鹌鹑绒毛尿囊膜——光动力诊断与治疗的工具

摘要

禽类胚胎的绒毛尿囊膜（CAM）是多种研究领域的有用且适用的工具。一种特殊的日本鹌鹑（Japanese quail）CAM ex ovo 模型适用于光动力治疗的研究。

摘要

禽类胚胎的绒毛尿囊膜（chorioallantoic membrane, CAM）是一种薄而位于胚胎外的膜结构，主要作为呼吸器官发挥作用。其特性使其成为研究血管生成、肿瘤生长、药物递送系统以及光动力诊断（PDD）和光动力治疗（PDT）的理想 in vivo 实验模型。同时，该模型也满足了以合适替代方法取代实验动物的需求。Ex ovo 培养的胚胎便于物质施加、操作、监测和记录。最常使用的是鸡的CAM；然而，本文重点阐述日本鹌鹑CAM作为低成本、高通量模型的优势。另一个优势在于其较短的胚胎发育周期，可实现更高的实验周转率。本文探讨了日本鹌鹑CAM在癌症及微生物感染的光动力诊断与治疗中的适用性。例如，描述了将光敏剂金丝桃素与脂蛋白或纳米颗粒结合用作递送系统的方法。通过白光下的图像评估损伤评分，并结合紫光（405 nm）照射下CAM组织荧光强度的变化，同时对组织学切片进行分析。结果显示，鹌鹑CAM能清晰反映PDT对血管系统和组织的影响。此外，还可观察到毛细血管出血、血栓形成、小血管溶解以及大血管出血等变化。日本鹌鹑CAM是一种有前景的 in vivo 模型，适用于光动力诊断与治疗研究，在肿瘤血管生成以及抗血管和抗微生物治疗研究中具有广泛应用潜力。

引言

鸡的绒毛尿囊膜（CAM）模型在多个研究领域中广为人知并被广泛应用。它是一种富含血管的胚外器官，负责气体交换和矿物质转运¹。由于该膜具有透明性和易于接近的特点，可实时观察单个血管及其结构变化²。尽管具有诸多优势，鸡CAM也存在一些局限性（例如需要较大的饲养设施、产蛋量和饲料消耗），而使用其他鸟类物种可避免这些问题。本实验方案描述了一种利用日本鹌鹑（Coturnix japonica）胚胎的替代性ex ovo CAM模型。由于其体型较小，该模型可容纳比鸡CAM多得多的实验个体。此外，鹌鹑胚胎仅需16天即可完成胚胎发育，这是另一项优势。鹌鹑CAM上首次出现较大型血管的时间为胚胎发育第7天（ED7）。这一阶段可直接与鸡胚胎发育阶段（4–35期）相对应；然而，后期发育阶段已不再完全对应，且鹌鹑胚胎所需时间更短³。值得注意的是，鹌鹑CAM中微血管分支的出现规律与鸡CAM相似^4,5,6。此外，鹌鹑性成熟快、产蛋率高、养殖成本低等特点也进一步支持该实验模型的应用⁷。

鸡胚尿囊膜（CAM）模型常用于光动力疗法（PDT）研究⁸。PDT可用于治疗多种癌症（局部小肿瘤）及其他非肿瘤性疾病。其原理是将一种荧光药物——光敏剂（PS）递送至病变组织，并用适当波长的光进行激活。目前研究中一种有前景的光敏剂是金丝桃素（hypericin），最初从药用植物贯叶连翘（Hypericum perforatum）中分离得到⁹。该化合物强烈的光敏化效应基于其光化学和光物理特性，其特征是在400–600 nm范围内存在多个荧光激发峰，可诱导约600 nm处的荧光发射。金丝桃素在光谱范围内的吸收峰位于540–590 nm之间，荧光发射峰则位于590–640 nm之间⁹。为实现上述光敏化效应，局部给药后通常采用波长为405 nm的激光激发金丝桃素¹⁰。在光照条件下，金丝桃素可表现出抗病毒、抗增殖和细胞毒性作用¹¹，且无系统性毒性，并能迅速从机体排出。金丝桃素是一种亲脂性物质，易形成不溶于水且无荧光的聚集体，因此常采用多种类型的纳米载体（如聚合物纳米颗粒^12,13，或高密度与低密度脂蛋白（HDL、LDL）^14,15）以促进其递送及进入细胞。由于CAM本身为天然免疫缺陷系统，肿瘤细胞可直接植入膜表面。该模型也适用于根据既定评分标准记录PDT诱导的血管损伤程度^16,17。相较于PDT，较低强度的光照可用于光动力诊断（PDD）。在紫光LED激发下观察组织时，同样会引起光敏剂的光激活^18,19,20，从而发射荧光，但所提供的能量不足以引发PDT反应或造成细胞损伤。因此，该方法是肿瘤可视化、诊断以及监测所用光敏剂药代动力学的良好工具^14,15。

本文描述了鹌鹑的制备方法 体外 CAM实验的存活率超过80%。这 体外 该培养方法已成功应用于大量实验中。

方案

该研究遵循机构指南进行。所有设备和试剂必须经过高压灭菌或使用70%乙醇或紫外光灭菌。

1. 卵的孵化

1. 将受精的鹌鹑蛋在10-15 °C条件下储存，时间不超过4-5天，然后开始孵化。仅使用清洁且无破损的蛋。
2. 在强制通风孵化箱中孵化蛋，时间约为53-54小时。将蛋水平放置，关闭蛋的翻转功能，孵化温度为37.5 °C，湿度为50%-60%。

2. 体外孵化 培养物制备

注意：初次孵育后，卵即可用于实验起始 体外 培养

1. 用70%乙醇对蛋表面进行消毒，不要旋转蛋。
2. 在无菌超净工作台中，使用小型无菌手术剪刀打开蛋壳，并将内容物转移至6孔培养板中。若操作得当，胚胎将位于未受损的蛋黄表面。每次操作后，均需用70%乙醇对剪刀进行消毒。
3. 向6孔板的孔间空隙中加入约5 mL无菌水，以维持湿度，防止绒毛尿囊膜（CAM）干燥。
4. 将胚胎置于培养箱中孵育，直至进行后续实验，期间保持37 °C温度和80%-90%的湿度。
5. 当绒毛尿囊膜（CAM）完全发育后（自ED7起），将一个已灭菌的硅胶环（直径6 mm，厚度约1.5 mm）放置在CAM表面的小毛细血管处。放置环时应避开主要血管。
   注：该环用于界定操作区域，标记物质施加的位置，并防止液体外溢。
6. 根据所在国家的法律法规终止胚胎培养。
7. 重要提示：操作过程中应佩戴手套或使用70%乙醇对双手进行消毒。使用真空吸管移除发育异常的胚胎或未受精蛋。

图 1：体外 培养制备流程。（A）日本鹌鹑蛋的储存与孵化状态。（B）使用乙醇对蛋壳表面进行消毒。（C）用剪刀剪开蛋壳。（D）将蛋内容物倒入培养孔中。（E）正确制备的3日龄胚胎，可见发育中的尿囊膜血管系统。（F）培养板置于培养箱中保存。请点击此处查看该图的高清版本。

图 2：放置胚胎和硅胶环的6孔培养板。 请点击此处查看该图的放大版本。

3. 肿瘤细胞接种

注意：所有操作步骤均需使用无菌层流柜。

1. 根据各自的培养方案，在培养瓶中培养不同类型的贴壁细胞。
   1. 从培养瓶中移除旧的培养基，并用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞层，以去除培养基残留物。
   2. 消化后，通过加入培养基终止胰蛋白酶作用，并将细胞收集至离心管中。离心后，将细胞沉淀重悬于新鲜培养基中。计数细胞，并将其以所需浓度重悬于细胞培养基中。
      注：也可采用例如悬滴法等方法制备三维细胞培养物（即类球体）²¹。
2. 将 1 × 10⁵–1 × 10⁶ 个肿瘤细胞或 5–15 个类球体（每个CAM）溶于 30 µL 细胞培养液中，接种至CAM表面的硅胶环内。
   注：接种体积取决于所用硅胶环的大小。若使用直径较大的硅胶环，则需更大体积以覆盖整个区域。根据细胞类型或不同实验需求，可使用不同的细胞浓度。有时可通过轻微刮擦CAM以增强包埋细胞的黏附性。
3. 将接种细胞后的CAM放回培养箱（37 °C，80%–90% 湿度）中继续培养。

图 3：肿瘤接种于绒毛尿囊膜（CAM）。（A）用移液器吸取类球体，以及（B）在 CAM 表面进行移植。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 光敏剂的应用

1. 应用金丝桃素
   1. 在弱光条件下，用100%二甲基亚砜（DMSO）溶解金丝桃素，配制2 mM的储备液。实验前用无菌PBS或生理盐水现配79 µM的工作液。确保所有溶液中DMSO的终浓度始终低于0.2%，该浓度不会影响胚胎发育。
   2. 在无菌条件下，将适量的金丝桃素溶液加入硅胶环中。30 µL的体积足以填充直径为6 mm的硅胶环。
   3. 将胚胎置于37 °C、80%-90%湿度的培养箱中孵育。金丝桃素在水溶液中进入组织并发生单体化后具有光敏活性，通常在施加于绒毛尿囊膜（CAM）约3小时后产生光敏作用。
2. 以LDL、HDL或纳米颗粒作为递送系统应用金丝桃素
   注：这些递送系统用于增强金丝桃素进入细胞及细胞结构的渗透性。
   1. 由于金丝桃素具有光敏性，所有操作步骤（包括溶液配制）均应在弱光下进行，且溶液需避光保存。
   2. 根据文献¹⁵，通过在PBS中混合适量的脂蛋白与金丝桃素储备液，制备金丝桃素-LDL和金丝桃素-HDL制剂。LDL或HDL与金丝桃素的浓度比为20:1¹⁵。
   3. 根据文献^12,13，通过活性阳离子开环聚合反应合成聚合物纳米颗粒。用PBS调节聚合物纳米颗粒中金丝桃素的浓度至10 μM^12,13。

5. PDD 与 PDT

1. 进行 PDD
   1. 在无菌条件下，将光敏剂（金丝桃素、载金丝桃素的聚合物纳米颗粒或含载脂蛋白载体的金丝桃素）施加于 CAM 表面，可选择性地加入或不加入肿瘤细胞（ED 7-9）。
   2. 使用紫光激发光源（波长为 405 nm 的定制环形 LED 光源）照射 CAM，并在施加金丝桃素后 0、1、3、5、24 和 48 小时的时间点，用数码相机记录 CAM 组织及肿瘤细胞中金丝桃素的荧光信号。
   3. 若研究需要获取 CAM 在白光下的图像，应在施加金丝桃素前以及实验结束前（组织固定前不久）进行记录，因为光照会影响金丝桃素的光活化。
   4. 使用图像处理与分析软件（例如 ImageJ²²）评估荧光强度。
      1. 将 RGB 图像通道拆分为独立的红、绿、蓝图像。以 8 位格式分析红色强度图像。通过环形区域内的红色强度近似代表金丝桃素的荧光强度。在施加金丝桃素后的不同时间点（即从给药后 0 小时至 48 小时），获取整幅图像的轮廓图（使用 ImageJ 的 Profile Plot 插件）。
2. 进行 PDT
   1. 在施加金丝桃素至少 3 小时后进行光动力治疗（PDT）。
   2. 将光纤置于 CAM 表面上方，使激光光束覆盖硅胶环内的全部区域。
   3. 使用波长为 405 nm 的激光，以 285 mW/cm² 的能量密度率进行 in vivo 照射（1-2 分钟）。
   4. 在光动力治疗前后（24 小时和 48 小时），分别使用白光和 405 nm 荧光光照射记录 CAM 图像。
   5. 通过白光下拍摄的图像，在 PDT 后 24 小时和 48 小时检测光损伤情况。通过半定量评分系统¹⁶评估血管损伤：1 — 无破坏；2 — 毛细血管（直径 ≤10 µm）部分闭合，中等或较大血管（直径 ≥50 µm）及较小血管（直径 10-50 µm）未受破坏；3 — 较小血管部分闭合，毛细血管消失；4 — 较大血管部分闭合，较小血管和毛细血管消失；5 — 完全光凝血，大多数血管消失。

图 4：使用激光照射处理 CAM。 本图片仅用于示意。进行 PDD 或 PDT 时，房间必须保持黑暗。请点击此处查看此图的放大版本。

6. 准备鸡胚尿囊膜以进行进一步评估

1. 石蜡包埋
   1. 在培养皿中用含4%多聚甲醛（PFA）的PBS固定CAM组织，固定时间至少2小时，最长可过夜。
   2. 移除PFA，用镊子小心地从硅胶环内切割出CAM组织的一部分。
   3. 立即按以下步骤进行梯度酒精脱水：将CAM组织依次置于70%乙醇中3分钟，伊红溶液中2分钟（便于在石蜡块中定位组织），96%乙醇中3次，每次5分钟（每次均需更换新的培养皿），100%乙醇中5分钟，二甲苯中2次，每次10分钟。
   4. 使用刮勺或细毛刷，尽快将样品转移至培养皿中熔化的石蜡（59 °C）中。24小时后，将组织放入组织学模具中，加入石蜡包埋介质，置于冰箱中使其凝固。从包埋介质中取出凝固的CAM组织，将其在模具中旋转90°，再次填充包埋介质，再次使其凝固。
   5. 使用切片机切取5–10 µm厚的切片，用于组织病理学分析，以评估光动力治疗（PDT）引起的损伤。
2. 制备冷冻CAM切片用于组织学
   注：对于包括组织学在内的某些方法，使用冷冻切片机（冰冻切片机）制备的冷冻切片更为合适。请按以下步骤制备冷冻CAM切片。
   1. 将未经处理或经4%多聚甲醛固定的CAM小心地贴附在载玻片上。
   2. 在包埋模具中加入约一半体积的最佳切割温度化合物（OCT），并在液氮或干冰与乙醇的混合物中冷冻。
   3. 冷冻后，小心倾斜并滑动，将CAM从载玻片上转移至已冷冻的OCT介质表面。再次放入模具中，覆盖OCT介质，并按照步骤6.2.2再次冷冻。
3. 鹌鹑CAM的分形分析
   注：可通过计算分形维数系数来评估光动力治疗（PDT）引起的血管结构变化¹⁹。
   1. 在层流柜中，向培养皿中的CAM加入预热至37 °C的固定液（含4%多聚甲醛和2%戊二醛的PBS溶液）进行过量固定。
   2. 48小时后移除固定液，使用显微剪刀和细毛刷小心地将CAM从胚胎上分离，并用PBS洗涤。
   3. 将洗涤后的CAM贴附于载玻片上，使其缓慢干燥。
   4. 使用数码相机和透射光源（提供均匀白光）拍摄载玻片图像。
   5. 使用ImageJ软件²²处理数字图像。分析时，从远端动脉分支区域选择一个512 × 512像素的正方形区域。对图像进行二值化和骨架化处理，并按照参考文献³¹所述方法计算分形维数系数（Df）。
4. CAM组织的分子分析
   1. 用于分子分析时，小心分离未经处理的CAM组织，液氮中速冻，并在-80 °C下保存。
   2. 根据RNA提取²³、逆转录合成cDNA以及定量PCR²⁴的标准操作流程测定基因表达水平。

图 5：用于分形分析的 CAM 组织。 PDT 后，CAM 组织被固定，置于载玻片上，并干燥以进行分形分析。该图像使用透射照明器在白光下拍摄。 请点击此处查看此图的放大版本。

结果

肿瘤在CAM表面的白光下定位较为困难。光动力诊断（PDD）中使用的光敏剂（此处为金丝桃素）可被肿瘤选择性摄取，有助于实现肿瘤的可视化。加入金丝桃素并使用荧光光源（例如405 nm）后，能够清晰显示肿瘤（鳞状细胞癌TE1）的位置。图6A）。组织学分析显示，活的肿瘤细胞侵入健康组织。可见鳞状细胞癌组织中常见的异常鳞状细胞同心结构（角蛋白珠）。图6B肿瘤的生长伴随水肿和膜增厚。

图6：在CAM表面生长的鳞状细胞癌...

讨论

要成功进行ex ovo培养，必须严格遵循上述实验方案。此外，若打开鸡蛋时操作不够小心，或在培养过程中湿度过低，卵黄囊容易黏附于蛋壳并经常发生破裂。在鸡蛋孵化约60小时时开始ex ovo培养，可确保胚胎具有较高的存活率，因为此时胚胎已发育至足够大，能够耐受操作处理。而在较晚的发育阶段，尿囊绒毛膜（CAM）会变薄并黏附于蛋壳，导致膜结构破裂。

从孵育第7天开始，胚胎对震荡的敏感性降低；CAM区域几乎覆盖了孔板的整个表面，已准备好进行后续实验。尽管死亡的胚胎可能存在感染风险，但在至少半无菌条件下采用正确的操作方法时，不会影响6孔板中其他存活的胚胎。鹌鹑胚胎的存活率 体外 本实验中胚胎的存活率约为80%，相较于鸡胚具有明显优势。 体外孵化 实验^25,26,27.

在目前的实验中，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6孔细胞培养板	Sarstedt	83.392	透明聚苯乙烯，无菌
CO2 培养箱 ESCO CCL-0508	ESCO, 新加坡	CCL-050B-8	CO2 细胞培养用培养箱
Leica CM 1800 冷冻切片机	Reichert-Jung, 美国
佳能 EOS 6D II 数码相机	佳能, 日本
405 nm 二极管激光器	Ocean Optics, 美国
DMSO	Sigma-Aldrich	67-68-5	二甲基亚砜
伊红	Sigma-Aldrich	15086-94-9
乙醇	Sigma-Aldrich	64-17-5
2号细毛刷	Faber-Castell	281802	用于CAM分离和操作的毛刷
戊二醛	Sigma-Aldrich	111-30-8
苏木精	Sigma-Aldrich	517-28-2
金丝桃素	Sigma-Aldrich	84082-80-4
Bios Midi 培养箱	Bios Sedlany, 捷克共和国		用于初始孵育的强制通风培养箱
Memmert IF160 培养箱	Memmert, 德国		用于CAM孵育的强制空气循环培养箱
Kaiser slimlite plano LED光源灯箱	Kaiser, 德国	2453	透射式照明器
405 nm LED光源			定制圆形LED光源
佳能 MP-E 65 mm f/2.8 微距镜头	佳能, 日本
Kapa 2000 显微镜	Kvant, 斯洛伐克		光学显微镜
Auxilab 508 轮转式切片机	Auxilab, 西班牙		手动轮转式切片机
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	30525-89-4
Paraplast Plus	Sigma-Aldrich	P3683	组织包埋用石蜡介质
PBS	Sigma-Aldrich	P4417	磷酸盐缓冲液
Castroviejo 眼科剪	Orimed	OR66-108	用于CAM分离的显微剪刀
ImageJ 1.53 软件	公共领域		图像处理与分析程序
HDL 储存液	Sigma-Aldrich	437641-10MG	高密度脂蛋白
LDL 储存液	Sigma-Aldrich	437644-10MG	低密度脂蛋白
Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂	Sakura Finetek	4583	最佳切割温度复合物，118 mL 挤压瓶