基于结构的转录因子蛋白沿DNA从原子级步进到粗晶扩散运动的模拟和采样

Summary

该协议的目标是揭示蛋白质沿DNA的一维扩散的结构动力学，使用植物转录因子WRKY结构域蛋白作为示例系统。为此，已经实施了原子和粗粒度分子动力学模拟以及广泛的计算采样。

Abstract

转录因子（TF）蛋白沿DNA的一维（1-D）滑动对于促进TF的扩散以定位遗传调控的靶DNA位点至关重要。检测TF滑动或踩踏DNA的碱基对（bp）分辨率在实验上仍然具有挑战性。我们最近进行了全原子分子动力学（MD）模拟，捕获了小的WRKY结构域TF蛋白沿DNA的自发1-bp步进。基于从此类仿真中获得的10 μs WRKY步进路径，此处的协议显示了如何通过构建用于1-bp蛋白质步进的马尔可夫状态模型（MSM）对TF-DNA系统进行更广泛的构象采样，并测试各种数量的微观和宏观状态用于MSM构建。为了检查TF蛋白与结构基础的DNA的加工一维扩散搜索，该方案进一步展示了如何进行粗粒度（CG）MD模拟以采样系统的长期尺度动力学。与全原子模拟揭示的亚微秒到微秒的蛋白质步进运动相比，这种CG建模和模拟对于揭示蛋白质-DNA静电对TF蛋白质在几十微秒以上的过程扩散运动的影响特别有用。

Introduction

转录因子（TF）寻找靶DNA以结合和调节基因转录及相关活性¹.除了三维（3D）扩散之外，TF的促进扩散被认为是靶DNA搜索所必需的，其中蛋白质还可以沿着一维（1D）DNA滑动或跳跃，或者在DNA^2，3，⁴，^5，6，7上进行节间转移。

在最近的一项研究中，我们对植物TF进行了数十微秒（μs）全原子平衡分子动力学（MD）模拟 - DNA⁸上的WRKY结构域蛋白。在微秒内捕获了WRKY在多晶A DNA上的完整1-bp步进。已经观察到蛋白质沿DNA槽的运动和氢键（HBs）断裂重整动力学。虽然这样的轨迹代表了一条采样路径，但整体蛋白质步进景观仍然缺乏。在这里，我们展示了如何使用构建的马尔可夫状态模型（MSM）围绕最初捕获的蛋白质步进路径扩展计算采样，该模型已广泛实施，用于模拟涉及实质性构象变化和时间尺度分离的各种生物分子系统

Protocol

1. 从原子MD模拟构建马尔可夫状态模型（MSM）

1. 自发蛋白质步进途径和初始结构收集
   1. 使用先前获得的10μs全原子MD轨迹⁸ 从"向前"的1-bp步进路径（即，每纳秒一帧）中均匀地提取10000帧。帧的总数需要足够大，以包括所有代表性构象。
   2. 在 VMD 中准备具有 10000 帧的过渡路径，方法是单击 "文件">"保存坐标"，在"所选原子"框中键入蛋白质或细胞核，然后在"帧"框中选择帧，单击" 保存 "以获取所需的帧。
      注意:先前获得的10 μs全原子MD模拟轨迹（此处称为"正向步进轨迹"），用于在34 bp均相多晶A DNA⁸上进行WRKY步进1-bp距离，用作启动进一步构象采样的初始路径。然而，请注意，在大多数实践中，通过执行定向或有针对性的MD模拟，或实现一般的路径生成方法等，可以构造初始^路径。
   3. 将参考DNA的长轴（从晶体结构）对齐到x轴，并将完整的34-bp DNA的初始质心（COM）设置在....

Results

旋转耦合滑动或 1 bp 步进的 WRKY 从 MSM 结构
DNA上的所有蛋白质构象都映射到蛋白质COM沿DNA的纵向运动X和旋转角度（见 图3A）。这两个度的线性偶联表示WRKY结构域蛋白在DNA上的旋转耦合步进。构象可以在 MSM 中进一步聚类为 3 个宏状态（S1、S2 和 S3）。然后，WRKY 的正向步进遵循宏观状态转换 S1->S2->S3。S1是指由建模结构（基于WRKY-DNA复合物⁴⁰的晶体结构）引发的亚稳态，其总体约为6%。请注意，在当前的建模中，初始蛋白质构象是从蛋白质与特定的W-box DNA序列⁴⁰结合的晶体结构中采用的。因此，这种建模的蛋白质 - 聚A-DNA复合物导致比阶梯或最终松弛结构（S3）更不利的初始结构（S1）。然而，人们可以发现蛋白质 - DNA界面处的氢键（HBs）在S3中心附近恢复，就像在S1中心附近一样（见 图3B）。处于 S1 状态的 HB 维护良好.......

Discussion

这项工作解决了如何进行基于结构的计算模拟和采样，以揭示转录因子或TF蛋白沿着DNA移动，不仅在步进的原子细节下，而且在过程扩散中，这对于TF在DNA靶标搜索中的促进扩散至关重要。为此，首先构建了小TF结构域蛋白WRKY沿着均匀的poly-A DNA步进1-bp的马尔可夫状态模型或MSM，以便可以揭示DNA上的蛋白质构象集合以及蛋白质 - DNA界面处的集体氢键或HB动力学。为了获得MSM，我们沿着自发蛋白质步进路径（从先前的10μs模拟中获得）进行了两轮广泛的全原子MD模拟，电流采样聚合为7.5μs（125 x 60 ns）。如此广泛的采样为我们提供了构象聚类成数百个微观状态的快照，利用蛋白质 - DNA界面对距离作为聚类的几何测量。通过检测时间尺度与针对各个MD模拟的各种长度或滞后时间计算的隐含时间尺度的分离，部分验证了MSM构造的马尔可夫性质。然后测试并比较20-2000个微态的时间尺度分离特性，并为MSM构建选择500个微态。此外，将500个微观状态动态地归为少量的宏观状态，为此我们测试了各种数量的状态，发现三个宏观状态足以满足当前系统的需求。三态模型简单地表明，状态S1向S2的过渡相对较快（在几十ns内），以D.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CafeMol	京都大学		粗粒度 （CG） 模拟
GROMACS	格罗宁根大学 乌普萨拉		分子动力学模拟软件
Matlab	MathWorks		数值计算软件
MSMbuilder	斯坦福大学		构建 MSM
VMD	伊利诺伊大学厄巴纳-香槟		分子可视化项目