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部署社区科学家对稀有蝴蝶种群进行非破坏性遗传取样

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DOI：

10.3791/63416

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2022年10月28日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology and Nematology, University of Florida, 2Florida Museum of Natural History, University of Florida, 3Florida Natural Areas Inventory

本文内容

摘要

本文介绍了一种基于野外采集残余卵碎片的蝴蝶种群非侵入性遗传取样简易方案。该方法可用于确认物种身份并量化遗传变异。此方案可轻松推广至更广泛的类群，适用于公众科学项目的参与。

摘要

全球昆虫数量持续加速下降。为了推进对许多类群的理解并填补现有知识空白，有效的遗传取样至关重要。本方案提供了一种已验证的非破坏性取样方法，用于稀有蝴蝶的种群遗传结构分析或DNA条形码研究。该方法利用孵化后蝴蝶卵的卵壳（绒毛膜）提取DNA，可获得足够数量和质量的DNA，成功进行基因测序，以确认物种身份并量化遗传变异。当其他组织取样技术难以实施或不可行时，该方法尤为适用。尽管该方法最初针对鳞翅目昆虫开发，但也可轻松适用于其他昆虫物种。其设计注重操作简便性，旨在便于不同经验与技能水平的人员广泛实施，例如公众科学家、保护实践工作者及学生，并可在大范围地理区域应用，以促进广泛的种群取样。所生成的数据有助于支持分类学评估与物种名录制定、保护与管理决策，并推动基础生态学研究的深入。

引言

对稀有、数量下降和/或列入保护名录的昆虫类群进行有效的种群遗传学取样，通常对于指导保护和管理措施至关重要。许多遗传分析常规采用致死或损伤性组织取样方法。然而，这些方法往往不理想或不被允许，因为它们可能对现存的脆弱种群造成伤害，或对个体的行为和适应性产生负面影响。已有多种非致死性或非侵入性取样技术被应用于昆虫遗传学研究，所用组织包括完整的腿部、触角或翅片段、幼虫蜕皮、防御性分泌物中的血淋巴，以及其他产物如虫粪1,2,3,4,5,6,7,8,9。这些不同组织取样技术的整体可行性与适用性，因目标生物的生物学特性、生态习性、行为、体型大小、稀有程度以及取样情境和操作人员而存在显著差异。例如，采集完整的腿部或附肢片段需要临时捕捉多个处于合适发育阶段的个体，并由经验丰富的人员进行细致操作。同样，幼虫蜕皮或虫粪等组织来源仅在生物处于人工饲养状态或被暂时圈养足够长时间的情况下才具有实际操作性。

对于在种群水平上提出的研究问题，例如涉及潜在分类学分化或遗传结构的问题，通常需要在更广泛的时间或地理尺度（即区域或大陆尺度）上进行采样。因此，某些非侵入性组织来源可能完全不切实际，或至少在大量采集时效率极低。在此类尺度上开展样本采集，对单个研究人员甚至小型野外团队而言，可能在后勤或经费上均难以实现。尽管科研界 increasingly 采用社区科学家的直接参与来应对其中许多挑战，并推动大数据驱动的样本采集，但在涉及非破坏性、非侵入性或环境DNA（eDNA）采样的研究中，这种模式的应用仍较为有限10,11,12。

为了帮助克服其中一些潜在的局限性，我们已证明，孵化后的蝴蝶卵壳（chorion）能够提供足量且高质量的DNA，可用于成功进行基因测序，以确认物种身份并量化遗传变异。随后，我们利用该技术测试了多种样本采集方案13。这项初步工作为后续方法学的优化奠定了基础。本文详细描述了由此形成的简便而全面的修订版野外采集方案，该方案已面向公众科学家及其他非专业人员推广实施。本方案是针对霜色精灵蝴蝶（Callophrys irus）开展的全分布区种群结构分析的一部分，旨在为未来的保护行动以及美国《濒危物种法案》下可能的列入名录决策提供科学依据。尽管该方法可能比某些非侵入性方法更耗费人力，但由于无需接触活体生物且操作简便，因此具备成为一种可行模型的潜力，可应用于其他针对常见昆虫或受保护关注昆虫的种群遗传学研究项目，特别是那些孵化后若虫或幼虫会遗留卵壳残骸的物种。本文所采用的方案表述专门针对灰蝶科（Lycaenidae）蝴蝶，并面向被定义为公众科学家或其他昆虫学经验有限的人员（例如机构生物学家、实习生）而设计。

方案

1. 向社区科学家分发物资

  1. 仔细查阅并收集完整的材料清单，所需物品请参考完整的材料表。
  2. 若样本采集将在多个地点和/或由多个个人/团队进行，请将所需的所有物品分别整理并组织成独立的可部署单元（图1 和 图2）。
  3. 将物资（可部署单元）运送至负责野外采集的社区科学家或其他工作人员。
  4. 若工作人员不在本地，需将物资（每个可部署单元）仔细打包，分别装入独立的纸板运输箱中，并贴上完整的运输标签后寄送。
    ​注意：此阶段无需加急运输。

2. 社区科学家样本制备

  1. 收到采集用品（包括采集工具箱）后，仔细查阅塑封的用品清单，并进行全面清点。如发现任何物品缺失，须立即通知项目负责人。
  2. 在1.5 mL 微离心管中预先加入180 µL 裂解缓冲液，使用预印唯一编号的标签为每支微离心管贴上标签，并将所有试管放入64孔微离心管储存盒中。装入后务必拧紧盖子。
    注意：若无标签打印机，可使用耐乙醇记号笔在每支离心管的管壁和管盖上标注唯一编号。
  3. 确保所有数码设备（如智能手机或相机）已充满电，并妥善携带备用电池。
  4. 准备一个小型冷藏箱，部分填充冰块，用于野外样本的临时储存及本地运输。
  5. 将所有采集用品装入采集工具箱或类似坚固、防风雨的容器中，以确保运输安全和集中存放。
  6. 在进入野外工作前，详细审阅非破坏性遗传样本采集操作规程。
    注意：野外工作时可参考塑封的简化版图文操作流程图以获得额外指导（补充图S1 和 补充图S2）。

3. 野外样本采集

  1. 到达野外地点后，使用铅笔或防水笔在防水野外记录本中记录当天时间、日期、整个区域名称（例如，阿巴拉契科拉国家森林）、具体野外地点名称或描述、GPS读数（如有），以及所有在场人员的全名和职责。
  2. 寻找具有目标蝴蝶特定幼虫寄主植物的适宜生境。
    注意：应谨慎操作，避免或尽量减少对敏感生境、植物种群和野生动物的影响。此外，在进入地点并开展样本采集活动之前，务必事先获得所有相关土地所有者的许可和/或许可证。
  3. 使用智能手机或相机，对所有野外地点、样本采集位置、寄主植物以及可能与项目相关的其他信息进行详细拍照。使用能够记录GPS坐标的智能手机或其他相机。
    注意：需在所有智能手机上启用照片地理标记功能。
  4. 全面检查已知被成年雌性蝴蝶用于产卵的幼虫寄主植物各部位（如叶片、花芽、花朵或发育中的果实），寻找已孵化的卵。对于大多数灰蝶科（Lycaenidae）种类，应寻找呈白色、中央有明显孔洞、形似甜甜圈的已孵化卵，这是初孵幼虫钻出的位置（图3）。未孵化的卵颜色较深，通常呈绿色或蓝绿色，卵体完整，中央无孔（图4）。使用手持放大镜或其他放大设备仔细检查每一枚卵。
  5. 一旦发现已孵化的卵，立即戴上双层丁腈手套。
  6. 使用洁净、无菌的尖头镊子，夹住已孵化的卵并轻轻从寄主植物上取下，直接放入已预先加入裂解缓冲液并贴好标签的微量离心管中，该缓冲液来自64孔储存盒。
    注意：采集过程中允许少量寄主植物残留物（直径小于15 mm）进入样本，属正常现象。
  7. 每个寄主植物斑块/地点至少采集5个样本（每个样本含1–20枚已孵化卵），若条件允许，单个地点总卵数应争取达到>50枚。
    注意：这有助于确保在每个采样植物/斑块中至少获取部分组织，从而提高检测到DNA的可能性（基于个人观察）。
  8. 每次采集卵后，通过将镊子尖浸入盛有95%乙醇的小瓶中，或用挤压瓶喷洒95%乙醇，或使用酒精擦拭巾，仔细清洁镊子尖端。
    注意：此举有助于最大限度减少取样过程中的组织交叉污染。
  9. 如条件允许，可从同一寄主斑块内的多株植物上采集数枚已孵化卵（1–20枚），合并放入同一个微量离心管中，并牢固盖紧管盖。对于利用较大草本或木本寄主植物的蝴蝶种类，若寄主斑块有限，可在同一植株的不同位置采集多个卵。
    注意：若植物叶片相互接触，则视为同一寄主斑块；若植物或斑块之间存在明显物理间隔，则应视为不同样本。若采集其他类型的组织（如幼虫蜕皮或单条腿），则每个微量离心管中仅放入一条腿、腿片段或一条幼虫蜕皮（每个个体仅一个样本）。
  10. 确保所有采集的材料完全浸没于每个1.5 mL微量离心管的裂解缓冲液中。如有需要，可将管底轻敲硬质表面，使样本重新沉入液体中。
  11. 用干净的一次性实验室擦拭纸将镊子擦干。
    注意：仔细清洁镊子对防止样本间交叉污染至关重要。
  12. 采集新样本时，应丢弃已使用的丁腈手套，并更换为一副干净新手套。
  13. 在防水野外记录本中，使用铅笔或防水笔记录微量离心管上的唯一ID标签编号，以及样本类型（如卵、幼虫蜕皮或腿）、大致已孵化卵数量，以及采集信息，包括采集人姓名、日期、地点、寄主植物物种及任何其他备注（图2）。
  14. 将装有卵残骸样本的封闭微量离心管放回64孔微量离心管储存盒中。
  15. 在野外工作期间，将64孔微量离心管储存盒置于装有冰块的冷藏箱中保存。
  16. 在野外工作期间，将所有其他采集用品统一存放于采集工具箱中，以确保安全、集中地储存和转运至各采样地点。

4. 野外采集完成时

  1. 确保所有含有样品的微量离心管均已放入带冰袋的冷藏箱中的64孔微量离心管储存盒内，以便运输。
  2. 将所有野外采集用品放回采集工具箱中。
  3. 将所有样品运回办公室或实验室，并仔细逐一检查每根微量离心管，确保所有样品材料完全浸没于裂解缓冲液中。
  4. 将装有样品的64孔微量离心管储存盒放入冷冻柜中，直至寄送或进行后续处理。
    注意：短期储存可使用普通商用-18 °C冷冻柜。
  5. 仔细检查采集工具箱中的所有用品，并根据需要及时更换。
    注意：若计划进行多次野外采集活动，此步骤尤为重要。
  6. 将采集工具箱存放于安全位置，以备下次野外采集使用。
  7. 下载所有数字图像，并确保已全部安全备份至服务器或基于云的存储系统中。
  8. 扫描或拍摄记录采集数据的原始防水野外笔记本页面或野外数据表单，直至所有信息均已录入项目电子表格或数据库中。

5. 提交样本和数据

  1. 从冷冻机中取出所有装有样品的64孔微量离心管储存盒。
  2. 将装有样品的64孔微量离心管储存盒以及野外记录本或野外数据表小心地包装进标准运输箱中，贴上附有原始寄件人账号的运输标签，并通过快递服务以隔夜、次日达方式寄送给项目负责人。
  3. 通过电子邮件将包裹的追踪号码以及扫描后的记录本页面或野外数据表副本发送给项目负责人。

6. DNA 提取

  1. 收到64孔微量离心储存盒后，将其在-20 °C下保存，以维持样本中DNA的稳定性，直至准备进行DNA提取。
  2. 在实验室中，将保存于裂解缓冲液中并从-20 °C解冻的昆虫组织进行研磨以提取DNA。加入20 µL蛋白酶K，并将样本置于56 °C加热孵育箱中过夜浸泡，孵育时间不超过24小时。
  3. 根据特定制造商的建议添加相应的清洗和洗涤缓冲液13。
  4. 将悬浮于缓冲液中的样本转移至连接于2 mL收集管的离心柱中。
  5. 使用离心机在6,021 × g条件下离心60秒。加入适当的洗涤缓冲液，并按要求进行离心。
  6. 用30 µL洗脱缓冲液洗脱结合的DNA，并将样本离心至新的1.5 mL微量离心管中。于-20 °C保存。
    ​注意：若DNA浓度超过0.010 ng/mL，则可进行后续测序。不同组织类型的DNA浓度请参见图5。

7. DNA序列的数据分析

  1. 对获得的序列中的低质量碱基进行修剪或编辑。
  2. 将序列与公共数据库进行比对，以确认物种鉴定结果。
  3. 将序列相互比对，以比较个体间的差异。

结果

在2021年当地成虫飞行高峰期前的三个月内，向分布于北美东部物种分布区九个州的八位保护与社区科学家寄送了最多可采集563份样本的材料。截至目前，我们已收到共计160份采集的C. irus组织样本（表1）。基因组DNA的提取按照Storer等人14针对此类样本类型所详细描述的方案进行。在这160份样本中，成功从88份样本中提取到DNA，平均浓度为1.67 ng/μL（标准误 ± 2.98），最高DNA得率为26.8 ng/μL。DNA浓度使用高灵敏度检测试剂盒，按照制造商说明书，取2 µL提取物进行定量。

尽管收到的样本总数远低于实际分发的采集材料总量，但这主要是由于向主要采集者或团队负责人提供了充足的采集材料，以便他们在需要时能够灵活地涵盖多个采集地点和/或纳入多名社区科学家。此外，C. iris 是一种稀有且数量下降的分类群，在其现存分布范围内仅存在数量有限且通常规模较小的种群。尽管存在这一限制，所收到的组织样本总数仍然可观，尤其是与传统的单个成年蝴蝶个体采样相比。

用于色谱溶剂制备的实验室装置，台面上摆放有试剂瓶，用于支持DNA分离。
图1：所有必要物资的独立可部署单元，等待运送给社区科学家或其他负责野外采样的人员。 请点击此处查看此图的放大版本。

用于化学分析的实验室工作区，包括洗瓶和储存盒。
图 2：独立可部署单元，包含所有耗材、透明塑料采样工具箱以及填写完整的快递运输标签，等待寄送给负责野外采样的社区科学家或其他工作人员。 请点击此处查看此图的放大版本。

显微镜下植物上的昆虫卵；宏观成像，昆虫学，植物-昆虫相互作用。
图3：霜色精灵蝶（Callophrys irus）在野生羽扇豆（Lupinus perennis）上的孵化后卵的照片，显示中心有一个明显的孔洞，初孵幼虫由此钻出。 注意，孵化后卵的整体颜色为白色。 请点击此处查看该图的放大版本。

植物芽的特写，显示具毛状体和标尺的结构，标尺为1mm，展示植物发育过程。
图4：霜色精灵灰蝶（Callophrys irus）未孵化卵在野生羽扇豆（Lupinus perennis）上的照片。请注意，未孵化的卵没有明显的中央孔洞，整体颜色呈蓝绿色。请点击此处查看该图的放大版本。

不同组织类型中多杀菌素含量的箱线图，比较卵鞘、腿部和蜕皮中的浓度。
图5：不同组织类型的DNA浓度。 箱体中位线表示中位数，每个箱体范围为四分位距（IQR），箱须范围为1.5 × IQR，超出此范围的点为异常值。含单个卵鞘的样本仅包含一个卵鞘，含多个卵鞘的样本则至少包含两个卵鞘，每份样本卵鞘数量范围为2至20个（平均值 = 5.3）。缩写：IQR = 四分位距。 请点击此处查看该图的放大版本。

州卵囊卵囊数量虫粪腿蜕皮总计
Arkansas22
Florida31072242
Michigan
New Hampshire2461545
New York3030
Ohio
Wisconsin95519
Oklahoma16622
总计3621166522160

表1：各州采集的组织材料数量与类型。

补充图 S1：用于野外工作的双面覆膜、浓缩且带插图的协议首页。 请点击此处下载该文件。

补充图 S2。双面覆膜浓缩图示化操作流程的背面，用于野外工作。 请点击此处下载该文件。

讨论

本方案描述了一种用于无损采集稀有蝴蝶样本以进行种群遗传结构或DNA条形码分析的野外方法。该方案的总体优势在于其设计旨在帮助不同经验与技能水平的人员（如公众科学家、保护实践工作者及学生）广泛实施。这些优势包括总体成本相对较低、所需耗材和设备易于获取、方法简单易行且步骤不过于复杂，以及可在广阔的地理区域内轻松部署。此外，该方法针对的是残留的有机物质，从而无需临时捕捉或操作活体生物，避免了在获取遗传样本过程中可能对生物个体造成的伤害。同时，该方法还将样本采集的潜在时间窗口扩展至传统物候期或特定生活阶段寿命之外，提高了灵活性，增加了总体采样机会，有助于最大化样本数量。

尽管本研究的重点分类群是霜色精灵蝶（一种分布广泛但数量下降的生境特化物种），但该实验方案可更广泛地应用于许多其他昆虫，包括受保护关注的物种。同样，尽管本方案以采集孵化后的卵作为遗传物质来源，但它也可轻松调整用于其他可能更传统的样本（例如腿部、翅碎片段、触角剪切片段），甚至整个生物体。然而，这一方面也是该方案的潜在局限性。尽管绝大多数步骤设计得相对简单且易于快速完成，但全面搜寻幼虫寄主植物斑块以寻找孵化后的卵（单个卵直径通常<1.0 mm）却耗时且劳动密集。尽管如此，这种大规模采样活动特别适合由包括公众科学家在内的更大范围参与者网络来实施。

与其他基于实地的项目一样，充分的准备工作至关重要。这包括对所需物资进行全面清点，以确保没有遗漏任何物品，所有必要的准备工作均已完成，并且物品已妥善整理、安全包装，随时可用于野外作业。此外，所有野外工作人员，特别是负责组织样本采集的人员，应在每次采样活动前详细审阅采集方案，并就任何疑问向项目负责人咨询。到达野外现场后，样本采集环节需要极为细致的操作。这包括准确定位并仔细检查卵囊，确认其已经孵化，因而适合采集；彻底清洁镊子；更换手套以减少不同采样事件之间的组织交叉污染；并确保组织样本完全浸没在每个1.5 mL微量离心管的裂解缓冲液中。最后，准确且详尽的数据记录至关重要，必须将微量离心管上的唯一编号标签与所采集的具体样本及其他所有相关采集信息准确关联。尽管这一步骤在科学研究中属于常规操作，但对于公众科学参与者而言，通常需要对其进行充分说明和反复强调。

本文展示了利用公众科学家对小型、稀有且受威胁物种进行非致死性样本采集的潜在优势。然而，在分析由此产生的遗传数据时，也需注意一些潜在的局限性。例如，虽然将来自同一卵块的样本混合可提高获得足量DNA用于检测的可能性，但也可能引入杂合性。此外，由于该方案涉及采集孵化后卵的卵壳，因此在一个种群中仅能对代表亲代DNA的雌性蝴蝶进行采样。尽管如此，由于此前尚无关于C. irus的种群水平遗传数据，本研究所获得的见解将仅有助于该物种的保护与管理。例如，尽管要充分评估种群结构仍需周密详细的研究设计和谨慎的分子标记选择，但本文所述的采样方案结合细胞色素c氧化酶亚基1（CO1）DNA条形码技术，可用于检测稀有或濒危分类单元的存在。Storer 等人14已对本文所述非致死采样所获得DNA测序的应用价值进行了进一步讨论。

除了采集样本用于遗传分析这一主要目标外，该方案还强调参与者应对所有野外地点、采集位置、存在的幼虫寄主植物以及周围栖息地中可能相关的其他要素进行详细的数码拍照记录。此类文档有助于提供总体的生境评估，可用于说明现有地点状况，例如植物物候、寄主资源密度以及管理历史（如近期的计划火烧）。这类信息对于在较长时间范围内采集野外样本的项目尤为有用，可实现更详细的环境比较。

最后，随着全球昆虫数量持续加速下降，迫切需要加强物种评估和监测工作15,16。通过社区科学家、学生（例如美国鱼类及野生动物管理局的实习生和研究员）以及保护实践者的更广泛参与，为收集包括DNA样本在内的多种类型数据提供了日益可行的途径。因此，本方案所产生的数据具有多种可能用途，包括为保护行动（如规划、恢复和管理）、物种名录决策或物种状况评估，以及生态学、种群学和分类学研究提供科学依据。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者谨此感谢 David Cuthrell、Amanda Dillon、Steve Fuller、Neil Gifford、Heidi Holman、Dean Jue、Sally Jue、Daniel Kennedy、Genevieve Kozak、Rebecca Longenecker、Maureen McClung、Matt Moran、Robin Niver、Brenda Smith、Hunter Trowbridge 和 Jessup Weichelt 在项目各个环节中提供的帮助，包括后勤、协调、许可申请和/或样本采集。本研究由美国鱼类及野生动物管理局（联邦资助编号 F20AC00356）通过野生动物管理研究所（资助编号 SA 2021-01）提供的资助支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
14夸脱Igloo Playmate冷藏箱亚马逊NA便携式冷藏箱
每个可部署单元数量：1 个冷藏箱
250 个 DNeasy Mini 离心柱、蛋白酶 K、缓冲液、收集管（2 mL）Qiagen69506Qiagen DNeasy 血液 & 组织试剂盒
每个可部署单元的数量：NA
Andwin Scientific 供应商多元化合作伙伴 LAB MARKERS 黑色FisherSciNC9280166乙醇防伪实验标记笔
每个可部署单元的数量：2 个标记物
纸板运输箱运输箱
每个可部署单元的数量：根据需要
Eisco 聚乙烯洗瓶，低密度聚乙烯FisherSciS14091实验室级喷雾瓶或挤压瓶（用于乙醇或酒精）
每个可部署单元的数量：1 瓶
FedEx 美国快递运单FedExNA退货邮寄标签
每个可部署单元的数量：2 个标签
Fisherbrand Premium 微量离心管：1.5 mLFisherSciNC9386261无菌 1.5 mL 微型离心管
每个可部署单元的数量：128 个管
镊子，#4a，尖端极细但格外坚固（33 mm），4-3/8" （111 毫米）长Bioquip4523直头镊子
每个可部署单元用量：2 把直头镊子
镊子，#7，弯曲尖端（13 mm），极细尖，4-1/2" （114 毫米）长Bioquip4527弯头镊子
每个可部署单元的数量：2 把弯头镊子
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes 细致任务擦拭纸，单层FisherSci06-666AKimWipes（或其他无菌擦拭纸）
每个可部署单元的数量：1 盒
层压式图解野外采集方案无NA简略版实验方案
每个可部署单元的数量：1 份方案
材料清单（覆膜版）NANA供应清单
每个可部署单元的数量：1 个列表
Lily Sugar 'N Cream 原味纯色纱线，2.5 盎司，中等 4 号支数，100% 棉 — 亮粉色 — 可机洗 &和干燥亚马逊NA粉红色纱线（用于固定在镊子上以提高可见度）
每个可部署单元的数量：2 码
Loupe by Bausch & Lomb，10倍 Coddington 放大镜亚马逊NA手持放大镜
每个可部署单元的数量：2个手持放大镜
MyGift 透明塑料双层托盘收纳盒/带顶部提手急救携带箱 && Latch Lock亚马逊NA供应储存盒
每个可部署单元的数量：1 盒
腈类一次性手套，L号，无粉，掌部厚度2.8 milGrainger60NU14腈类实验手套（大号）
每个可部署单元数量：1 盒
腈类一次性手套，M 码，无粉，掌部厚度 2.8 milGrainger60NU13腈类实验手套（中号）
每个可部署单元的数量：1 盒
Qiagen, Inc. BUFFER ATL（200 mL）Qiagen19076Qiagen ATL 裂解缓冲液
每个可部署单元的数量：180 µ每管；128 管
Rite In The Rain 防水侧螺旋笔记本，黄色封面，通用页面样式（No. 373-MX），11 x 8.75 x 0.5亚马逊NA防风雨野外记录本
每个可部署单元的数量：1 本笔记本
Showgard 专业邮票镊子 6" 904 圆头镊子亚马逊NA6" 尖头镊子
每个可部署单元的数量：2 把长柄铲形镊子
Texwipe PolySat 预浸湿擦拭巾FisherSci18-366-231酒精棉片
每个可部署单元数量：100 片湿巾
Thermo Scientific CryoBoxesFisherSci12-565-22764 孔微量离心管收集/储存盒
每个可部署单元的数量：2 盒
         包装材料
每个可部署单元的用量：根据需要

参考文献

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