一种用于活体成像乳腺肿瘤微环境的无标记分割方法

摘要

本文所述的活体成像方法利用胶原蛋白的二次谐波生成以及代谢辅因子NAD(P)H的内源性荧光，对未标记的肿瘤微环境进行无创分割，将其划分为肿瘤、间质和血管等区域，从而实现对4D活体成像数据的深入分析。

摘要

在活体肿瘤微环境中，可视化多种细胞类型与细胞外基质（ECM）之间复杂而动态的生理相互作用，是理解调控肿瘤进展机制的重要一步。尽管目前的活体成像技术可实现这一目标，但由于组织具有高度异质性，且实验观察需要空间背景信息，因此仍具挑战性。为此，我们开发了一种活体成像工作流程，结合胶原蛋白二次谐波生成成像、代谢辅因子 NAD(P)H 的内源性荧光，以及荧光寿命成像显微技术（FLIM），以非侵入性方式将肿瘤微环境划分为肿瘤巢、周围间质或细胞外基质（ECM）以及血管系统等基本区域。该非侵入性方案详细描述了从乳腺肿瘤模型的时间序列图像采集，到后期处理分析与图像分割的逐步操作过程。该工作流程的主要优势在于利用代谢特征，在无需使用外源性荧光标记物的情况下，对动态变化的活体肿瘤微环境进行空间定位，因此特别适用于人源肿瘤异种移植（PDX）模型，并为外源性荧光探针难以应用的未来临床场景提供了优势。

引言

肿瘤微环境中的细胞外基质（ECM）已知可由多种细胞类型动态沉积并重塑，以进一步促进疾病进展^1,2,3这些基质改变提供了机械和生物学信号，从而改变细胞行为，并常常导致基质持续重塑的循环。⁴对肿瘤细胞与细胞外基质之间动态、相互作用的研究通常采用三维（3D）模型进行 体外 培养或微流控系统。尽管这些自下而上的方法已揭示了细胞外基质重塑的机制^5,6,7增殖增加⁸上皮-间质转化^9,10,11,12以及肿瘤细胞的迁移和侵袭^{7, 13,1....}

方案

所述所有实验均经威斯康星大学麦迪逊分校机构动物照护与使用委员会批准。在所有动物实验中，动物福利与疼痛管理至关重要。因此，我们尽一切努力确保动物在实验每个步骤中均处于舒适状态并得到妥善照护。

1. 乳腺成像窗口（MIW）的制备

1. 为构建乳腺成像窗口，使用外科级不锈钢加工制作一个直径为14 mm的环状结构。
2. 使用5%清洗剂的热溶液清洗加工好的窗口框架，然后在流动的去离子水（DI）下冲洗10分钟，再在100%乙醇中浸泡10分钟，最后在加热灯下干燥。将干燥后的MIW框架进行高压灭菌，并储存以备后续使用。
3. 按以下步骤准备MIW盖玻片： 将#1.5规格、直径12 mm的圆形盖玻片浸入100%乙醇中10分钟，加热灯下干燥后，用氰基丙烯酸酯粘合剂将其固定于金属MIW框架上。粘合剂需过夜固化。
4. 用浸有丙酮的棉签清除组装好的MIW上多余的粘合剂，并将其浸入70%乙醇中清洗10分钟。清洗后让窗口自然干燥。应在手术植入前预先准备好MIW，并将其存放于无菌培养皿中。

2. MIW 的手术植入

1. 手术前，将手术器械进行高压灭菌，并用70%乙醇对操作表面进行消毒。
2. 在经过消毒的台面上进行手术，台面需覆盖无菌区域并放置加热毯。调节加热毯温度....

结果

安装显微成像窗（MIW）并进行基本的实验设计是该过程的第一步。这种特定的MIW设计和方案更适合于纵向研究¹⁹，并且已成功应用于直立式和倒置式显微镜。本实验中采用倒置显微镜，因其可获得更稳定的乳腺图像，并减少呼吸伪影。在图1A中，我们提供了刚性MIW的尺寸以及植入过程的示意图。

在无标记的 MMTV-PyMT³⁹ 乳腺肿瘤中，典型的视野（图1B-E、图3A）具有高度异质性，包含胶原纤维、大量间质细胞、成团的肿瘤细胞以及脉管系统（图3A）。通常情况下，靠近观察窗区域的胶原纤维更为丰富，而随着肿瘤深度增加，其丰度逐渐降低（图1B-E.......

讨论

4D活体成像是一种强大的工具，可用于研究原位肿瘤微环境中时空背景下的动态生理相互作用。本文提供了一个极为基础且可灵活调整的操作框架，仅利用来自二次谐波生成或NAD(P)H自发荧光的内源性信号，对肿瘤组织内部、邻近间质区域或血管网络附近的动态细胞相互作用进行分区分析。本实验方案提供了从成像窗植入到图像采集、分析与分割的全面、逐步操作方法。我们相信，该技术将有助于建立一个必要的分析框架，用于对4D活体成像数据进行分割与定量分析。

本方案旨在广泛适用于多种活体小鼠模型，包括未标记的PDX模型。PDX模型是一种极具信息价值的模型⁴⁵，但其本身难以进行遗传操作，因此对活体成像构成了挑战。因此，若能拥有一种仅利用内源性代谢物（如NAD(P)H）和二次谐波生成（SHG）即可在未标记的生理环境中可视化并区分动态相互作用的方法，将具有显著优势。除了适用于PDX模型外，这种多维方法理论上还可应用于任何需要空间与结构背景来回答生理学问题的癌组织或正常组织的活体研究。NAD(P)H的自发荧光和来自胶原纤维的SHG信号普遍存在于所有组织中，是活体成像中一种普适.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#1.5 12毫米圆形盖玻片	Warner Instruments	# 64-0712	MIW 构建
用于皮下注射的 1.0 mL 注射器	BD	309659	注射器
20倍物镜	Zeiss	421452-988	水浸物镜
用于皮下注射的 27G 针头	Covidien	1188827012	针头
40倍物镜	Nikon	MRD77410	水浸物镜
5-0 编织丝线缝合线	Ethicon	K870	用于 MIW 植入的缝合线
人工泪液凝胶	Akorn	NDC 59399-162-35	眼用凝胶
5% 碘伏溶液	Fisher Scientific	NC1558063	手术消毒剂
棉签	Fisher Scientific	23-400-101
氰基丙烯酸酯粘合剂	Loctite	1365882	MIW 构建
荧光葡聚糖	Sigma	T1287-50mg	血管系统的静脉内标记
镊子	Mckesson.com	Miltex #18-782	不锈钢，4 英寸，弯曲
GaAsP 光电倍增管	Hamamatsu
加热垫	CARA 72 加热板	038056000729	温度可调
加热腔室	自制
荧光寿命手册	Becker and Hickl		https://www.becker-hickl.com/literature/handbooks
倒置显微镜基座	Nikon
异氟烷	Akorn	NDC 59399-106-01	麻醉剂
Liqui-Nox 清洁剂	Fisher Scientific	16-000-125	MIW 清洁
美洛昔康	Norbrook	NDC 55529-040-10	镇痛药
微型软管	Scientific Commodities INC.	BB31695-PE/1
多光子扫描头	Bruker Ultima II		多光子扫描头及成像平台
NADH FLIM 滤光片	Chroma	284994	ET 440/80 m-2P
Nair 脱毛膏	CVS	339826	脱毛乳膏
物镜加热器	Tokai Hit	STRG-WELSX-SET
SHG/FAD 滤光片	Chroma	320740	ET450/40m-2P
Sparkle 玻璃清洁剂	Amazon.com	B00814ME24	用于植入式 MIW 的玻璃清洁剂
SPC-150 光子计数板	Becker and Hickl
手术灯	FAJ	B06XV1VQVZ	磁性 LED 鹅颈灯
手术显微剪刀	Excelta	366	不锈钢，3 英寸
三重抗生素软膏	Actavis Pharma	NDC 0472-0179-34	抗生素
TV 导管	定制	BD 30G 针头：305106	用于 TV 注射的导管
双光子滤光片	Chroma	320282	ET585/65m-2P
双光子激光器	Coherent charmeleon		可调谐多光子激光器
超声耦合凝胶	Parker	PKR-03-02	水浸凝胶
尿素晶体	Sigma	U5128-5G	可选：FLIM IRF