微型计算机断层扫描（Micro-CT）是一种非破坏性工具，可用于三维分析植物结构。本实验方案描述了利用微型计算机断层扫描分析寄生植物结构与功能所需的样品制备方法。通过使用不同物种，展示了该方法在结合特定样品制备技术时的优势。
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摘要
摘要
微型计算机断层扫描（Micro-CT）已成为研究植物结构与功能的成熟工具。其非破坏性特点，结合三维可视化和虚拟切片的可能性，使得对复杂植物器官进行新颖且日益精细的分析成为可能。植物之间的相互作用，包括寄生植物与其寄主之间的相互作用，也可通过该技术进行探索。然而，由于这些植物之间存在相互作用，且其组织结构和组成常有差异，扫描前的样品制备变得尤为关键。此外，在采集、处理和制备寄生-寄主材料时，还必须考虑到寄生被子植物广泛的多样性，其形态从高度退化的营养体到乔木、草本和灌木不等。本文介绍了两种不同的方法，用于将对比剂溶液引入寄生植物和/或寄主植物中，重点关注对吸器（haustorium）的分析。该器官促进两种植物之间的连接与通讯。通过一种简便的方法，可对吸器组织结构进行三维解析，本文以真菌型、藤本及槲寄生类寄生植物为例进行了展示 。选择特定的对比剂及施用方式，还可实现对内寄生体在寄主体内扩散路径的详细观察，并检测寄生植物与寄主之间直接的导管-导管连接，本文以一种专性根寄生植物为例进行了说明。因此，本方案可应用于多样化的寄生被子植物，以推动对其发育过程、结构特征及功能机制的理解。
引言
高分辨率X射线显微计算机断层扫描（micro-CT）是一种成像方法，通过从不同观察角度记录样品的多张X光片（投影），随后用于对样品进行虚拟重建1。该虚拟结构可进一步被分析、操作和分割，从而实现对样品内部的三维无损观察2。micro-CT最初为医学分析设计，随后拓展至工业应用，其优势在于无需侵入性操作即可可视化样品内部器官和组织3。与其他成像技术类似，micro-CT在视场范围与像素尺寸之间存在权衡关系，这意味着对大尺寸样品实现高分辨率成像几乎难以实现4。随着高能X射线源（如同步辐射）和次级光学放大技术的不断进步，目前最小分辨率已可达到100 nm以下5,6。然而，对大尺寸样品进行扫描需要更长的扫描时间，从而增加了因样品在扫描仪内移动或变形而产生伪影的风险。此外，micro-CT的成像效果通常受限于样品内部天然的密度差异及其与X射线的相互作用方式。较高的X射线剂量虽有利于穿透密度较大的样品，但在检测样品内部及其周围介质之间的密度差异方面效率较低7。相反，较低的X射线剂量穿透能力较弱，通常需要更长的扫描时间，但对密度变化的检测更为敏感7....
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方案
1. 寄生植物样品选择
- 采集完整的寄生植物吸器，包括附着的寄主茎/根以及寄生器官近端和远端的两段组织；每段的理想长度应相当于吸器直径的两倍。
注意：对于侧生吸器，应包含形成该吸器的寄生植物母体茎/根的一部分（图1A、B、D）。对于内寄生植物，应采集寄主茎/根中可见寄生迹象的一段组织（图1B）。对于顶端连接的情况，应采集整株植物（图1E）。 - 将整个样品浸入固定液（如FAA）中，样品与固定液的体积比为1:10。根据样品大小，固定时间至少为1天27。
注意：样品可在扫描前长期保存于固定液中，或转移至保存液（如70%乙醇）中。若无需进行后续解剖学分析，也可使用新鲜样品（参见讨论部分）。若使用新鲜材料，应先设置好对比剂灌注装置，再采集样品，并防止样品干燥。
2. 对比溶液的应用
- 选择要使用的方法。对于较小的（图 1A）或非木质的（图 1B）样....
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结果
寄生植物的吸器是一种复杂的器官，由多种不同组织和细胞类型构成，这些组织和细胞相互缠绕并与作为寄主的另一植株的组织相连20。在分析小型（图1A–C）和大型（图1D、E）吸器时，可利用显微CT扫描以无损且三维的方式深入理解这一复杂结构。为此，可将对比剂溶液施加于寄生植物与寄主植物的界面处，从而使原本X射线吸收率低且均一、难以分辨的样品得以清晰成像。本实验方案中描述的两种简便方法均通过加压推动对比剂溶液，以加快其在样品中的渗透。正如预期，本文所述方案适用于不同的显微CT系统。然而，扫描设置与参数会因系统型号和待测样品的不同而有所差异（Table 1）。
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讨论
使用重金属溶液提高植物组织对比度已成为微计算机断层扫描（micro-CT）分析样品制备中的关键步骤。Staedler 等人测试了植物微形态学实验室中常见的多种化合物，推荐磷钨酸作为穿透样品并提高对比度指数的最有效试剂8。本文对 P. pubera 吸器的分析结果进一步证实了该建议的可靠性。在对比剂应用方面，Staedler 等人描述，对比溶液通过被动渗透方式进入被分析材料（花和花蕾，大小范围为 1 mm 至 10 mm），处理时间为 1 至 8 天8。其他研究者在分析较大样品（如内寄生大花草科 Rafflesiaceae 物种宽度达 30 cm 的花朵）时，采用了类似的被动渗透方案，但处理时间更长（1–4 周）28。尽管该方法已被证明有效，但本研究所获得的结果表明，在真空条件下可显著加快渗透过程，从而改进已有方法。真空室或真空泵可迫使植物组织中的空气逸出，从而更有利于对比溶液的渗透。即使对于脆弱结构，也可应用真空处理，本文中对 P. pubera 吸器以及被 .......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我谨向巴西圣保罗大学显微断层扫描实验室的 Simone Gomes Ferreira 博士和美国哈佛大学纳米系统中心的 Greg Lin 博士致以诚挚感谢，感谢他们在多种显微断层扫描系统及数据分析软件方面提供的至关重要的帮助和不可或缺的用户培训。同时感谢美国康涅狄格大学 EEB 温室的工作人员，特别是 Clinton Morse 和 Matthew Opel，为本研究提供了 Viscum minimum 的标本。John Wenzel 博士为 Pyrularia pubera 的采样工作提供了宝贵机会和大力支持。Carolina Bastos 硕士、Yasmin Hirao 硕士和 Talitha Motta 在 Scybalium fungiforme 的标本采集过程中给予了极大帮助。Ariadne Furtado 硕士以及 Fernanda Oliveira 博士和 Maria Aline Neves 博士提供了关于使用曙红 B 染色分析内生真菌的参考依据。在比利时布鲁塞尔自由大学进行视频录制期间，Philippe Claeys 博士、Christophe Snoeck 博士、Jake Griffith 硕士、Barabara Veselka 博士和 Harry Olde Venterink 博士提供了大力支持。 本研究得到了巴西高等教育人员改善协调办公室（CAPES）和美国哈佛大学植物标本馆的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3D X射线显微镜（XRM）系统 | Zeiss Versa 620 | 用于扫描 Pyrularia pubera | |
| 3D X射线显微镜 + A2:D22 | Zeiss | Versa 620 | 用于扫描物种 P. pubera |
| CT-Pro 3D 软件 | Nikon | 版本 XT 3.1.11 | 用于扫描图像的三维重建 |
| CT-Vox 软件 | Bruker | 版本 3.3.1 | 用于图像和视频的分析与获取 |
| Dragonfly 软件 | Object Research Systems - ORS | 版本 | 用于图像和视频的分析与获取 |
| 玻璃小瓶 | Glass Vials Inc. SE | V2708C-FM-SP | 由 VWR - USA 销售；确保小瓶能承受约 10 psi 的真空压力 |
| Inspect-X | Zeiss | 版本 XT 3.1.11 | 用于控制 Nikon X-Tek HMXST225 系统 |
| 0.0282 N 碘溶液 | WR Chemicals BDH | BDH7422-1 | 由 VWR - USA 销售 |
| 硝酸铅 II PA 500 g | Vetec | 361.08 | 由 SPLab 销售 |
| 显微断层扫描仪 | Bruker | Skyscan1176 | 用于扫描物种 C. americana、S. martianus 和 S. fungiforme |
| 显微断层扫描仪 | Nikon | X-Tek HMXST225 | 用于扫描物种 V. minimum |
| NRecon 软件 | Bruker | 版本 1.0.0 | 用于三维重建 |
| 3% 磷钨酸水合物水溶液 | Electron Microscopy Sciences | 101410-756 | 由 VWR - USA 销售 |
| 塑料薄膜（Parafilm） | Heathrow Scientific | PM996 | 由 VWR - USA 销售 |
| 500 mL 塑料输液袋 | Taylor | 3478 | 由 Fibra Cirurgica Produtos para Saude 销售 |
| 3/4'' PVC 管道 | Nalge Nunc International | SC63013-164 | 由 VWR - USA 销售 |
| 扫描系统 | Nikon X-Tek HMXST225 | 用于扫描 Viscum minimum | |
| 扫描系统 | Bruker Skyscan 1176 | 用于扫描 C. americana | |
| Scout-and-ScanTM 软件 | Zeiss | 版本 16 | 用于控制 Zeiss Versa 620 系统及扫描图像的三维重建 |
| 三通阀 | ToToT | DMTWVS-5 | 由 Amazon USA 销售 |
| 两部分注射器 | HSW Henke-Ject | 4850001000 | 使用时不带活塞 |
| 真空室 | Binder | 80080-434 | 由 VWR - USA 销售；包含泵和连接管 |
| VG Studio Max 软件 | Volume Graphics | 版本 3.0 | 用于图像和视频的分析与获取 |
参考文献
- Stock, S. R. Microcomputed tomography: Methodology and applications. , CRC Press/Taylor and Francis. Boca Raton, FL. (2020).
- Hounsfield, G. N. Computerized transverse axial scanning (tomography): I. Description of system. British Journal of Radiology. 46 (552), ....
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