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方法文章

一种用于活体成像乳腺肿瘤微环境的无标记分割方法

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DOI：

10.3791/63413

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2022年5月24日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Pathology, University of Wisconsin-Madison, 3Carbone Cancer Center, University of Wisconsin-Madison

本文内容

摘要

本文所述的活体成像方法利用胶原蛋白的二次谐波生成以及代谢辅因子NAD(P)H的内源性荧光，对未标记的肿瘤微环境进行无创分割，将其划分为肿瘤、间质和血管等区域，从而实现对4D活体成像数据的深入分析。

摘要

在活体肿瘤微环境中，可视化多种细胞类型与细胞外基质（ECM）之间复杂而动态的生理相互作用，是理解调控肿瘤进展机制的重要一步。尽管目前的活体成像技术可实现这一目标，但由于组织具有高度异质性，且实验观察需要空间背景信息，因此仍具挑战性。为此，我们开发了一种活体成像工作流程，结合胶原蛋白二次谐波生成成像、代谢辅因子 NAD(P)H 的内源性荧光，以及荧光寿命成像显微技术（FLIM），以非侵入性方式将肿瘤微环境划分为肿瘤巢、周围间质或细胞外基质（ECM）以及血管系统等基本区域。该非侵入性方案详细描述了从乳腺肿瘤模型的时间序列图像采集，到后期处理分析与图像分割的逐步操作过程。该工作流程的主要优势在于利用代谢特征，在无需使用外源性荧光标记物的情况下，对动态变化的活体肿瘤微环境进行空间定位，因此特别适用于人源肿瘤异种移植（PDX）模型，并为外源性荧光探针难以应用的未来临床场景提供了优势。

引言

肿瘤微环境中的细胞外基质（ECM）已知可由多种细胞类型动态沉积并重塑，以进一步促进疾病进展1,2,3这些基质改变提供了机械和生物学信号，从而改变细胞行为，并常常导致基质持续重塑的循环。4对肿瘤细胞与细胞外基质之间动态、相互作用的研究通常采用三维（3D）模型进行 体外 培养或微流控系统。尽管这些自下而上的方法已揭示了细胞外基质重塑的机制5,6,7增殖增加8上皮-间质转化9,10,11,12以及肿瘤细胞的迁移和侵袭7, 13,14,15,16，他们的研究主要集中在同质的三维基质中的少数几种细胞类型（例如肿瘤细胞或成纤维细胞），而与生理组织中存在的细胞多样性及相互作用的异质性相比，这种模型仍存在明显局限。此外 体外 系统 离体 肿瘤组织学也可为这些细胞间及细胞与细胞外基质（ECM）间的相互作用提供一定见解17免疫组织化学的优势在于能够针对细胞外基质（ECM）在空间上异质性的组成与结构来分析多种细胞类型，但固定组织的静态终点无法捕捉细胞与微环境之间相互作用的动态特性。活体成像技术为探究生理条件下多种动态相互作用打开了新的途径 原发肿瘤微环境的背景

活体肿瘤成像技术的能力正在迅速发展。成像窗设计以及植入窗口的外科技术的进步，使得在多种解剖部位（如原发性肿瘤、淋巴结、转移灶18,19,20）进行长期纵向肿瘤成像成为可能。此外，光学仪器在多个维度（如光谱、空间荧光强度和荧光寿命）以高分辨率和高速度（视频速率）可视化并采集数据的能力正变得越来越普及。这些技术进步为研究生理环境中细胞信号传导和表型动态的快速变化提供了机会。最后，光遗传学工具的扩展以及丰富的遗传性荧光报告系统，使得能够标记特定细胞类型，从而捕获肿瘤微环境中的细胞迁移过程，或在发育及疾病进展过程中进行细胞谱系示踪21,22。将这些工具与CRISPR/Cas9技术结合使用，使研究人员能够及时构建独特的动物模型。

尽管这些进展使活体成像成为探索细胞动态及生理相互作用的日益强大的方法，但仍迫切需要开发能够为这些生物学相互作用提供组织层面空间、时间和结构背景的策略。目前，许多活体成像研究通过向血管系统注射荧光染料或使用外源性表达荧光蛋白的小鼠模型来标记物理特征，以弥补缺乏血管等可视解剖标志物的不足。可注射染料和底物（如荧光葡聚糖）被广泛用于成功标记活体成像中的血管系统19, 23, 24。然而，这种方法也存在局限性。首先，它需要额外的小鼠操作，且仅适用于短期实验。在纵向研究中，荧光葡聚糖可能存在问题，因为随着时间推移，我们观察到葡聚糖在吞噬细胞中积累或扩散至周围组织25。将外源性荧光蛋白引入小鼠模型已被提出作为荧光葡聚糖的替代方案，但其自身也存在局限性。目前可用于小鼠模型的外源性荧光团种类有限，且构建成本高昂。此外，在某些特定模型（如PDX模型）中，基因操作并不可取或不可行。已有研究表明，细胞内存在的荧光或生物发光蛋白会被小鼠识别为外来物质，在免疫功能健全的小鼠模型中，这会因宿主免疫系统的反应而减少转移的发生26,27。最后，用于提供空间背景或分割后续数据的外源性荧光蛋白或荧光染料通常占据光谱中的主要波段，而这些波段本可用于研究感兴趣的生理相互作用。

利用细胞外基质（ECM）的内在信号或组织内细胞的内源性荧光，是一种潜在的通用无标记方法，可用于对活体成像数据进行分割，从而实现更深入的细胞和空间分析。二次谐波生成（SHG）长期以来被用于可视化细胞外基质28。随着后续发展出一系列重要的工具以辅助纤维结构的表征29,30,31，现已能够描述细胞行为与局部ECM结构之间的关系。此外，内源性代谢物NAD(P)H产生的自发荧光为在体（in vivo）划分肿瘤微环境提供了另一种无标记工具。NAD(P)H在肿瘤细胞中发出强烈荧光，可用于区分生长中的肿瘤巢与周围间质的边界21,32。最后，血管系统是肿瘤微环境中的重要生理结构，也是多种特定细胞类型相互作用的关键场所33,34,35。通过激发红细胞（RBC）或血浆，已被用于可视化肿瘤血管系统，且利用双光子或三光子激发（2P；3P）已可实现血流速度的测量36。然而，尽管较大的血管可通过其内源性荧光特征轻易识别，但对细微、形态多变且荧光较弱的小血管的识别则需要更高的专业技能。这些固有困难限制了图像分割的最优化。幸运的是，这些内源性荧光来源（即红细胞和血浆）也可通过荧光寿命成像进行检测37，该技术利用了血管系统独特的光物理特性，为不断发展的活体成像工具箱提供了一项有力补充。

本方案描述了一种从数据采集到分析的四维（4D）活体成像分割工作流程，该流程明确利用内源性荧光和二次谐波信号（SHG）等内在信号进行分割。该方案特别适用于通过乳腺成像窗口进行的纵向研究，在此类研究中，外源性荧光标记可能不实用或不可行，例如在PDX模型中即是如此。然而，此处概述的分割原理广泛适用于研究肿瘤生物学、组织发育甚至正常组织生理学的活体成像使用者。所报告的一系列分析方法将使使用者能够区分在有序或无序胶原纤维结构区域中细胞行为的差异，比较肿瘤微环境中特定区域定居细胞的数量或行为，并仅利用无标记或内在信号将血管系统与肿瘤微环境进行映射。这些方法共同构建了一个操作框架，可在最大限度地提升乳腺组织4D活体成像所获取信息深度的同时，减少对外源性标记的依赖。

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方案

所述所有实验均经威斯康星大学麦迪逊分校机构动物照护与使用委员会批准。在所有动物实验中，动物福利与疼痛管理至关重要。因此，我们尽一切努力确保动物在实验每个步骤中均处于舒适状态并得到妥善照护。

1. 乳腺成像窗口（MIW）的制备

  1. 为构建乳腺成像窗口，使用外科级不锈钢加工制作一个直径为14 mm的环状结构。
  2. 使用5%清洗剂的热溶液清洗加工好的窗口框架，然后在流动的去离子水（DI）下冲洗10分钟，再在100%乙醇中浸泡10分钟，最后在加热灯下干燥。将干燥后的MIW框架进行高压灭菌，并储存以备后续使用。
  3. 按以下步骤准备MIW盖玻片： 将#1.5规格、直径12 mm的圆形盖玻片浸入100%乙醇中10分钟，加热灯下干燥后，用氰基丙烯酸酯粘合剂将其固定于金属MIW框架上。粘合剂需过夜固化。
  4. 用浸有丙酮的棉签清除组装好的MIW上多余的粘合剂，并将其浸入70%乙醇中清洗10分钟。清洗后让窗口自然干燥。应在手术植入前预先准备好MIW，并将其存放于无菌培养皿中。

2. MIW 的手术植入

  1. 手术前，将手术器械进行高压灭菌，并用70%乙醇对操作表面进行消毒。
  2. 在经过消毒的台面上进行手术，台面需覆盖无菌区域并放置加热毯。调节加热毯温度，使无菌区域表面温度维持在40 °C。
  3. 使用辅助冷光源以防止组织干燥。佩戴放大镜以辅助手术操作。根据外科操作规范建议，穿戴个人防护装备（PPE），包括无菌一次性实验服、手术袖套、手套、眼部防护装置和口罩。
  4. 使用异氟烷浓度为2.0%、氧气流速为2.0 L/min的麻醉呼吸机对小鼠进行麻醉。通过皮下注射给予镇痛剂（美洛昔康，10 mg/kg）。
    注意：术后24小时内需追加给药，建议术后前2天每8-12小时给药一次。
  5. 麻醉成功后（以脚趾夹捏无反应为确认），涂抹保湿眼用凝胶以防止眼睛干涩。使用脱毛膏去除手术部位的毛发（4th 腹股沟乳腺，随后用无菌水浸湿的纱布擦拭冲洗。
  6. 用碘伏和乙醇交替擦拭3次，对脱毛的手术部位进行皮肤表面消毒，以备手术。
  7. 手术开始时，用镊子轻轻提起第4对乳腺上方的皮肤。将皮肤从体壁拉开后，用外科显微剪在镊子尖端处切除约1 mm的真皮层。若出现出血，用无菌纱布轻轻按压直至止血。
    ​注意：通常情况下，较大的肿瘤比小肿瘤或正常组织具有更高的出血风险。
  8. 用镊子在手术切口处轻轻操作，将乳腺组织从真皮层分离，避免切断下方的腺体。
  9. 制作一个10 mm的切口，从周围皮肤真皮层分离乳腺组织，以便缝合时无需穿透乳腺。加入PBS覆盖暴露的乳腺/肿瘤组织，防止干燥。
  10. 沿开口边缘使用5-0编织丝线缝合线制作荷包缝合。将MIW的一边插入，使真皮层进入MIW的接收槽中。
  11. 轻轻拉伸MIW对侧的表皮，并将金属MIW推入到位，使真皮层完全嵌入MIW整个周缘的接收凹槽中。收紧荷包缝线，将真皮层拉入凹槽并打结固定，以完全锁紧MIW。
  12. 在MIW处的真皮层添加局部抗生素，并持续监测小鼠，直至其恢复足够的意识以维持胸卧位。将植入MIW的小鼠单独饲养于铺有软垫料的笼中，并在笼内放置一个 igloo，成像前让小鼠恢复48小时。

3. 成像过程中小鼠在显微镜载物台上的定位与维持

  1. 在显微镜载物台上设置加热腔室。使用设定为 30 °C 的强制空气系统，或任何其他类似系统。使用物镜加热器以避免 z 轴焦点漂移。在成像前，让系统至少平衡 1 小时。
    注意：麻醉状态下的小鼠无法正常维持体温，因此在进行任何时间序列成像时，必须提供加热环境。物镜加热器有助于减轻热膨胀效应，该现象会导致物镜和成像组织在达到热平衡过程中发生 z 轴焦点漂移。
  2. 当显微镜上的加热腔室稳定在 30 °C 后，使用麻醉机（异氟烷浓度为 2%，氧气流速为 2 L/min）对受体小鼠进行麻醉。
  3. 待小鼠进入镇静状态（通过脚趾夹捏无反应确认）后，用棉签和玻璃清洁剂清洁 MIW 玻璃的外表面，涂抹眼膏以防止角膜干燥，必要时插入尾静脉导管。
  4. 为维持适当水合状态，初始可皮下注射 0.5 mL PBS，或经尾静脉导管注射 100 µL。在成像期间每 2 小时重复一次。
  5. 小鼠准备就绪后，设置显微镜以进行成像。为减少时间序列测量过程中的蒸发，使用水性凝胶代替水作为浸没介质。此步骤应在将小鼠放置于载物台前完成。有关光学组件的详细信息，请参见材料表。
  6. 将小鼠平放在显微镜载物台上，连接异氟烷导管，并将 MIW 的卡扣压入载物台插入件中的 14 mm 接收孔，以稳定图像。使用显微镜目镜将成像区域调至焦点，并使用明场照明观察 具有血流的血管结构。
  7. 检查视野的稳定性。若存在呼吸运动伪影，可用一小块泡沫和一条类似束带的胶带对腺体背面施加轻柔压力。加压后，需确认整个视野内血流保持通畅。
  8. 在成像过程中，通过手动计数动物呼吸频率，以 0.25% 为增量定期调整异氟烷浓度，以维持适当的镇静水平。
  9. 维持每分钟 36–40 次呼吸（rpm）的频率，以提高动物存活率并优化光学成像质量。呼吸频率过低可能导致小鼠无法完成实验，而呼吸频率超过 60 rpm 可能导致镇静不足，从而增加图像数据中的呼吸和运动伪影。

4. 动态细胞行为的4D、基于强度、无标记活体成像设置

  1. 当小鼠被麻醉并牢固地固定在倒置显微镜载物台上后，开始定位感兴趣区域。
  2. 利用照射到显微成像窗（MIW）的光源，通过显微镜目镜识别潜在的观察区域。在软件中添加并保存这些位置的 x、y 坐标，以便后续返回这些位置。
    注意：此类照明方式下，肿瘤的细微结构尚不清晰可见。目标仅为初步识别待进一步研究的区域，重点在于观察血管结构和血流情况。
  3. 在软件中保存多个位置后，使用 890 nm 激发光和 FAD/SHG 滤光片组合预览选定的视野。采用不超过 4 µs 的停留时间，配合较低的激光功率和较高的 PMT 设置。目的是在不过度暴露组织于强激光的前提下预览视野。
  4. 设定合适的激光功率后，设置 z 轴层扫。观察在 MIW 玻璃表面下 20–50 µm 深度处丰富的胶原纤维（SHG 信号）的出现情况。随着显微镜切片深入肿瘤内部，胶原信号将逐渐减少（图 1B）。SHG 信号中的空隙区域即为肿瘤团块所在位置。
  5. 将顶部 z 切片设在单层细胞层下方，即约 50–100 µm 深度处首次出现胶原纤维的位置；将底部 z 切片设在约 250 µm 深度处，此处纤维信号逐渐消失，背景噪声占主导。对所有已保存的 x-y 位置重复此操作。
  6. 设定好 z 轴层扫范围后，增加停留时间（最高至 8 µs），并优化激光功率和探测器设置。根据每次实验需要，调整激发功率以获得最佳组织激发效果。物镜后孔径处使用最高 90 mW（750 nm）或 70 mW（890 nm）的功率属于可接受范围。
    ​注意：成像深度、组织内部散射程度、物镜特性以及探测器灵敏度均会显著影响成像所需功率。
  7. 根据实验目的调整时间间隔。对于大多数活体细胞迁移成像实验，建议初始采集时间间隔设为 10 分钟。
  8. 尽管双光子（2P）激发对细胞和组织较为温和，仍需注意光毒性迹象，例如细胞起泡、自发荧光迅速增强或过度的光漂白现象。一旦出现上述情况，应降低激光功率或延长延时成像的时间间隔。

5. NAD(P)H 的荧光寿命成像 (FLIM)

  1. 在保持延时成像采集的 x-y 位置的同时，设置显微镜以采集荧光寿命成像（FLIM）图像序列。将一个 440/80 滤光片插入位于 GaAsP 探测器前方的滤光片架中，并在软件中将 GaAsP 探测器电压设为 800。当探测器开启时，请关闭室内灯光。
  2. 在软件中，从基于检流计的强度成像模式切换至 FLIM 成像模式。
  3. 为识别和掩蔽血管结构，将分辨率设为 512 × 512 像素；为获取补充性代谢信息，将分辨率设为 256 × 256 像素，以提高寿命信号的时间分辨率。将驻留时间设为 4 µs，并将激光波长调至 750 nm。
  4. 开始预览扫描并调节激光功率。调节激光功率，使恒定分数甄别器（CFD）的读数维持在 1 × 105 至 1 × 106 之间。切勿超过 1 × 106，否则会导致光子堆积，影响整体结果质量。
  5. 设定好激光功率后，将积分时间设为 90 s 至 120 s，并开始 FLIM 数据采集。系统将在指定时间内从视场中采集光子。
  6. 可选步骤：在完成所有必要的数据采集并将小鼠从载物台上移除后，采集仪器响应函数（IRF）。使用与组织成像相同的参数和设置，对玻璃底培养皿中市售尿素晶体表面进行成像，以测量 IRF。
    ​注意：IRF 可反映由电子或光学系统引起的任何延迟或反射。所有 FLIM 采集数据均包含卷积形式的 IRF，通过从数据中去卷积 IRF 可提高计算所得荧光衰减曲线的准确性。尽管如此，在许多情况下，计算得到的 IRF 能够合理地复现实测 IRF 所得衰减曲线的质量。建议在确认计算 IRF 能够提供与实测 IRF 相当的衰减曲线拟合效果并充分逼近其实验结果之前，始终进行实测 IRF 的采集。

NADH 寿命图像的分析

  1. 打开 FLIM 软件并从数据集中导入 NAD(P)H 寿命图像。有关如何正确使用该软件的更多详细信息，请参阅荧光寿命手册（见材料表）。
  2. 首先，在软件中定义模型参数。在菜单栏中，点击 选项 > 模型。选中以下选项：设置 > 多指数衰减，拟合方法 > MLE，空间合并 > 方形，阈值 > 峰值，并勾选 计算图像前固定偏移。
  3. 在菜单栏中，从下拉菜单点击 颜色 > A1%。在窗口右侧，将其定义为三组分拟合。设置 合并大小 > 3。
  4. 调整 阈值 > ~10。在衰减矩阵首次计算完成后，重新评估阈值的准确性。
  5. 将 τ1 固定为 200 ps，代表红细胞的短寿命。尝试找到能与强度图像中较大血管内多个位置最佳匹配的数值。将 τ2 固定为 1200 ps，代表红细胞的长寿命。
    注：所设数值仅为起始点，需进一步优化以更清晰地显示血管结构。在大多数情况下（但并非总是如此），这些数值会有所降低。
  6. 在菜单栏的 计算 下，选择 衰减矩阵。这将生成初始的 A1% 寿命图像，其中血管结构具有较高数值。使用光标（十字准线）悬停于血管结构上，系统地逐一浮动（取消勾选 固定 框）τ1 和 τ2。记录这些数值，以便优化固定参数。
    ​注：目标并非获得图像中最精确的数值，而是最大化血管与组织之间的差异，同时不显著减少被识别为血管的区域面积。
  7. 一旦确定了 τ1 和 τ2 的合适参数，在菜单栏中选择 计算 > 批量处理。确保各 z 层切片之间的大多数设置保持一致。
  8. 务必验证是否存在某个设置明显偏离其他设置。如有，应首先调整偏移量后重试。若问题仍然存在，则使用新参数重新拟合。不正确的偏移可能是拟合噪声的主要来源，并可能导致邻近肿瘤区域的 A1% 值升高。
  9. 在菜单选项中保存文件，然后导出 A1% 文件。将这些文件上传至 ImageJ 进行掩膜和分割处理。

7. 血管系统的图像分割

  1. 打开 ImageJ 并将 A1% 图像作为文本图像导入。对堆栈中的所有图像重复此操作。
  2. 在所有 A1% 图像打开后，选择 图像 > 堆栈 > Z 投影。使用最大强度投影并保存图像。代表性图像见补充数据 1。
  3. 转到 插件 > 分割，选择可训练的WEKA 分割插件38。
  4. WEKA 窗口打开后，使用默认设置，通过创建两个类别并在血管结构（高 A1% 区域）和非血管结构（低 A1% 区域）上绘制线条来开始训练软件。
  5. 继续向两个类别中添加新的轨迹，直到软件能够持续识别血管的高 A1% 区域，同时消除背景噪声中的高信号区域。代表性分类器模型见补充模型。
  6. 生成分类图像后，点击 图像 > 类型 > 8 位。对图像进行阈值化处理并生成掩膜。如果阈值化图像仍需进一步清理，可使用分析粒子功能。
  7. 调整大小和圆度参数，直至排除阈值化图像中较小且呈圆形的区域。最终获得一个仅包含血管结构且背景极少的清晰掩膜。
  8. 点击 编辑 > 选择 > 创建选择。通过点击 分析 > 工具 > ROI 管理器，将选择转移至 ROI 管理器。
  9. 复制分类图像。进入 处理 > 二值化。为扩展掩膜并定义图像分割中包含的距血管的距离，选择膨胀。重复操作直至掩膜扩展至所需范围。在 ROI 管理器中记录该感兴趣区域（ROI）。
    注：此步骤的目的是量化血管特定邻近范围内（例如，距血管 X µm 范围内存在的细胞数量）的数量或行为。所需膨胀程度完全由科学问题决定。
  10. 为量化限制区域内的细胞数量，选择感兴趣的窗口（图像/通道）。该窗口可以是与血管掩膜具有相同视野的任意图像。使用下拉菜单中的XOR功能应用两个 ROI。
    ​注：此操作将测量距血管特定距离内的目标，但排除血管本身。该组合 ROI 方法随后可用于测量多种参数，如强度、细胞数量或迁移情况。

8. 肿瘤巢的图像分割

  1. 在 ImageJ 中打开来自高分辨率强度扫描或 FLIM 采集的 NADH 图像。
    注意：此操作可在单个 z 切片、完整图像栈或少数几个切片的 z 投影上进行。
  2. 转到 插件 > 分割，选择可训练的 WEKA 分割插件。
  3. WEKA 窗口打开后，使用默认设置，开始将软件训练为两个类别：NADH 高信号区域和 NADH 低信号区域。NADH 高信号区域具有明显的细胞及细胞核分布模式，软件可轻松识别。
  4. 持续切换叠加显示，通过额外训练进一步优化算法，直到其能够识别出肉眼判断及基于已知肿瘤形态学所确定的所有肿瘤区域。这是一个迭代过程。
  5. 当算法能够识别所有肿瘤区域后，点击 生成结果 按钮，将生成一幅新图像。复制此图像。
  6. 选择第一幅复制的图像，通过选择 图像 > 类型 > 8 位 将其转换为 8 位图像。对该图像进行阈值处理以生成二值掩膜，然后创建选区并将其导入 ROI 管理器。这些 ROI 将定义间质区域。
  7. 选择第二幅复制的图像，并将其转换为 8 位图像。通过选择 图像 > 编辑 > 反转 对该图像进行反转，然后进行阈值处理以生成二值掩膜。再次创建选区并导入 ROI 管理器。该 ROI 将定义肿瘤巢区域。

9. 按纤维排列或取向进行图像分割

  1. 首先，打开SHG图像，进行任何所需的z轴投影，并评估是否需要预处理。为了获得良好的结果，需要高质量的图像，其中纤维清晰可辨且噪声较低。
  2. 可选：在ImageJ中进行预处理以提高SHG通道的信噪比（SNR），使用滚动球背景扣除法。对于大多数应用，建议使用20像素至50像素之间的滚动球半径。然后对图像进行平滑处理并保存。
  3. 打开OrientationJ插件并设置处理参数。在OrientationJ窗口中，定义局部张量窗口的大小。对于此纤维密度的20倍图像，可将10像素至15像素作为起始值。
  4. 选择Cubic Spline 作为梯度模型，并勾选Color Survey Box。定义颜色调查选项：将Hue 和Saturation 均设为Coherency，将Brightness 设为Original Image，然后点击Run。
  5. 该插件的输出文件为RGB彩色图。调整局部张量窗口的数值，直到人眼判断下取向一致的区域被蓝色和品红色正确高亮显示。
  6. 当输出图像满意后，将此RGB图像拆分为3个通道。选择Image > Color > Split Channel。
  7. 为了增强取向一致区域的外观以便于掩膜生成，使用图像计算器，选择Process > Image Calculator。利用该操作符，用蓝色图像减去绿色图像。若需更严格的掩膜，则用红色图像减去绿色图像。对于随机分布区域，用绿色通道减去蓝色通道。
  8. 使用Moments 算法对所得图像进行阈值分割。在大多数情况下，无需进一步调整，但可根据需要进行微调。这将生成一幅二值图像。
  9. 生成二值图像后，选择Process > Binary > Fill Holes以填充纤维之间的孔洞，并使用中值滤波器使掩膜边界更加圆滑。建议以10的中值滤波器作为起始值，根据数据情况调整至合适效果。手动检查掩膜的准确性，并删除任何错误的感兴趣区域（ROI）。
  10. 当掩膜满意后，选择Edit > Selection > Create Selection创建选区，并将该选区传输至ROI管理器中。

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结果

安装显微成像窗（MIW）并进行基本的实验设计是该过程的第一步。这种特定的MIW设计和方案更适合于纵向研究19，并且已成功应用于直立式和倒置式显微镜。本实验中采用倒置显微镜，因其可获得更稳定的乳腺图像，并减少呼吸伪影。在图1A中，我们提供了刚性MIW的尺寸以及植入过程的示意图。

在无标记的 MMTV-PyMT39 乳腺肿瘤中，典型的视野（图1B-E、图3A）具有高度异质性，包含胶原纤维、大量间质细胞、成团的肿瘤细胞以及脉管系统（图3A）。通常情况下，靠近观察窗区域的胶原纤维更为丰富，而随着肿瘤深度增加，其丰度逐渐降低（图1B-E...

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讨论

4D活体成像是一种强大的工具，可用于研究原位肿瘤微环境中时空背景下的动态生理相互作用。本文提供了一个极为基础且可灵活调整的操作框架，仅利用来自二次谐波生成或NAD(P)H自发荧光的内源性信号，对肿瘤组织内部、邻近间质区域或血管网络附近的动态细胞相互作用进行分区分析。本实验方案提供了从成像窗植入到图像采集、分析与分割的全面、逐步操作方法。我们相信，该技术将有助于建立一个必要的分析框架，用于对4D活体成像数据进行分割与定量分析。

本方案旨在广泛适用于多种活体小鼠模型，包括未标记的PDX模型。PDX模型是一种极具信息价值的模型45，但其本身难以进行遗传操作，因此对活体成像构成了挑战。因此，若能拥有一种仅利用内源性代谢物（如NAD(P)H）和二次谐波生成（SHG）即可在未标记的生理环境中可视化并区分动态相互作用的方法，将具有显著优势。除了适用于PDX模型外，这种多维方法理论上还可应用于任何需要空间与结构背景来回答生理学问题的癌组织或正常组织的活体研究。NAD(P)H的自发荧光和来自胶原纤维的SHG信号普遍存在于所有组织中，是活体成像中一种普适...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢NCI R01 CA216248、CA206458和CA179556基金对本研究的资助。我们还要感谢Kevin Eliceiri博士及其成像团队在我们活体成像项目早期开发过程中提供的专业技术支持。我们还感谢Morgridge研究所Eliceiri制造团队的Ben Cox博士及其他成员，在MIW项目的初期阶段提供了关键的技术设计支持。Ellen Dobson博士在ImageJ可训练WEKA分割工具的使用方面提供了有益的讨论和建议。此外，我们感谢Melissa Skala博士和Alexa Barres-Heaton博士及时提供显微镜设备的使用机会。最后，我们感谢Brigitte Raabe博士（D.V.M）在小鼠操作与护理方面给予的诸多深入讨论和宝贵建议。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
#1.5 12毫米圆形盖玻片Warner Instruments# 64-0712MIW 构建
用于皮下注射的 1.0 mL 注射器BD309659注射器
20倍物镜Zeiss421452-988水浸物镜
用于皮下注射的 27G 针头Covidien1188827012针头
40倍物镜NikonMRD77410水浸物镜
5-0 编织丝线缝合线EthiconK870用于 MIW 植入的缝合线
人工泪液凝胶AkornNDC 59399-162-35眼用凝胶
5% 碘伏溶液Fisher ScientificNC1558063手术消毒剂
棉签Fisher Scientific23-400-101
氰基丙烯酸酯粘合剂Loctite1365882MIW 构建
荧光葡聚糖SigmaT1287-50mg血管系统的静脉内标记
镊子Mckesson.comMiltex #18-782不锈钢，4 英寸，弯曲
GaAsP 光电倍增管Hamamatsu 
加热垫CARA 72 加热板 038056000729温度可调
加热腔室自制
荧光寿命手册Becker and Hicklhttps://www.becker-hickl.com/literature/handbooks
倒置显微镜基座Nikon
异氟烷AkornNDC 59399-106-01麻醉剂
Liqui-Nox 清洁剂Fisher Scientific16-000-125MIW 清洁
美洛昔康NorbrookNDC 55529-040-10镇痛药
微型软管Scientific Commodities INC. BB31695-PE/1
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参考文献

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