受激拉曼散射（SRS）显微技术能够基于特定化学键的固有振动，实现对生物分子的无标记成像。本实验方案描述了一种集成式受激拉曼散射与双光子荧光显微镜的仪器装置，用于在活体小鼠脊髓中可视化细胞结构。
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本文内容
摘要
摘要
受激拉曼散射（SRS）显微技术能够基于分子固有的振动特性，对生物组织在其天然微环境中的状态进行无标记成像，从而为在亚细胞分辨率下开展生物过程的体内研究提供了理想工具。通过将双光子激发荧光（TPEF）成像整合到SRS显微系统中，这种双模态体内组织成像技术可以从多个角度获取关键的生化与生物物理信息，有助于理解细胞代谢、免疫反应及组织重塑等过程中的动态变化。本视频方案介绍了TPEF-SRS显微系统的搭建方法以及动物脊髓的体内成像技术。脊髓作为中枢神经系统的重要组成部分，在大脑与周围神经系统之间的信息传递中发挥着关键作用。富含磷脂的髓鞘包裹并绝缘轴突，以实现动作电位的跳跃式传导。体内对脊髓中髓鞘进行成像，对于研究神经退行性疾病及脊髓损伤的进展具有重要意义。本方案还详细描述了动物准备以及体内TPEF-SRS成像方法，以获取高分辨率的生物图像。
引言
拉曼显微镜1,2 正作为一种强大的无标记方法崭露头角，该方法基于生物分子中各种化学键的特征频率对生物组织进行成像。由于其具有非侵入性和良好的成像适应性，拉曼显微技术已被广泛用于成像富含脂质的生物组织组分，如髓鞘3,4,5，脂肪细胞6,7和脂滴8,9,10受激拉曼散射（SRS）信号以受激拉曼增益（SRG）或受激拉曼损耗（SRL）形式获取时无背景干扰，其光谱与自发拉曼散射具有完美的相似性11,12此外，SRL和SRG与分析物浓度呈线性关系，可实现对生物化学成分的定量分析9,11,<....
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方案
本研究中所有动物实验均按照香港科技大学（HKUST）实验动物中心的指南进行，并已获得HKUST动物伦理委员会的批准。搭建和操作双光子激发荧光-受激拉曼散射显微镜（TPEF-SRS）前，必须接受激光操作安全培训。在接触激光时，务必佩戴适用于相应波长范围的激光防护眼镜。
1. 双光子激发荧光-受激拉曼散射显微镜的搭建（显微镜搭建示意图见图1）
- 使用一台集成的光学参量振荡器（OPO），并将其与锁模掺镱光纤激光器连接，作为SRS成像的皮秒 激光光源。
注：OPO输出一束斯托克斯光（1031 nm）和一束泵浦光（波长可调，范围为780 nm至960 nm），脉冲持续时间为2 ps，重复频率为80 MHz。斯托克斯光束通过内置电光调制器（EOM）在20 MHz频率下进行调制，以实现兆赫级高频 相敏 SRS检测。 - 使用飞秒钛（Ti）：蓝宝石激光器作为双光子激发荧光（TPEF）成像的激光光源。
- 使用一对透镜（L1和L2）对飞秒激光束进行准直，并调节其光束直径至3 mm。
- 使用另一对透镜（L3和L4）对皮秒激光束进行准直，并将其光束直径扩展至3 mm。
- 使用半波片将飞秒激光束的偏振方向从p偏振转换为s偏振。 <....
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结果
体内对脊髓轴突及髓鞘的双模态成像在 Thy1-YFPH 转基因小鼠中进行，该小鼠在背根神经节传入神经元中表达 EYFP（图 3）。这些标记的传入神经元将感觉信息从外周神经传递至脊髓，其中央支位于脊髓背柱。利用双光子激发荧光-受激拉曼散射（TPEF-SRS）显微镜，可通过无标记 SRS 成像清晰地观察到密集分布的髓鞘，同时通过 TPEF 成像可观测到稀疏标记的 YFP 轴突。双模态成像结果显示，轴突被一层厚实的髓鞘紧密包裹（图 3C）。郎飞结（NR）是轴膜裸露于髓鞘之外的区域，在动作电位的快速跳跃式传导中发挥关键作用。从 TPEF-SRS 脊髓图像（图 3C）中可见，郎飞结处轴突直径减小，轴膜直接暴露于细胞外基质中。为确认郎飞结的存在及其位置，必须同时对轴突及其周围髓鞘进行成像。因此，TPEF-SRS 显微技术使我们能够在脊髓疾病发展过程中观察轴突与髓鞘的动态变化，这对于理解细胞动态机制具有重要意义。
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讨论
在本实验方案中，详细描述了双光子激发荧光-受激拉曼散射（TPEF-SRS）显微镜的基本配置。对于SRS成像，泵浦光束和斯托克斯光束在光学参量振荡器（OPO）内部实现时间和空间上的重叠 。然而，这种重叠在通过显微镜系统后可能会被破坏。因此，对泵浦光束和斯托克斯光束在空间和时间上的共定位进行优化，是实现最佳SRS成像所必需且关键的步骤。泵浦光束与斯托克斯光束之间的时间延迟与两束光的光程差有关，而光程差由显微镜系统中光学元件的色散特性决定38。当调节泵浦光束的波长以在不同拉曼位移下进行SRS成像时，由于光学透镜的折射率依赖于波长，泵浦光束的光程长度会相应变化38。因此，泵浦光束与斯托克斯激光脉冲之间的时间延迟会随泵浦光束波长的改变而变化，必须进行校准。OPO配备有软件控制的延迟线，用于实现泵浦光束与斯托克斯光束的时间同步。对于相同的光学配置，延迟数据保持稳定，仅需校准一次即可。因此，可在首次测量时保存不同泵浦光束波长下的延迟数据，供后续使用。当泵浦光束波长改变时，OPO控制软件可自动应用已校准的延迟数据，便于在不同拉曼位移下或进行高光谱S.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露，且不存在竞争性经济利益。
致谢
本工作获得了香港研究资助局基金项目16103215、16148816、16102518、16102920、T13-607/12R、T13-706/11-1、T13-605/18W、C6002-17GF、C6001-19E、N_HKUST603/19，创新科技署（ITCPD/17-9），大学教育资助委员会卓越学科领域计划（AoE/M-604/16，AOE/M-09/12）以及香港科技大学的资助 & 科技大学（HKUST）通过资助项目 RPC10EG33 提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| #2 镊子 | Dumont | 11223-20 | 用于椎板切除术 |
| 10X 物镜 | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 10X | |
| 25X 物镜 | Olympus | XLPLN25XSVMP2 | |
| 烧伤膏 | Betadine | ||
| 相机 | Sony | α6300 | |
| 电流放大器 | Stanford research | SR570 | |
| 电流光电倍增模块 | Hamamatsu | H11461-01 | |
| D2 665 nm 长通二向色镜 | Semrock | FF665-Di02-25x36 | 用于将落射荧光信号引导至检测模块 |
| D3 700 nm 短通二向色镜 | Edmund | 69-206 | 用于分离SRS与TPEF检测光路 |
| 脱毛膏 | Veet | ||
| FS1 975 nm 短通滤光片 | Edmund | 86-108 | 用于阻断斯托克斯光束 |
| FS1 带通滤光片 | Semrock | FF01-850/310 | 用于阻断斯托克斯光束 |
| Fs2 带通滤光片 | Semrock | FF01-525/50 | 用于选择YFP信号 |
| Fs2 短通滤光片 | Semrock | FF01-715/SP-25 | 用于阻断飞秒激发激光束 |
| 半波片 | Thorlabs | SAHWP05M-1700 | |
| 高速光电探测器 | MenloSystems | FPD 310-F | 用于检测斯托克斯光束调制情况 |
| 碘 | Betadine | ||
| 红外观察仪 | FJW | FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X | |
| 光圈 | Thorlabs | CPA1 | |
| L1 | Thorlabs | AC254-060-B-ML | |
| L10 | Thorlabs | LA4052-A | |
| L2 | Thorlabs | LA1422-B | |
| L3 | Thorlabs | AC254-050-B | |
| L4 | Thorlabs | AC254-060-B-ML | |
| L7 | f=100 mm，AB镀膜 | ||
| L8 | Thorlabs | LA4874-A | |
| L9 | Thorlabs | AC254-035-B-ML | |
| 锁相放大器 | APE | ||
| 反射镜 | Thorlabs | PF10-03-P01 | |
| 电动翻转镜 | Thorlabs | MFF101/M | |
| 多功能采集卡 | National Instrument | PCIe-6363 | |
| 示波器 | Tektronix | TDS2012C | |
| 光电二极管 | APE | 用于检测SRS信号 | |
| 皮秒激光源 | APE | picoEmerald | |
| 偏振分束器 | Thorlabs | CCM1-PBS252/M | |
| 功率计 | Newport | 843-R | |
| 生理盐水 | Braun | ||
| 扫描透镜 L5 | Thorlabs | SL50-CLS2 | |
| 扫描镜 | Cambridge Technology | 6215H | |
| 硅凝胶 | World Precision Inc. | KWIK-SIL | |
| 钛：蓝宝石飞秒激光器 | Coherent | Chameleon Ultra II | |
| 管镜 L6 | Thorlabs | TTL200-S8 |
参考文献
- Raman, C. V., Krishnan, K. S. The optical analogue of the compton effect. Nature. 121 (3053), 711(1928).
- Turrell, G., Corset, J. Raman Microscopy: Developments and Applications. , Academic Press. (1996).
- Tian, F., et al.
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重印与许可
