续再行处理。利用该方法可研究任何感兴趣的脑区。染色并封片后，通过计算单位长度树突上的树突棘数量来确定树突棘密度，结果以每10 µm树突上的树突棘密度表示。

引言

使用重铬酸钾和硝酸银标记神经元的方法最早由卡米洛·戈尔吉（Camillo Golgi）描述^1,2，随后被圣地亚哥·拉蒙·卡哈尔（Santiago Ramon y Cajal）用于大量研究工作，以区分不同类型的神经元和胶质细胞。目前已有收录其插图的出版专著³。在拉蒙·卡哈尔发表这些研究（距今已超过100年）之后，戈尔吉浸渍法极少被使用。戈尔吉浸渍是一种费力的过程，但可借助光学显微镜实现神经元的三维可视化。多年来，该方法经历了诸多改进，以简化操作流程并提高染色的一致性⁴。1984年，加博特（Gabbott）和索莫吉（Somogyi）⁵提出了单切片戈尔吉浸渍法，使处理过程更为快速。该方法需使用4%多聚甲醛和1.5%苦味酸进行灌注，固定后经振动切片机将组织切片置于3%重铬酸钾溶液中。切片被贴附于载玻片上，盖玻片四角用胶水封固，以便在浸入硝酸银溶液时实现缓慢扩散。随后移除盖玻片，对切片进行脱水，并最终用封片介质永久封片。该技术已成功用于标记海马区的神经元和胶质细胞^6,7,8。本文所述的快速戈尔吉法进一步优化了该技术，显著减少了对重铬酸钾和硝酸银的暴露，且无需使用多聚甲醛和苦味酸。此外，尽管采用加博特和索莫吉⁵方法的改良版也可分析浸渍后的细胞，但切片常出现染色过深或不足，或在脱水过程中从载玻片脱落，通常需要合并多个实验的数据才能获得足够数量的细胞用于分析。

本实验方案描述了使用高尔基染色试剂盒（见材料表）对大鼠海马和内侧前额叶皮层（mPFC）中的树突及树突棘进行标记的方法。与以往方法相比，该方法的优势在于操作快速、研究人员接触有害化学物质的时间更短，且神经元染色效果稳定一致。以下所述的实验方案已在多项研究中经少量修改后用于评估大鼠海马和内侧前额叶皮层（mPFC）中树突棘密度^{9,10,11,12,13,14,15}。

方案

所有实验程序均经圣心大学机构动物照护与使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》的规定。

1. 脑组织的分离与灌注

1. 使用前24小时将高尔基染色试剂盒中的溶液A和B预先混合，并保存于避光瓶中或置于暗处。配制约80 mL的A和B混合液，以便在24小时后更换溶液。储存于密封瓶中。
   注意：无需用生理盐水或甲醛溶液灌注。
2. 采用二氧化碳安乐死后，立即用断头器处死大鼠，并在数秒内取出脑组织。如有需要，可用生理盐水冲洗脑组织，但通常无需此步骤。
   1. 将脑组织腹面朝下放置于非多孔表面，使下丘脑可见（因为切面需位于其前后两侧），然后按照 图1 所示，将脑组织切成前部（包含前额叶皮层）和后部（包含海马）两个组织块。
3. 将组织块放入预先混合的A和B溶液中，确保完全浸没。确保A和B溶液的体积足以完全覆盖组织块。将组织块储存于棕色瓶中，或用铝箔包裹的透明瓶中（以避光），并在室温下避光保存。
4. 24小时后更换新溶液，并继续在室温下避光保存13天。
   注意：若用于小鼠脑组织，无需切块，可将整个脑组织直接放入溶液中。若染色的脑区大小不同，则在A和B溶液中的处理时间可能需要通过反复试验确定。
5. 两周后，组织块已充分渗透A和B溶液，此时将组织块转移至冷冻保护液（即高尔基染色试剂盒中的溶液C），在4 °C下放置48–72小时。
   注意：冷冻保护完成后，组织块可冷冻保存直至后续处理。此外，请注意试剂盒中的所有溶液均应收集并作为危险废物处理。
6. 将脑组织腹面朝下置于干冰上的载玻片上进行冷冻。冷冻后可立即在恒冷箱切片机上切片，或于-80 °C保存直至使用恒冷箱切片机切片。
   ​注意：切勿使用液氮冷冻，否则会导致组织产生裂纹。

2. 脑组织切片

1. 在预冷的冷冻切片机样品头表面放置少量组织介质。通过戴手套的手轻微融化组织块的一面，然后将其放置在组织介质上，从而将组织块固定在冷冻切片机样品头上。
   注意：无需对组织进行包埋。包含海马的组织块比包含前额叶皮层的组织块更容易切片，因为后者位于胼胝体前方，且两侧半球彼此分离。
2. 在 -22 °C 下使用冷冻切片机切割 100 µm 厚的切片，并将其贴附至涂胶载玻片上。也可使用厚度达 150 µm 的切片。每张载玻片尽量贴附 3–4 张冠状切片，以减少需要处理的载玻片数量。采用以下方法之一，在切片转移至载玻片前保持其冷冻状态。
   注意：这些切片未经过常规固定处理，因此容易迅速融化。应让切片在载玻片上自然融化。若切片在贴附前即开始融化，则无法使其平整地贴附于载玻片上。有多种方法可用于实现此目的。
   1. 在切片过程中，使用冷冻喷雾对刀片和组织块进行冷却。根据室内温度和湿度情况，可能需要对每张切片都进行喷雾冷却。切割时使用防卷板或毛笔使切片保持平整。
      注意：确保备有足够的冷冻喷雾。在切割 20 个组织块时，可能需要使用多罐喷雾。
   2. 若条件允许，可采用室温载玻片进行贴片——即将载玻片迅速与切片接触以实现贴附。经过练习后，可一次贴附多张切片。若此方法不成功，则将载玻片保留在冷冻切片机内使其保持极低温，并使用冷镊子或冷毛笔转移切片，随后进行融化贴附。
3. 每次切片后，使用纸巾清洁刀片。若刀片需要更彻底清洁，则使用 100% 乙醇（EtOH）擦拭，并在下次切片前使其完全干燥。
4. 切片贴附至载玻片后，将载玻片平放在纸板制的载玻片托盘上，在避光条件下室温干燥数小时至最多 48 小时。切勿覆盖载玻片托盘。在进行高尔基染色前，必须确保切片完全干燥。干燥后的切片应平放于载玻片托盘中，在避光条件下保存直至进行高尔基染色。
   ​注意：干燥过程不会对切片造成任何损伤。

3. 脑组织的染色与脱水

1. 在玻璃染色皿中进行染色。染色前立即混合溶液D和溶液E。根据方案，加入一份溶液D、一份溶液E和两份蒸馏水。对于玻璃染色皿，配制200 mL溶液以完全浸没组织切片。对于Koplin染色缸，所需体积较少。
2. 将载玻片放入支架中，各支架之间需留出足够间距，以确保溶液能够充分接触组织切片。
3. 在进行高尔基浸渍染色前，先将切片置于蒸馏水中处理4分钟（重复两次），然后放入高尔基浸渍染色液中染色10分钟。每处理70个切片后更换一次染色液。当蒸馏水变黄时应及时更换。
   注意：染色步骤的时间至关重要。时间过短会导致染色不足，时间过长则会引起过度染色，从而在分析时难以区分树突。一旦离开染色液，后续时间控制的重要性降低。
4. 按以下步骤脱水：70%乙醇（5分钟）、95%乙醇（5分钟；两次）、100%乙醇（5分钟；两次）、透明剂（5分钟；三次）。所有溶液应频繁更换，尤其是100%乙醇和透明剂，以确保切片保持无水状态。
   注意：无需经过50%乙醇步骤。由于高尔基浸渍染色本身已提供足够的对比度，因此无需进行复染。其他透明剂的效果均不如本实验所用者（见材料表）。
5. 使用60 mm长的玻璃盖玻片封片，并加入足量封片介质。应尽量减少气泡产生。如有需要，可小心取下并重新封片（即使数周后也可操作）。操作时应缓慢进行，以免损伤组织切片（因封片介质用量较多，故可实现此操作）。
   注意：使用大量封片介质虽略显杂乱，但十分必要，因为必须使用足够量的介质以覆盖厚达100 µm的组织切片。
6. 为确保每个切片上仅加盖一个盖玻片，应在操作前预先将盖玻片分离开。
7. 封片完成后，将载玻片平放在任何非多孔性纸上干燥3至5天，并在干燥过程中轻微移动载玻片，尤其是在第一天之后，以防止粘连。3至5天后将载玻片转移至玻片盒中，并理想情况下继续干燥至少3周后再进行观察。保持载玻片平放，以降低产生气泡的可能性。

4. 树突棘密度的测定

1. 为分析 mPFC 和海马 CA1 区锥体神经元的树突棘密度，请检查最外侧的次级基底树突和最外侧的三级顶树突，具体如步骤 4.1.1 所述（图 2）。
   1. 选择一条树突，使用图像分析程序测量其长度，用手动计数器计数该树突上的树突棘数量，并记录树突长度和树突棘数目。
2. 每只脑样本中每个区域（mPFC、CA1）分析六颗细胞。每组至少定量六只脑样本，方法如前所述^7,8。选择符合以下标准的神经元进行分析：细胞体和树突染色清晰完整；树突可与邻近细胞区分且连续无中断。
3. 在1000倍油镜下使用光学显微镜手动计数树突棘，并使用图像分析程序测量树突长度。通过将树突棘数量除以树突长度计算树突棘密度，结果以每10 µm树突上的树突棘数量表示。
   注意：目前已有更为精密的方法可用于区分树突棘亚型及树突结构特征，但在1000倍光学显微镜下手动计数可快速获得结果，从而判断是否需要进一步深入研究。尽管已尽力保持所采样树突的一致性，但树突粗细的自然变异仍可能影响计数结果。

结果

采用快速高尔基染色法，细胞染色效果稳定且充分，可提供充足的细胞用于分析。这显著优于以往的方法，因为在先前的技术中，必须将多个实验的数据合并才能获得足够的分析样本。因此，现在可以同时处理更多样品，并且脑组织可在冷冻状态下保存直至进行处理。图3展示了海马CA1区经高尔基染色的细胞在低倍和高倍镜下的典型图像。对特定区域树突棘进行计数可获得一致性良好的结果，标准误较小。这一点也十分重要，因为它使得不同实验之间可以进行有效比较。图4展示了一项实验结果：在环境富集（EE）后，青春期雄性和雌性大鼠的锥体细胞在CA1区和内侧前额叶皮层（mPFC）的基底树突棘密度均有所增加。简言之，雄性和雌性大鼠在出生后第21天（PND 21）断奶，并被分配至对照组或富集组。富集组大鼠在PND 24至42期间每天有2小时处于富集化饲养环境中，而对照组在此期间则饲养于普通笼具中。结果表明，环境富集可诱导两性青春期大鼠在CA1区和mPFC区域基底树突棘密度的增加。请注意，所有树突棘数据的平均值标准误（SEM）均较小。

讨论

本实验方案描述了一种高尔基染色方法，可实现多个切片的快速同步处理。该方法改进了此前报道的⁵更为耗时费力的技术，能够稳定地获得可用于分析的染色神经元。此外，该方法减少了实验人员接触高尔基染色过程中所用有毒化学试剂的机会。该操作过程中最具挑战性的环节是使切片在载玻片上保持平整，这需要大量实践才能掌握。使用冷冻喷雾使所有操作尽可能保持低温至关重要。

一旦切片干燥并可进行分析，选择计数细胞时保持一致性非常重要。海马体锥体细胞应选自CA1区。对于包含多个亚区的内侧前额叶皮层（mPFC），应选用其中下边缘皮层的锥体细胞。原因尚不明确，mPFC中的染色细胞数量通常少于海马体CA1区。此外，由于操作上的限制，若无法同时处理所有切片，可将实验分批进行。为保证一致性，同一组细胞应由同一个人完成计数。

该方法的局限性与其他高尔基浸渍法相似。仅少量细胞被染色这一特点实际上是一种优势，因为被浸渍的细胞数量较少，便于对整个细胞进行三维观察。高尔基法的缺点在于，尚不清楚被标记的是哪一类细胞亚群。因此，在实验中...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
纸板载玻片托盘	Fisher Scientific	12-587-10
盖玻片 24 × 60 mm	Fisher Scientific	12-545-M
FD Rapid GolgiStain 试剂盒	FD Neurotechnologies	PK 401	避光室温下可长期稳定；Golgi 染色试剂盒
冷冻喷雾剂	Fisher Scientific	23-022524
HISTO-CLEAR	Fisher Scientific	50-899-90147	透明剂
NCSS 软件	Kaysville, UT, USA
Permount	Fisher Scientific	SP-15-100	封片介质
Superfrost Plus 显微载玻片	Fisher Scientific	12-550-15
Tissue Tek CTYO OCT 包埋剂	Fisher Scientific	14-373-65	用于将脑组织固定在冷冻切片机样品夹头上