禽类胚胎的绒毛尿囊膜（CAM）是多种研究领域的有用且适用的工具。一种特殊的日本鹌鹑（Japanese quail）CAM ex ovo 模型适用于光动力治疗的研究。
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本文内容
摘要
摘要
禽类胚胎的绒毛尿囊膜（chorioallantoic membrane, CAM）是一种薄而位于胚胎外的膜结构，主要作为呼吸器官发挥作用。其特性使其成为研究血管生成、肿瘤生长、药物递送系统以及光动力诊断（PDD）和光动力治疗（PDT）的理想 in vivo 实验模型。同时，该模型也满足了以合适替代方法取代实验动物的需求。Ex ovo 培养的胚胎便于物质施加、操作、监测和记录。最常使用的是鸡的CAM；然而，本文重点阐述日本鹌鹑CAM作为低成本、高通量模型的优势。另一个优势在于其较短的胚胎发育周期，可实现更高的实验周转率。本文探讨了日本鹌鹑CAM在癌症及微生物感染的光动力诊断与治疗中的适用性。例如，描述了将光敏剂金丝桃素与脂蛋白或纳米颗粒结合用作递送系统的方法。通过白光下的图像评估损伤评分，并结合紫光（405 nm）照射下CAM组织荧光强度的变化，同时对组织学切片进行分析。结果显示，鹌鹑CAM能清晰反映PDT对血管系统和组织的影响。此外，还可观察到毛细血管出血、血栓形成、小血管溶解以及大血管出血等变化。日本鹌鹑CAM是一种有前景的 in vivo 模型，适用于光动力诊断与治疗研究，在肿瘤血管生成以及抗血管和抗微生物治疗研究中具有广泛应用潜力。
引言
鸡的绒毛尿囊膜（CAM）模型在多个研究领域中广为人知并被广泛应用。它是一种富含血管的胚外器官，负责气体交换和矿物质转运1。由于该膜具有透明性和易于接近的特点，可实时观察单个血管及其结构变化2。尽管具有诸多优势，鸡CAM也存在一些局限性（例如需要较大的饲养设施、产蛋量和饲料消耗），而使用其他鸟类物种可避免这些问题。本实验方案描述了一种利用日本鹌鹑（Coturnix japonica）胚胎的替代性ex ovo CAM模型。由于其体型较小，该模型可容纳比鸡CAM多得多的实验个体。此外，鹌鹑胚胎仅需16天即可完成胚胎发育，这是另一项优势。鹌鹑CAM上首次出现较大型血管的时间为胚胎发育第7天（ED7）。这一阶段可直接与鸡胚胎发育阶段（4–35期）相对应；然而，后期发育阶段已不再完全对应，且鹌鹑胚胎所需时间更短3。值得注意的是，鹌鹑CAM中微血管分支的出现规律与鸡CAM相似4,5,6。此外，鹌鹑性成熟快、产蛋率高、养殖成本低等特点也进一步支持该实验模型的应用7。
鸡胚尿囊膜（CA....
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方案
该研究遵循机构指南进行。所有设备和试剂必须经过高压灭菌或使用70%乙醇或紫外光灭菌。
1. 卵的孵化
- 将受精的鹌鹑蛋在10-15 °C条件下储存，时间不超过4-5天，然后开始孵化。仅使用清洁且无破损的蛋。
- 在强制通风孵化箱中孵化蛋，时间约为53-54小时。将蛋水平放置，关闭蛋的翻转功能，孵化温度为37.5 °C，湿度为50%-60%。
2. 体外孵化 培养物制备
注意：初次孵育后，卵即可用于实验起始 体外 培养
- 用70%乙醇对蛋表面进行消毒，不要旋转蛋。
- 在无菌超净工作台中，使用小型无菌手术剪刀打开蛋壳，并将内容物转移至6孔培养板中。若操作得当，胚胎将位于未受损的蛋黄表面。每次操作后，均需用70%乙醇对剪刀进行消毒。
- 向6孔板的孔间空隙中加入约5 mL无菌水，以维持湿度，防止绒毛尿囊膜（CAM）干燥。
- 将胚胎置于培养箱中孵育，直至进行后续实验，期间保持37 °C温度和80%-90%的湿度。
- 当绒毛尿囊膜（CAM）完全发育后（自ED7起），将一个已灭菌的硅胶环（直径6 mm，厚度约1.5 mm）放置在CAM....
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结果
肿瘤在CAM表面的白光下定位较为困难。光动力诊断（PDD）中使用的光敏剂（此处为金丝桃素）可被肿瘤选择性摄取，有助于实现肿瘤的可视化。加入金丝桃素并使用荧光光源（例如405 nm）后，能够清晰显示肿瘤（鳞状细胞癌TE1）的位置。图6A）。组织学分析显示，活的肿瘤细胞侵入健康组织。可见鳞状细胞癌组织中常见的异常鳞状细胞同心结构（角蛋白珠）。图6B肿瘤的生长伴随水肿和膜增厚。
图6：在CAM表面生长的鳞状细胞癌.......
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讨论
要成功进行ex ovo培养，必须严格遵循上述实验方案。此外，若打开鸡蛋时操作不够小心，或在培养过程中湿度过低，卵黄囊容易黏附于蛋壳并经常发生破裂。在鸡蛋孵化约60小时时开始ex ovo培养，可确保胚胎具有较高的存活率，因为此时胚胎已发育至足够大，能够耐受操作处理。而在较晚的发育阶段，尿囊绒毛膜（CAM）会变薄并黏附于蛋壳，导致膜结构破裂。
从孵育第7天开始，胚胎对震荡的敏感性降低；CAM区域几乎覆盖了孔板的整个表面，已准备好进行后续实验。尽管死亡的胚胎可能存在感染风险，但在至少半无菌条件下采用正确的操作方法时，不会影响6孔板中其他存活的胚胎。鹌鹑胚胎的存活率 体外 本实验中胚胎的存活率约为80%，相较于鸡胚具有明显优势。 体外孵化 实验25,26,27.
在目前的实验中，.......
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致谢
本工作由 VEGA 2/0042/21 和 APVV 20-0129 项目资助。V. Huntošová 的贡献来自项目实施：医学现代跨学科研究的开放科学社区（简称：OPENMED），ITMS2014+：313011V455，由综合基础设施运行计划资助，资金来源于欧洲区域发展基金（ERDF）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 6孔细胞培养板 | Sarstedt | 83.392 | 透明聚苯乙烯，无菌 |
| CO2 培养箱 ESCO CCL-0508 | ESCO, 新加坡 | CCL-050B-8 | CO2 细胞培养用培养箱 |
| Leica CM 1800 冷冻切片机 | Reichert-Jung, 美国 | ||
| 佳能 EOS 6D II 数码相机 | 佳能, 日本 | ||
| 405 nm 二极管激光器 | Ocean Optics, 美国 | ||
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | 二甲基亚砜 |
| 伊红 | Sigma-Aldrich | 15086-94-9 | |
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| 2号细毛刷 | Faber-Castell | 281802 | 用于CAM分离和操作的毛刷 |
| 戊二醛 | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
| 苏木精 | Sigma-Aldrich | 517-28-2 | |
| 金丝桃素 | Sigma-Aldrich | 84082-80-4 | |
| Bios Midi 培养箱 | Bios Sedl any, 捷克共和国 | 用于初始孵育的强制通风培养箱 | |
| Memmert IF160 培养箱 | Memmert, 德国 | 用于CAM孵育的强制空气循环培养箱 | |
| Kaiser slimlite plano LED光源灯箱 | Kaiser, 德国 | 2453 | 透射式照明器 |
| 405 nm LED光源 | 定制圆形LED光源 | ||
| 佳能 MP-E 65 mm f/2.8 微距镜头 | 佳能, 日本 | ||
| Kapa 2000 显微镜 | Kvant, 斯洛伐克 | 光学显微镜 | |
| Auxilab 508 轮转式切片机 | Auxilab, 西班牙 | 手动轮转式切片机 | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | |
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | 组织包埋用石蜡介质 |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | 磷酸盐缓冲液 |
| Castroviejo 眼科剪 | Orimed | OR66-108 | 用于CAM分离的显微剪刀 |
| ImageJ 1.53 软件 | 公共领域 | 图像处理与分析程序 | |
| HDL 储存液 | Sigma-Aldrich | 437641-10MG | 高密度脂蛋白 |
| LDL 储存液 | Sigma-Aldrich | 437644-10MG | 低密度脂蛋白 |
| Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂 | Sakura Finetek | 4583 | 最佳切割温度复合物，118 mL 挤压瓶 |
参考文献
- Nowak-Sliwinska, P., van Beijnum, J. R., van Berkel, M., vanden Bergh, H., Griffioen, A. W. Vascular regrowth following photodynamic therapy in the chicken embryo chorioallantoic membrane. Angiogenesis. 13 (4), 281-292 (2010).
- van Leengoed, H. L. L. M., vander Veen, N., Versteeg, A. A. C., Ouellet, R., van Lier, J. E., Star, W. M.
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重印与许可
