本文描述了一种在保持荧光蛋白稳定性的前提下使植物组织透明化的方法。该技术有助于对透明化处理后的植物组织进行深层成像，而无需物理切片。
本文内容
摘要
摘要
在不进行解剖的情况下，使用显微镜直接观察多层且不透明的植物样本内部结构具有挑战性。此外，由于叶绿素引起的自发荧光会干扰植物中荧光蛋白的观察。长期以来，研究人员使用多种透明化试剂使植物组织变得透明。然而，传统的透明化试剂会减弱荧光信号，因此难以利用荧光蛋白观察细胞及细胞内结构。近年来开发出一些可在去除叶绿素的同时保持荧光蛋白稳定性的植物组织透明化试剂。本文提供了使用透明化试剂ClearSee（CS）或ClearSeeAlpha（CSA）对植物组织进行光学透明化的详细实验方案。透明化植物组织的制备包括三个步骤：固定、洗涤和透明化。其中，固定是维持细胞结构和细胞内荧光蛋白稳定性的关键步骤。透明化所需的孵育时间取决于组织类型和物种。在Arabidopsis thaliana中，使用CS对叶片和根进行透明化需要4天，幼苗需要7天，而雌蕊则需要1个月。CS仅需相对较短的4天时间即可使Physcomitrium patens的配子体叶片透明。相比之下，在使用CS处理烟草和蓝猪耳的雌蕊时，由于氧化作用产生了棕色色素。CSA通过抑制氧化反应减少了棕色色素的生成，能够使烟草和蓝猪耳的雌蕊实现透明化，尽管所需时间较长（1至2个月）。CS和CSA还可与多种化学染料染色兼容，例如用于DNA染色的DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）和Hoechst 33342，以及用于细胞壁染色的Calcofluor White、SR2200和Direct Red 23。该方法可用于整株植物成像，有助于揭示完整的形态结构、发育过程、植物与微生物的相互作用以及线虫感染等生物学现象。
引言
在活体生物中观察细胞结构和蛋白质的定位对于阐明其功能具有重要意义 体内然而，由于生物体不具有透明性，因此在不进行解剖的情况下观察其内部结构具有挑战性。尤其是植物组织，其由不同形状的细胞构成多层结构，这种结构引起的折射率不匹配以及光吸收色素的存在，给观察带来困难。例如，植物叶片具有复杂的结构，能够高效利用进入体内的光线进行光合作用。1，而该结构还会导致折射率不匹配，使其难以观察。然而，叶片含有许多吸光色素，如叶绿素，可发出强烈的红色荧光，同时氧化作用会产生棕褐色色素2,3这些色素还会阻碍对植物进行整体荧光显微观察。因此，为了观察植物内部结构，长期以来采用酒精进行脱色和固定，并使用水合氯醛透明处理，以消除折射率不匹配和自发荧光的影响。4,5这些传统方法已使用多年，但其缺点是在消除荧光蛋白荧光的同时，也会将其荧光完全去除6,7这存在问题，因为荧光蛋白在当前的荧光成像中已变得不可或缺。
因此，ClearSee（CS）和 ClearSeeAlpha（CSA）被开发为用于植物组织的光学透明试剂。这两种试剂在减少叶绿素自发荧光的同时，能够保持荧光蛋白的稳定性7,8。当组织氧化导致产生褐色色素时，CSA 尤其适用。利用这些透明试剂，无需对植物进行物理切片，即可观察植物体内细胞结构及蛋白质的定位情况。
方案
1. 透明化溶液的制备
- 配制 CS 溶液：将 10% (w/v) 木糖醇、15% (w/v) 脱氧胆酸钠和 25% (w/v) 尿素溶于蒸馏水中，使用磁力搅拌器搅拌溶解。
注意：脱氧胆酸钠粉末应在通风橱中称量，因其易在空气中漂浮。CS 溶液避光保存可在室温下稳定存放超过 1 年。 - 配制 CSA 溶液：将亚硫酸钠（终浓度 50 mM）加入上述制备的 CS 溶液中。
注意：应在使用前立即向 CS 溶液中加入亚硫酸钠，因为还原剂容易失活。
2. 固定剂溶液的制备
- 将40 mL无菌水转移至一个锥形管中，并加入2 g多聚甲醛。加入200 µL的2 N NaOH以提高溶液的pH值。用封口膜封闭并密封管子后，在60 °C下孵育，期间偶尔轻轻翻转，直至所有成分完全溶解。
- 待溶液冷却至室温后，加入5 mL的10×磷酸盐缓冲液（PBS）以调节pH至7.4。用无菌水定容至50 mL。
注意：建议使用新鲜配制的固定剂溶液。该溶液也可在-30 °C下保存数月。
3. 样品固定
- 将植物样品浸入微型离心管中的固定液中（图 1A），确保固定液体积超过样品体积的五倍以上。
- 用封口膜密封微型离心管，并用针头扎若干小孔。由于真空减压过程中可能发生样品溢出，切勿使管口敞开。
- 将微型离心管放入真空干燥器中，缓慢调节真空度（约 690 mmHg），使样品中逐渐产生气泡（图 1B-C）。抽真空完成后关闭真空泵。室温下静置 30 分钟，期间避免扰动样品。
- 小心打开真空干燥器通气，防止扰动样品。再次开启真空泵，抽真空后关闭。室温下再静置 30 分钟。
注意：通气过程中应小心操作，避免对样品造成损伤。通过两次真空处理可增强固定液向样品内部的渗透。对于较厚的样品，可进一步增加真空处理次数以促进固定液渗透。 - 小心打开真空干燥器，避免碰撞微型离心管中的固定液。使用移液器吸除固定液，加入 1x PBS。静置 1 分钟后，弃去旧的 PBS 并更换为新的 1x PBS（图 1D）。
4. 透明化
- 吸除 PBS 后，加入五倍于样本体积的透明化溶液。
- 用封口膜密封微量离心管，并用针头刺若干小孔。将样本放入真空干燥器中，按步骤 3.3 进行抽真空后关闭真空泵。在室温下静置 60 分钟，期间避免扰动。
- 轻柔打开真空干燥器。用封口膜盖紧微量离心管，并在室温避光条件下保存，以防止荧光蛋白发生光漂白。每隔 1–2 天将微量离心管颠倒一次，以加快透明化过程。
- 当透明化溶液变为绿色时，更换为新的透明化溶液，直至溶液保持无色（图 1E-H）。
图1CS处理步骤。 (A) 拟南芥 4% PFA（多聚甲醛）溶液中固定幼苗。B) 将样品放入干燥器中。C) 在真空条件下固定幼苗。D幼苗经真空处理后，浸泡于PFA溶液中。E经3天透明化溶液处理后的幼苗。注意透明化溶液的绿色。F处理3天后更换透明化溶液。G经5天透明化溶液处理后的幼苗。H处理5天后更换透明溶液。比例尺：1 cm（A,C-H）和 5 cm（B). 请点击此处以查看此图的放大版本。
5. 化学染料染色
- 向微量离心管中加入Hoechst 33342（终浓度为10 µg/mL）用于细胞核染色，或加入Calcofluor White（终浓度为1 mg/mL）用于细胞壁染色，孵育1小时。移除染色液后，用新鲜的透明溶液清洗样品1小时。
注意：过夜染色和清洗可提高荧光染料在组织中的渗透性，并降低背景荧光。多种荧光染料可与CS溶液兼容，例如碱性品红9（木质素）、金胺O9（木质素、木栓质和角质）、尼罗红9（木栓质）、直接黄969、直接红239以及SR220010,11（细胞壁）。
6. 观察
- 使用剃刀片切割硅橡胶片，制备间隔垫片的框架（图 2A）。
注意：根据样品厚度调整硅橡胶片的厚度。由于经透明化溶液处理的样品质地较软，若直接用盖玻片覆盖，会造成样品损伤。 - 将硅橡胶框架置于盖玻片（例如 25 × 60 mm）上（图 2B）。将处理后的样品放入框架内，并加入约 100 µL 透明化溶液以排除框架内的气泡。再覆盖另一片盖玻片（18 × 18 mm 或 24 × 24 mm），防止透明化溶液蒸发（图 2C）。
- 在荧光显微镜下观察样品。观察完成后，将样品放回盛有透明化溶液的微量离心管中，避光、室温保存。
图 2：显微观察用样品的制备。（A）将厚度为 0.2 mm 的硅胶片切割成框架状。（B）将硅胶片框架置于盖玻片上。（C）将经透明化溶液处理的样品（以虚线框标示）放入框架内，并用另一盖玻片覆盖。比例尺：5 mm。请点击此处查看该图的高清版本。
结果
CS 可清除多种植物的叶片图3A-H）。由于水稻叶片表面覆盖有角质层蜡质，CS 溶液难以渗透该植物的叶片。然而，将叶片浸入氯仿中 10 秒以去除角质层蜡质后，CS 即可使水稻叶片透明化图3H）。然而，CS 无法穿透 日本扁柏 渗透性较低的叶片对 CS图3I，J）。在 菊花 叶片, 经CS处理的叶片中观察到由多酚氧化引起的褐色色素沉积（图 3K，L）。类似地，烟草和夏堇的雌蕊在CS处理期间表现出褐色色素沉积。图3M，）。由于CSA中的亚硫酸钠组分通过还原作用抑制多酚氧化，因此CSA可在不产生任何褐色色素沉积的情况下清除烟草和角蒿花柱图3N，P).
图4B 显示，与PBS孵育相比，CS处理减弱了Arabidopsis H2B-mClover叶片的浅绿色（明场），并增强了H2B-mClover的荧光强度（图4A）。除了开花植物外，CS也适用于苔藓植物（图4C）；经过4天的CS处理后，整个配子体的H2B-mRFP荧光清晰可见，且叶绿素自发荧光降低。图4D、E 展示了利用CSA透明化处理的Nicotiana benthamiana H2B-mClover雌蕊的三维重建图像。样品深度为440 µm。如深度编码的最大强度投影图像所示，CSA能够实现对烟草雌蕊等难处理组织的深层成像。
CS 和 CSA 也可与荧光染料染色兼容。图5 显示，CS 可同时用于观察荧光蛋白（H2B-mClover）和有机荧光染料染色（Calcofluor White）。通过对 z-stack 图像进行三维重建后，可观察任意切面。
图3：使用透明化溶液对叶片和雌蕊进行光学透明处理。（A–L）多种物种的固定叶片在PBS（A、C、E、G、I、K）或CS（B、D、F、H、J、L）中孵育8天，或在CS（M、O）或CSA（N、P）中孵育2天。（A、B、O、P）Torenia fournieri，（C、D）Nicotiana tabacum，（E、F）Cucumis sativus，（G、H）Oryza sativa，（I、J）Chamaecyparis obtusa，（K、L）Chrysanthemum morifolium，（M、N）Nicotiana benthamiana。比例尺：1 cm。请点击此处查看此图的放大版本。
图4：经透明化溶液处理的组织的荧光成像。（A、B）Arabidopsis thaliana 的 UBQ10pro::H2B-mClover 叶片分别用 PBS（A）或 CS（B）处理 3 天。（C）Physcomitrium patens 的 H2B-mRFP 叶状配子体用 CS 处理 4 天。细胞核标记为 H2B-mRFP（绿色）。CS 处理降低了叶绿素自体荧光（品红色）。在 H2B-mRFP 与自体荧光或明场图像的合并图像中，顶端区域的 H2B-mRFP 信号均清晰可见。（D、E）Nicotiana benthamiana 的 UBQ10pro::H2B-mClover 柱头经 CSA 处理 1 个月。最大强度投影（D）和深度编码的最大强度投影（E）由间隔 5 µm 的 88 个 z 层图像生成。比例尺：100 µm。图像分别采用宽场（A、B）、共聚焦（C）和双光子激发（D、E）显微镜拍摄。请点击此处查看该图的放大版本。
图5荧光染料染色与CS兼容。 (A) 使用950 nm激发光通过双光子激发显微镜观察经CS处理的叶片。细胞壁用Calcofluor White染色（青色），细胞核标记为UBQ10pro::H2B-mClover（黄色）。yz（B）和 xz（C) 图像为（中白色虚线所示位置的横截面A。比例尺： 100 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。
图6：脱氧胆酸钠的透明度。（A）不同来源的15%脱氧胆酸钠溶液的颜色（见材料表）。（B）各15%脱氧胆酸钠溶液在380 nm激发波长下的荧光光谱。 请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
该方法包括固定、洗涤和透明化处理。固定是本方案中的关键步骤。如果在PFA固定后未观察到荧光蛋白，则在使用透明化溶液处理后也不会观察到。PFA溶液渗入组织的过程至关重要，但不建议使用高真空处理，因为它可能破坏细胞结构。真空条件和固定时间应根据不同组织类型和物种进行优化。建议即使在固定后也检查荧光蛋白的信号。尽管样品通常在室温下固定30–60分钟，但也可在4 °C下进行更长时间的固定（过夜或更久）。
如图6A所示，某些脱氧胆酸钠溶解后呈淡黄色。此类脱氧胆酸钠溶液在380 nm激发后，在400–600 nm范围内表现出强烈的自发荧光（图6B）。这种自发荧光会干扰光学透明化和荧光成像。用户应检查脱氧胆酸钠溶液的颜色，因为试剂的质量可能因纯度、批间差异或其他因素而有所不同。
此处使用的透明化溶液含有高浓度的脱氧胆酸钠，可能破坏膜结构。然而，在透明化处理（CS处理）后仍可观察到质膜标记（RPS5Apro::tdTomato-LTI6b）7然而，根据目标结构和组织的不同，可能需要降低脱氧胆酸钠的浓度。事实上，通过调整后获得了清晰度更高的图像 拟南芥 子房经修饰的CS处理，其中脱氧胆酸钠的浓度减半；然而，降低脱氧胆酸钠浓度需要延长处理时间（例如，1个月） 拟南芥 雌蕊
CS 可降低红色自发荧光（>610 nm），以去除处理样品中的叶绿素。然而，即使在经过 CS 处理的样品中，500–600 nm 范围的自发荧光（黄色至橙色）仍然存在7。这种自发荧光被认为来源于细胞壁及其他细胞组分，例如木质素12,13。因此，对于具有发达次生壁的茎等组织，很难通过 CS 处理使其完全透明。
除本文所用试剂外，已有多种透明化试剂被开发用于荧光显微镜下观察植物中的荧光蛋白14,15,16,17。与这些方法相比，CS 和 CSA 能够去除叶绿素并降低自发荧光，从而使植物组织更加透明。最近，Sakamoto 等人开发了一种改进方法 iTOMEI，通过固定、去垢剂透明化和封片来调节折射率失配18。在拟南芥（Arabidopsis）幼苗中，iTOMEI 可在 26 小时内完成组织透明化。
CS 适用于多种植物物种，例如 Arabidopsis thaliana、Physcomitrium patens7、Chrysanthemum morifolium、Cucumis sativus、Nicotiana benthamiana、Nicotiana tabacum、Torenia fournieri8、Allium ochotense19、Astragalus sinicus20、鳄梨21、大麦22、Brassica rapa23、Callitriche24、Eucalyptus25、玉米26、Marchantia polymorpha27、Monophyllaea glabra28、Orobanche minor29、矮牵牛30、水稻31、Solanum lycopersicum32、大豆33、草莓34、小麦35 以及 Wolffiella hyalina36。对于较厚的组织，CS 还可使振动切片机切取的组织切片变得透明37,38。该方法使得对植物细胞结构和基因表达模式的研究成为可能37,38。此外，在经 CS 处理的组织深层，还可观察到线虫侵染20,39、真菌侵染以及共生关系19,40,41。因此，该方法适用于从微观到宏观尺度的完整组织成像，有助于发现不同细胞、组织、器官及生物体之间的新型相互作用。
披露
ClearSee 已实现商业化（日本富士胶片和光纯药株式会社）。名古屋大学拥有透明化试剂 ClearSee 的专利（专利号：JP6601842）。D. Kurihara 为该专利的发明人。作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
本工作得到了日本学术振兴会（科学研究费助成事业创新领域研究（JP16H06464、JP16H06280，授予T.H.），科学研究费助成事业（B类，JP17H03697，授予D.K.），挑战性萌芽研究助成（JP18K19331，授予D.K.），科学研究费助成事业创新领域研究（JP20H05358，授予D.K.））以及日本科学技术振兴机构（PRESTO项目（JPMJPR15QC，授予Y.M.；JPMJPR18K4，授予D.K.））的支持。作者感谢名古屋大学变革性生物分子研究所（WPI-ITbM）的活体成像中心对显微研究工作的支持，同时感谢Editage（www.editage.com）提供的英文语言编辑服务。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Calcofluor White | Sigma-Aldrich | F3543 | 荧光增白剂 28；H2O 中 100 mg/mL |
| ClearSee | 10% (w/v) 木糖醇，15% (w/v) 脱氧胆酸钠，25% (w/v) 尿素 | ||
| 盖玻片 (18×18 No.1) | MATSUNAMI | C018181 | |
| 盖玻片 (24×24 No.1) | MATSUNAMI | C024241 | |
| 盖玻片 (25×60 No.1) | MATSUNAMI | C025601 | |
| 干燥器 | AS One | 1-5801-11 | |
| Hoechst 33342 | DOJINDO | 346-07951 | H2O 中 1 mg/mL |
| 针头 | TERUMO | NN-2238S | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| 多聚甲醛 | Nacalai Tesque | 26126-25 | |
| 磷酸盐缓冲液，pH 7.4 | |||
| 硅橡胶片 | AS One | 6-9085-12 | |
| 脱氧胆酸钠 | 东京化成工业 | C0316 | 图 6_1；批号 PSGYK-QB |
| 脱氧胆酸钠 | 岸田化学 | 260-71412 | 图 6_2；批号 C05543H |
| 脱氧胆酸钠 | Sigma-Aldrich | D6750 | 图 6_3；批号 SLBS7362 |
| 脱氧胆酸钠 | Sigma-Aldrich | 30970 | 图 6_4；批号 BCBW0612 |
| 脱氧胆酸钠 | Nacalai Tesque | 10712-96 | 图 6_5；批号 M5R3403 |
| 脱氧胆酸钠 | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 194-08311 | 图 6_6；批号 LKL0648 |
| 氢氧化钠 | Nacalai Tesque | 31511-05 | |
| 亚硫酸钠 | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-03411 | |
| 尿素 | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
| 真空泵 | BUCHI | V-700 | |
| 木糖醇 | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |
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