利用显微CT扫描分析寄生植物与宿主的相互作用

高分辨率 X 射线显微计算机断层扫描 （micro-CT） 是一种成像方法，其中从不同的视角记录样品的多张 X 光片（投影），然后用于提供样品的虚拟重建¹。然后可以对该虚拟对象进行分析、操作和分割，从而实现三维非破坏性探索².micro-CT最初设计用于医学分析，后来用于工业应用，还具有可视化内部器官和组织的优势，而无需侵入性程序³。与其他形式的成像一样，显微CT在视场和像素大小之间进行权衡，这意味着大样本的高分辨率成像几乎无法实现⁴。使用高能X射线源（即同步加速器）和二次光学放大倍率方面不断取得进展，使最小分辨率达到100 nm^5，6以下。然而，对于大样品，需要更长的扫描时间，从而增加由于样品移动或扫描仪内部变形而导致伪影的机会。此外，显微CT通常受到样品内自然密度变化以及样品与X射线相互作用的限制。虽然较高的X射线剂量最适合穿透密度较大的样品，但它在捕获样品与其^{周围介质之间}密度变化的效率较低7。另一方面，较低的X射线剂量提供较少的穿透力，并且通常需要更长的扫描时间，但在密度检测中需要更高的灵敏度⁷。

这些限制长期以来一直阻碍了显微断层扫描在植物科学中的应用，因为大多数植物组织由具有低X^{射线吸收的}光（非致密）组织组成8。micro-CT的最初应用集中在绘制^土壤基质9^，10内的根网络。后来，开始探索组织密度差异更显着的植物结构，例如木材。这使得能够研究木质部功能11，^12，复杂组织的发展¹³，14以及植物之间的相互作用¹⁵，^16，17。由于造影剂的使用，软组织和均匀组织的分析正变得越来越普遍，造影剂现在是植物样品显微CT扫描准备的标准程序。然而，造影剂引入方案可能会有不同的结果，具体取决于样品体积、结构特性^{和所用溶液}的类型8。理想情况下，造影剂应增强不同组织之间的区别，能够评估组织/器官功能，和/或提供有关组织的生化信息¹⁸。因此，扫描前充分的样品处理、制备和镶嵌对于任何显微CT分析都至关重要。

寄生植物的显微CT检查
寄生开花植物代表被子植物的一个独特的功能群，其特征在于称为 haustorium¹⁹的器官。这种多细胞器官是改良茎和根之间的发育杂交体，作用于宿主的附着、渗透和寄生虫的接触²⁰。出于这个原因，haustorium被认为"体现了植物之间寄生的想法"²¹。详细了解该器官的发育、结构和功能对于寄生植物生态学、进化和管理研究至关重要。然而，寄生植物的整体复杂性和高度改变的结构和房屋往往阻碍了详细的分析和比较。Haustorium连接通常也很广泛，并且在组织和细胞分布上不均匀（图1）。在这种情况下，虽然处理小组织碎片可以更容易地操作和更高的分辨率，但它可能导致关于复杂结构的三维结构的错误结论，例如寄生植物haustorium。

尽管有大量关于寄生植物物种的Haustorium解剖学和超微结构的文献，但寄生虫和宿主组织之间的三维组织和空间关系仍然没有得到充分探索¹⁷。在Masumoto等人最近的一项工作中，²²将300多个连续半薄切片机切片成像并重建为代表两种寄生虫物种的三维虚拟物体。这种方法出色的细节水平为Haustorium的细胞和解剖学3D结构提供了前所未有的洞察力。然而，这种耗时的技术将禁止在具有更广泛Haustorium连接的寄生虫中进行类似的分析。显微CT的使用成为对寄生植物的复杂且通常笨重的Haustoria进行三维分析的绝佳工具。虽然不能替代详细的解剖切片和其他补充形式的显微镜分析¹⁷，^23，但通过显微CT扫描获得的结果，特别是对于大样本，也可以作为指导较小片段的子采样的指南，然后可以使用其他工具进行分析，例如共聚焦和电子显微镜^，或使用高分辨率显微CT系统重新分析。

图1:本协议中使用的不同功能组的寄生植物。真生寄生虫耻骨胫螨（A），内寄生虫内脏最小（B），绿色果实（黑色虚线圆圈），寄生藤美洲槲寄生（C），槲寄生Struthanthus martianus（D），专性根寄生虫Scybalium fungiforme（E）。宿主根（Hr）或茎（Hs）的片段有助于将造影剂应用于寄生虫Haustorium（P）。样品中寄生虫母根/茎（箭头）的存在可以分析Haustorium血管组织。矩形表示用于分析的样品段。比例尺 = 2 厘米。请点击此处查看此图的大图。

随着显微CT成为植物科学中越来越流行的技术，有关于样品扫描，三维重建，分割和分析的指南，协议和文献3，^10，24。因此，这里不讨论这些步骤。与任何想象技术一样，适当的样品处理和安装是一个基本程序，尽管经常是一个被忽视的过程。出于这个原因，该协议侧重于制备用于显微CT扫描的Haustorium样品。更具体地说，该协议描述了两种将造影剂引入Haustorium样品的方法，以改善Haustorium中不同组织和细胞类型的可视化，以促进检测宿主根/茎内的寄生组织，并分析寄生虫 - 宿主血管连接在三个维度。这里描述的制备也可以适用于其他工厂结构的分析。

使用了五个物种来更好地说明此处描述的方案的便利性。每个物种代表寄生开花植物的五个功能群之一，从而解决了与每个组的功能相关的特定点。选择Pyrularia pubera（Santalaceae）来代表真植寄生虫，它们在地下发芽并形成多个haustoria，将寄生虫连接到其宿主的根^部25。由这些植物产生的Haustoria通常是脆弱的，并且很容易与主体²⁶撕裂（图1A），因此需要更精细的处理过程。内寄生虫在这里以最小内脏（内脏科）表示。该功能组中的物种仅在其宿主体外短时间内可见（图1B），并且其大部分生命周期都以显着减少和嵌入宿主组织的菌丝样细胞链的形式存在²⁵。第三个功能群包括寄生藤本，它们在地面上发芽，但仅形成基本的根，依赖于附着在寄主植物茎上的多个haustoria25（图1C）。在这里，这个官能团以美洲蜥蜴（卷曲科）为代表。与寄生藤相反，槲寄生直接在其寄主植物的树枝上发芽，并发展出多个或孤立的Haustoria²⁵。选择用于说明该功能群的物种是Struthanthus martianus（Loranthaceae），它与宿主分支形成各种连接（图1D）。使用显微CT和光学显微镜组合对孤立槲寄生的分析可以在Teixeira-Costa&Ceccantini¹⁷中找到。最后，专性根寄生虫包括在地面上发芽并穿透寄主植物根部的物种，它们从最早的生长阶段就完全依赖寄主植物²⁵。这些植物在这里以Scybalium fungiforme（Balanophoraceae）为代表，其产生大型块茎状Haustoria（图1E）。

该方案中使用的所有植物样品均固定在70%福尔马林乙酸醇（FAA 70）中。取样时的固定对于保存植物组织至关重要，尤其是在需要后续解剖分析的情况下。在寄生植物Haustorium的情况下，固定也是必不可少的，因为该器官通常主要由非木质化的实质细胞²⁰组成。植物组织固定的详细方案，包括固定溶液的制备，可以在别处找到²⁷。另一方面，固定剂或多或少会导致样品物理和化学性质的改变，使其不适合特定的生物力学和组织化学分析。因此，新鲜样品，即在制备前立即收集的非固定材料，也可以与该方案一起使用。有关如何处理新鲜样品的详细信息以及固定材料的故障排除建议，请参见讨论部分。

1. 寄生植物样品选择

1. 收集整个寄生植物，包括附着的宿主茎/根以及寄生宿主器官近端和远端的节段;每段的理想长度相当于镰刀直径的两倍。
   注意:对于侧肋骨，包括形成荛膜的寄生虫母茎/根的一部分（图1A，B，D）。对于内寄生虫，收集宿主茎/根的一段，其中寄生虫的迹象可见（图1B）。在端子连接的情况下，应收集整个工厂（图1E）。
2. 将整个样品以1:10的体积比例浸没在固定剂溶液（例如FAA）中（样品:固定剂）。将样品在固定剂中放置至少1天，具体取决于样品^的大小27。
   注意:样品可以在扫描前储存在固定剂中，也可以转移到保存溶液（例如，乙醇70%）。如果不需要后续的解剖分析，也可以使用新鲜样品（见讨论部分）。如果使用新鲜材料，请设置造影剂灌注装置，然后收集样品。不应让样品变干。

2. 对比解决方案的应用

1. 选择要使用的应用程序方法。对小样品（图1A）或非木质样品（图1B）使用真空法（步骤2.3）。对于较大的样品，请使用灌注方法，前提是它包括宿主茎/根的一段（图1A，C-E）。
2. 无论在以下步骤中选择哪种方法，在操作样品时都要戴上橡胶手套和其他适当的个人防护设备（例如实验室外套）。
   注意:所有对比溶液的成分中都含有重金属盐，因此，在没有足够的个人防护设备和通风橱下处理时，不应进行处理。
3. 对于真空方法，请按照以下步骤操作。
   1. 选择合适的小瓶并贴上标签。小瓶必须足够大以容纳样品和对比溶液，通常比例为1:10。查看制造商的说明，以确保小瓶可以承受低到中等真空。
      注意:请勿将小瓶装满边缘，因为负压（真空）会导致液体溢出。
   2. 将样品放入带有对比溶液（1%碘或3%磷钨酸盐，参见 材料表）的小瓶中。然后将小瓶放入连接到真空泵的真空室或干燥器中。从小瓶中取下盖子，然后关闭真空室或干燥器。
   3. 检查真空室/干燥器上是否有裂缝，以及真空泵是否有足够的油。
   4. 关闭泵的排气阀以防止空气溢出，并打开腔室/干燥器的排气阀以迫使空气排出。
   5. 打开泵，等待压力达到约 20" Hg。
      注意:此过程通常很快，因此不要让真空系统无人看管。
      注意:虽然压力的公制单位是帕斯卡 （Pa），但大多数实验室真空泵中的压力表以英寸汞柱 （"Hg"）、磅/平方英寸 （psi） 或巴为单位显示压力。20" 汞柱等于约 67.7 Pa、10 psi 或 0.7 巴。
   6. 关闭腔室/干燥器排气阀以防止空气重新进入，然后快速关闭泵。
   7. 将样品在真空下放置至少2小时;较大的样品需要更长的时间才能使对比溶液穿透它。
   8. 在所需的时间后，从对比溶液中取出样品以准备扫描。
   9. 慢慢打开腔室/干燥器排气阀，让空气进入其中。
   10. 等待腔室/干燥器中的压力完全耗尽（即压力表达到接近 0），然后小心地打开它以取回样品。
   11. 适当丢弃对比溶液，并保留样品以准备扫描。
4. 对于灌注方法，请按照以下步骤操作。
   1. 根据样品的大小选择对比溶液的供应罐。小样本使用50 mL注射器（无针头或柱塞）（图2A）或1 L静脉注射医疗试剂盒处理大样本（图2B）。
   2. 将透明塑料管的一端（见 材料表）连接到供应罐，然后将另一端连接到二通或三通阀。将第二根管子连接到阀门中的其他出口（图 2A，B）。
   3. 将供应罐固定在较高位置，而无需拆卸上一步中设置的设备。
      注意:罐和样品之间的垂直距离将决定溶液灌注压力（图2B）。对于小样品来说，20-50厘米的距离就足够了。对于大样本，1 m 的距离就足够了。
   4. 关闭三通（图2C）或二通（图2D）阀以防止液体离开管道系统，然后将对比溶液倒入供应罐中。如果使用静脉注射医疗包，请在袋子中装满溶液并关闭阀门，然后再将设备固定在升高的位置。
   5. 确保沿管道系统不会形成大的气泡（图2E）。如有必要，让造影剂溶液从管中流出，直到气泡被去除。再次关闭阀门并将设备留在原位。
   6. 为了制备用于造影剂灌注的样品，请将其浸没在液体（水，乙醇或固定剂）中，并切断样品中宿主茎/根近端的尖端（图2F）。
   7. 从储存样品的液体中取出样品，并将其包裹在石蜡膜中以避免干燥。将样品放在附近并准备好连接到设备。
   8. 小心地打开阀门，让对比溶液缓慢流动，并填充连接到罐的塑料管，同时将系统的开口端保持在略微升高的位置，以防止对比溶液溢出。同样，确保沿管子没有形成大的气泡。
   9. 将样品中主体茎/根的近端连接到管道系统的开口端（图2B，放大区域）。在此步骤中避免将气泡引入系统。如有必要，断开样品与设备的连接，并通过让溶液流动来去除系统中的气泡。
   10. 在保持样品连接到仪器的同时，将其放置在容器内，以避免对比溶液泄漏到设置实验的区域。使用不同直径的管子、塑料扎带和阀门适配器（图 2G）来确保设备中的所有连接都适合，容纳各种尺寸的主机分支，并且溶液不会从管道系统中泄漏出来（图 2B，放大区域）。
   11. 让溶液灌注样品至少2小时，或直到溶液积聚在容器内。
   12. 关闭阀门并小心地将样品与设备断开。将剩余的溶液排入容器中并妥善处理。
   13. 从样品中取出石蜡膜以准备扫描。

图2:造影剂应用的灌注方法。 小型（A）和大型（B）版本的灌注设备包括一个供应罐（st）和两个通过阀门（va）连接的塑料管（t1和t2）。宿主茎（H）的近端承载着寄生虫（P），通过ha） 附着 在它上面，连接到系统的开口端（B，扩展）。三通 （C） 或二通 （D） 阀用于帮助防止管道系统内形成气泡，从而阻止对比溶液 （E） 的通过。在水下切割宿主茎（H）近端的尖端以允许造影剂溶液（F）通过。拉链扎带、阀门适配器和不同直径的管道有助于确保更紧密的连接并避免系统中的泄漏 （G）。图2B，D和F是使用BioRender创建的。比例尺 = 2 厘米。 请点击此处查看此图的大图。

3. 样品制备和安装

1. 通过将样品浸入水中2分钟来洗涤样品。
   注意:请勿在水槽中清洗样品，因为所有对比溶液的成分中都含有重金属盐。将用于洗涤的水视为稀释的对比溶液，并适当处理。
2. 将样品置于室温下的纸巾中，使多余的水蒸发2-5分钟，具体取决于样品的大小。或者，借助纸巾稍微擦干样品。不要让样品完全变干。
3. 将样品拉伸成薄层，将样品包裹在石蜡膜中。避免将石蜡膜折叠在样品顶部。
4. 将包裹的样品安装到样品架上，在扫描过程中旋转时保持稳定和就位。使用胶带、低密度泡沫、移液器吸头和/或透明塑料容器将样品固定到位。
5. 扫描样品并按照为可用的显微CT系统建立的特定协议和指南分析图像。

寄生植物的haustorium是一个复杂的器官，包括不同的组织和细胞类型，它们与另一种植物的组织交织和连接，用作宿主20。在分析小型（图1A-C）和大型（图1D，E）豪斯托里亚时，可以利用显微CT扫描以非破坏性和三维方式更好地了解这种复杂结构。为此，可以将对比溶液应用于寄生虫 - 宿主界面，从而可以分析具有低且均匀的X射线吸收的样品。本协议中描述的两种简单方法依赖于对对比溶液加压以加速通过样品的渗透。正如预期的那样，此处描述的协议适用于不同的显微CT系统。但是，扫描设置和参数因系统和分析样品而异（表1）。

表1:分析样品的扫描设置和参数。

在造影剂应用的第一种方法（步骤2.3）之后，使用真空将真生寄生虫P. pubera的Haustorium与3%磷钨酸盐溶液灌注两个小时。然后在3D X射线显微镜（XRM）系统中扫描样品（见材料表），通过二次光学放大倍率4实现高图像分辨率。观察到XRM图像与在光学显微镜下分析的解剖切片一样有效，以分析寄生虫 - 宿主界面的组织组织和拓扑结构（图3）。磷钨酸盐的使用突出了实质组织的丰度，由于对比剂的高吸收，它以明亮的白色调出现。由于对比度吸收低，血管呈深灰色调。基于这种色差，可以观察到骨囊血管核心周围的实质丰度（图3）。还观察到血管核心本身的复杂血管和薄实质链，特别是在纵向切片中（图3A-C）。在横截面中，很容易观察到血管核心是由实质隔开的两条血管链（图3D，E）。

图3:真生寄生虫。在使用真空（B-D）应用3%磷钨酸盐溶液后，在光学显微镜（A，E）和3D X射线显微镜下观察通过Haustorium的纵向（A-C）和横向（D-E）切片。红色轮廓表示实质组织（PAR），蓝色轮廓表示血管核心（vc）。Hx:宿主木质部。Hb:宿主树皮。比例尺 = 500 μm （A， E） 和 2.5 cm （B-D;体素大小 = 2.8382 μm）。请点击此处查看此图的大图。

相同的方法用于将造影剂引入寄生于最小弧菌的多肉寄主植物（大戟，仙人掌科）的茎中。在这里，根据初步的组织化学分析选择1%碘溶液作为对比剂，该分析表明内寄生虫的实质细胞以淀粉的形式储存碳水化合物（图4A）。同时，宿主皮层中的细胞不储存可检测量的淀粉（图4B-D）。对比应用后，使用尼康X-Tek显微CT系统扫描样品（见材料表）。碘吸收的差异允许检测由宿主体内内寄生虫形成的错综复杂的皮质链网（图4E）。按照这种方法，观察到皮质链集中在宿主血管中心周围，当与寄生虫花的发芽相关时，最终向宿主茎的外围分支（图4F，G）。

图4:内寄生虫组织网络。 解剖学（A）和宏观（B-D）切片显示与1%碘溶液的反应，表明淀粉（黑色染色）存在于与寄生虫血管（ve）相关的实质（par）中。由于宿主皮层（Hc）和木质部（Hx）中不存在淀粉，因此选择性地使用1%碘溶液来增强寄生虫皮质链组织的对比度（紫色轮廓， E-G），在宿主背景（H）下观察。花（Pf）的存在证实了染色的组织是内寄生虫结构（A，F，G）的一部分。比例尺 = 0.25 厘米。 请点击此处查看此图的大图。

在这里描述的第二种方法（步骤2.4）中，将装有对比溶液的供应罐从放置样品的水平升高，从而利用重力驱动溶液通过样品。造影剂灌注后，使用布鲁克Skycan显微CT系统进行扫描（见材料表）。美洲梭菌（图5A，B）和火星链球菌（图5C-G）获得的结果有助于说明这种方法分别适用于小样品和大样品的便利性。比较1%碘溶液灌注之前（图5C，E）和之后（图5D，F）扫描的样品，即使在木质钝香样品中，也强调了对比应用的重要性。值得注意的是，在美洲梭菌和火星链球菌（图5）及其各自宿主之间的关联中，寄生虫的组织中几乎没有淀粉含量。这解释了对最小内寄生虫V.描述的不同结果（图4），其中使用相同的方法和类型的造影剂溶液。

图5:寄生藤本植物和槲寄生。 通过寄生藤蔓（A，B）和槲寄生（C-G）的洞穴的纵向部分。扫描和新鲜材料的宏观切片之间的比较表明，在显微CT扫描中可以很好地捕获复杂的Haustorium结构（A，B）。在（C，E）和（D，F）灌注1%碘溶液之前和之后的固定样品之间的比较表明，即使在木质化样品中，对比度也增强，有助于观察寄生虫（P）结构，例如皮质根（粉红色箭头），血管链（蓝色箭头）和沉降器（黄色箭头）中的血管。宿主木质部（Hx）和宿主树皮（Hb）中的淀粉的血管和年轮也更容易观察到。比例尺 = 1 厘米。 请点击此处查看此图的大图。

通过此处描述的灌注方案获得的最终结果是可以检测寄生虫和宿主植物之间的血管连接。这是通过通过宿主根的一部分灌注0.2%硝酸铅溶液来实现的，专性根寄生虫S. fungiforme的块茎已经围绕该段发育。对比应用后，还使用布鲁克Skyscan显微CT系统进行扫描（见材料表）。顺序投影显示，宿主根中的血管分叉成寄生虫块茎（图6A-C）。在分析这些结果之后，将相同的样品切成较小的子样品，准备进行解剖学研究，并使用光学显微镜进行分析。该子样品的连续切片证实，两个工厂之间的木质部连续性是通过穿孔板的容器到容器连接形成的（图6D-F）。

图6:专性根寄生虫haustorium。通过显微CT扫描（A-C）观察到的穿过Haustorium的纵向切片和在光学显微镜（D-F）下观察到的解剖切片。0.2%硝酸铅溶液在宿主根的血管系统内的积累（Hr，粉红色轮廓）可以观察寄生虫管（Pt）内的宿主血管分支，并检测两种植物之间的直接血管连接（虚线白色轮廓）。比例尺 = 1 厘米（A-C）和 500 微米（D-F）。请点击此处查看此图的大图。

作者没有什么可透露的。