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大规模自动化生产脂肪源性干细胞球用于3D生物打印

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DOI：

10.3791/63430

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2022年3月31日

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1Nucleus of Multidisciplinary Research in Biology (Numpex-Bio), Federal University of Rio de Janeiro, 2Laboratory of Tissue Bioengineering, National Institute of Metrology, Quality and Technology (Inmetro), 3Post-graduation Program of Translational Biomedicine (Biotrans), Unigranrio, 4Post-graduation Program in Biotechnology, National Institute of Metrology, Quality and Technology (Inmetro), 5Dental School, Fluminense Federal Fluminense

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用自动化移液系统接种细胞悬液，实现脂肪来源基质/干细胞（ASC）球体大规模生产的方法，从而确保球体大小和形状的均一性。这些ASC球体可作为三维生物打印技术的构建单元。

摘要

脂肪来源的基质/干细胞（ASCs）是存在于人皮下脂肪组织基质血管组分中的一类细胞亚群，被公认为间充质基质/干细胞的经典来源。已有大量研究将ASCs应用于基于支架的组织工程策略中，主要集中探讨这些细胞接种于生物活性支架后的行为表现。然而，无支架的组织工程方法正逐渐兴起。 体外 和 体内主要利用球状体来克服基于支架方法的局限性。

类球体是通过自组装过程形成的三维微组织。由于细胞间以及细胞与细胞外基质相互作用的增强，类球体能够更好地模拟天然组织的结构和微环境。近年来，类球体主要被用于疾病模型、药物筛选研究以及作为三维生物打印的构建单元。然而，在三维生物打印应用中，需要大量大小和形状均一的类球体，以实现复杂组织和器官模型的生物制造。此外，当类球体通过自动化方式制备时，微生物污染的可能性极低，从而提高了该方法的可重复性。

大规模生产球状体被认为是开发生物制造流程的第一步，该流程随后进入三维生物打印阶段，并最终在生物反应器中完成组织构建体的完全成熟。然而，目前关于大规模脂肪来源干细胞（ASC）球状体生产的研究所占比例仍然较少，同时将ASC球状体作为构建单元用于三维生物打印的研究也较为有限。因此，本文旨在展示利用非黏附性微模水凝胶技术实现ASC球状体的大规模生产，并推广ASC球状体作为三维生物打印策略中的构建单元。

引言

类球体被认为是组织工程中一种无需支架的方法。脂肪来源的干细胞（ASCs）能够通过自组装过程形成类球体。类球体的三维微结构增强了ASCs的再生潜能，包括向多个谱系分化的潜力1,2,3。本研究团队已将ASC类球体应用于软骨和骨组织工程研究4,5,6。更重要的是，由于类球体具有融合能力，它们被视为组织和器官生物制造中的基本构建单元。

利用球状体进行组织构建依赖于三个主要方面：（1）建立标准化且可放大的机器人生物制造方法7，（2）对组织球状体进行系统性表型分析8，（3）开发三维组织组装方法9。这些球状体可通过不同类型细胞形成，并采用多种方法获得，包括悬滴法、再聚集法、微流控技术以及微模具法8,9,10。每种方法在球状体大小和形状的均一性、形成后球状体的回收效率、产量、过程自动化程度、劳动强度以及成本等方面均具有各自的优缺点11。

在微模具法中，细胞由于重力作用被分配并沉积在微模具底部。非黏附性水凝胶阻止细胞附着于底部，而细胞间的相互作用促使每个凹陷处形成单一类球体8,12。该生物制造方法可生成大小均一且可控的类球体，能够实现自动化以高效、省力地进行大规模生产，并具有良好的成本效益，这些均为组织类球体生物制造设计中的关键因素7,8。该方法适用于任何细胞谱系的类球体构建，可用于制备具有可预测、最优且可控特性的新型组织类型8。

生物制造被定义为"具有结构组织的生物功能性产品的自动化生成……"13。因此，类球体的自动化生产被视为构建生物制造流程的第一步，该流程随后进入三维生物打印阶段，并最终通过类球体融合实现生物打印组织的完全成熟。在本研究中，为了提高脂肪源性干细胞（ASC）类球体生物制造的可扩展性，我们采用自动化移液系统接种细胞悬液，从而确保类球体在大小和形态上的一致性。本文表明，已能够制备出大量（数千个）用于三维生物打印的类球体，以构建更为复杂的组织模型。

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方案

本研究中使用的脂肪来源干细胞（ASCs）先前已从健康人类供体中分离，并按照巴西里约热内卢联邦大学克莱门蒂诺·弗拉加·菲略医院研究伦理委员会（25818719.4.0000.5257）的规定进行冻存14。有关本研究中使用的所有材料和设备的详细信息，请参见材料表。

1. 第三代ASC单层细胞的胰酶消化

  1. 打开含有80%融合度ASC单层细胞的175 cm2组织培养瓶，弃去上清液。
  2. 加入7 mL磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 M），洗涤单层细胞两次，随后弃去液体。
  3. 加入5 mL含0.78 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的0.125%胰蛋白酶溶液，于37 °C孵育5分钟。
  4. 向175 cm2组织培养瓶中加入10 mL含10%胎牛血清（FBS）的低糖 Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM LOW），并用10 mL移液管充分混匀细胞悬液。
  5. 用10 mL血清移液管收集细胞悬液，转移至50 mL离心管中，于400 × g离心5分钟，获得ASC细胞沉淀。用含10% FBS的DMEM LOW重悬细胞沉淀。
  6. 采用台盼蓝排斥法进行细胞计数。
  7. 计数后，取总共1 × 106个ASC细胞置于另一个15 mL离心管中，用于接种经微模压成型的非黏附性水凝胶的81个凹孔（此处接种终浓度为10,000个细胞/mL）。若需接种256个微模压非黏附性水凝胶凹孔，则取总共5 × 105个ASC细胞放入离心管中（此处接种终浓度为2,500个细胞/mL）。

2. 微模塑非粘附性琼脂糖水凝胶的制备

  1. 在超纯水中配制50 mL无菌的2%超纯琼脂糖溶液，其中含0.9% NaCl。将该溶液在121 °C条件下高压灭菌30分钟。
  2. 在含有81或256个圆形凹槽的硅胶模具中央加入500 µL无菌的2%超纯琼脂糖溶液。
  3. 40分钟后，将超纯琼脂糖从硅胶模具中脱模，并置于12孔塑料培养板的一个孔中。
  4. 在含有微模压琼脂糖的孔中加入2 mL DMEM LOW，并在接种ASCs前，于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育至少12小时。

3. 使用自动移液系统进行脂肪干细胞球体的生物制造

  1. 检查以下内容：
    1. 检查层流是否开启，以及操作柜的气流是否正常工作。
    2. 检查设备是否连接到正确的电压。
    3. 检查平板电脑是否已连接到设备。
    4. 检查操作柜防护玻璃的高度是否与设备上传感器标记的高度一致。
  2. 按下设备左侧的开/关按钮，等待平板电脑和设备启动。
  3. 将吸头盒、离心管架以及含有微模制琼脂糖水凝胶的板放置在设备的工作区域内。
  4. 在已打开软件的平板电脑上，首先点击耗材编辑器。
  5. 设置虚拟工作台，并选择移液器、吸头盒、塑料管架和板的位置。
    注意：虚拟工作台必须准确反映设备中各配件的实际物理位置。
  6. 点击切换至生产按钮，以添加设备在整个实验过程中将执行的参数（见步骤3.10）和指令。等待软件中弹出工具栏和生产列表。
  7. 首先，为指定操作，输入需进行移液的样本数量，并将其拖动至生产列表中。
    注意：样本数量即为含有待接种至微模中心的ASC悬液的塑料离心管数量。
  8. 输入样本数量后，点击软件中的样本转移命令按钮，将ASC悬液转移至含有微模的12孔板的孔中，并将该命令拖动至生产列表。
  9. 点击属性以设置设备进行样本转移的起始和终止位置。
  10. 等待软件返回至工作台页面。点击选项按钮，设置ASC自动接种的参数：i) 吸液速度为15.4 s-1；ii) 排液速度为1 s-1；iii) 吹打延迟为0 ms；iv) 吹打速度为15.4 s-1；v) 初始冲程为100%。选择水作为标准液体类型。
  11. 设置混合ASC的参数，以获得均匀的悬液：i) 循环次数为5；ii) 速度为6.5 s-1；iii) 体积为300 µL。
  12. 参数设置完成后，向生产列表中添加时间为40 min。
    注意：此时间为等待ASC悬液沉降至微模底部所需的时间。
  13. 在生产列表中，添加试剂转移选项，将球体培养基转移至板的相应孔中。
  14. 重复步骤3.9–3.11，设置转移球体培养基的位置和参数配置。
  15. 点击软件顶部工具栏中带有对号符号的按钮，以确保程序无错误。
  16. 点击软件顶部工具栏中的播放按钮（三角形符号），启动程序。
  17. 让设备按程序自动运行，直至发出提示音，表示操作完成。
  18. 取出12孔板，置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养至少18小时，使球体完全形成并紧实。
  19. 在培养1天、3天和7天后，手动收集球体用于分析。使用微量移液器手动冲洗培养基，使球体从微模制非黏附性琼脂糖水凝胶中释放出来。
  20. 5分钟后，在显微镜下观察，确认球体是否已完全从微模制非黏附性琼脂糖水凝胶中释放。
  21. 使用微量移液器手动收集球体，并转移至15 mL离心管中。
  22. 用0.01 M PBS至少清洗球体两次。对新鲜的球体样本进行活力检测和生物力学分析。如需进行形态学分析（组织学），将球体样本在含4%多聚甲醛的PBS中于2–8 °C孵育至少18小时。

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结果

自动移液系统可在15分钟内将ASC细胞悬液接种至一个12孔板的12个孔中。使用具有81个微模腔的非黏附性水凝胶，可在实验方案结束时生成972个类球体。使用具有256个微模腔的非黏附性水凝胶，则可在实验方案结束时生成3,072个类球体。对ASC类球体的大小和形状均一性进行了分析。在培养期间，来自具有81个凹腔微模的ASC类球体表现出均一的直径，而来自具有256个凹腔微模的ASC类球体则不然（图1C，D）。来自具有81个和256个凹腔微模的ASC类球体，其最小直径与最大直径的比值（球形度）均接近1（图1E，F）。活力、形态和作用力分析结果（图2）表明，ASC类球体可成功实现大规模生产。

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讨论

本文介绍了利用自动化移液系统大规模生成脂肪干细胞（ASC）球体的方法。该方案的关键步骤是精确设置软件，以确保细胞悬液的移液体积、速度和距离准确无误。文中所述参数经过多次试验确定，旨在优化将ASC细胞悬液分配至含有微模制非黏附性水凝胶的12孔板各孔中的过程。通过测量球体的直径和球形度来评估优化效果。根据微模制非黏附性水凝胶的面积和高度计算出分配细胞悬液的理想速度。若设备以不同的分配速度接种细胞悬液，将直接影响球体的形成。因此，这些参数需在使用设备进行试验后加以优化。本方案存在一定局限性：仅能实现将ASC细胞接种至微模制非黏附性水凝胶中，并随后添加细胞培养基的步骤自动化。系统的功能受限于设备型号及其软件版本。然而，该可重复方法的主要优势在于能够以较低的人为误差或污染风险，生成多达3,072个大小和形状均一且具有活性的ASC球体。大量制备的ASC球体可直接装载至3D生物打印机中，用于构建更复杂的组织模型。

通常，人们普遍认为准确且自动化的移液操作在细胞培养自动化中起着核心作用。自动化的细胞培养系统能够实现大规模生产，并提高技术准确性、可重复性以及工艺效率

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢巴西国家计量、质量和技术研究所（INMETRO，里约热内卢州，巴西）提供设施支持。本研究部分得到了里约热内卢州卡洛斯·查加斯·菲略研究支持基金会（Faperj）（资助编号：E26/202.682/2018 和 E-26/010.001771/2019）、国家科学技术发展委员会（CNPq）（资助编号：307460/2019-3）以及美国海军研究办公室（ONR）（资助编号：N62909-21-1-2091）的支持。本工作还部分得到了再生医学国家科学与技术研究中心-INCT Regenera（http://www.inctregenera.org.br/）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12孔塑料培养板Corning3512
50 mL 离心管CorningCLS430828
EpMotion 5070Eppendorf5070000282
epT.I.P.S. MotionEppendorf30015231
乙二胺四乙酸（EDTA）Invitrogen15576028
胎牛血清（FBS）Gibco10082147
低糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM LOW）Gibco31600034
MicroTissues 3D 培养皿微模具球体 - 16 × 16 阵列SigmaZ764000
MicroTissues 3D 培养皿微模具球体 - 9 × 9 阵列SigmaZ764019
磷酸盐缓冲液（PBS）Sigma806552
氯化钠（NaCl）SigmaS8776
组织培养瓶Corning430720U
台盼蓝Lonza17-942E
胰蛋白酶Gibco27250018
超纯琼脂糖Invitrogen16500100

参考文献

  1. Gentile, C. Filling the gaps between the in vivo and in vitro microenvironment: Engineering of spheroids for stem cell technology. Current Stem Cell Research & Therapy. 11 (8), 652-665 (2016).
  2. Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
  3. Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C: Methods. 16 (4), 735-749 (2009).
  4. Cortês, I., et al. A scaffold- and serum-free method to mimic human stable cartilage validated by secretome. Tissue Engineering: Part A. 27 (5-6), 311-327 (2021).
  5. Kronemberger, G. S., et al. Scaffold- and serum-free hypertrophic cartilage tissue engineering as an alternative approach for bone repair. Artificial Organs. 44 (7), 288-299 (2020).
  6. Kronemberger, G. S., et al. The hypertrophic cartilage induction influences the building-block capacity of human adipose stem/stromal cell spheroids for biofabrication. Artificial Organs. 45 (10), 1208-1218 (2021).
  7. Mehesz, A. N., et al. Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids. Biofabrication. 3 (2), 025002(2011).
  8. Koudan, E. V., et al. The scalable standardized biofabrication of tissue spheroids from different cell types using nonadhesive technology. 3D Printing and Additive Manufacturing. 4 (1), 53-60 (2017).
  9. Parfenov, V. A., et al. label-free and nozzle-free biofabrication technology using magnetic levitational assembly. Biofabrication. 10 (3), 034104(2018).
  10. Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: Boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
  11. Gutzweiler, L., et al. Large scale production and controlled deposition of single HUVEC spheroids for bioprinting applications. Biofabrication. 9 (2), 025027(2017).
  12. Lin, H., Li, Q., Lei, Y. Three-dimensional tissues using human pluripotent stem cell spheroids as biofabrication building blocks. Biofabrication. 9 (2), 025007(2017).
  13. Groll, J., et al. Biofabrication: reappraising the definition of an evolving field. Biofabrication. 8 (1), 013001(2016).
  14. Baptista, L. S., et al. An alternative method for the isolation of mesenchymal stromal cells derived from lipoaspirate samples. Cytotherapy. 11 (6), 706-715 (2009).
  15. Conway, M. K., et al. Scalable 96-well plate based iPSC culture and production using a robotic liquid handling system. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (99), e52755(2015).
  16. Moutsatsou, P., et al. Automation in cell and gene therapy manufacturing: from past to future. Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).
  17. Doulgkeroglou, M. -K., et al. Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811(2020).
  18. Bhise, N. S., et al. A liver-on-a-chip platform with bioprinted hepatic spheroids. Biofabrication. 8 (1), 014101(2016).
  19. Daly, A. C., Kelly, D. J. Biofabrication of spatially organised tissues by directing the growth of cellular spheroids within 3D printed polymeric microchambers. Biomaterials. 197, 194-206 (2019).
  20. Lopa, S., et al. Microfluidic biofabrication of 3D multicellular spheroids by modulation of non-geometrical parameters. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 366(2020).
  21. Meseguer-Ripolles, J., Kasarinaite, A., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Protocol for automated production of human stem cell derived liver spheres. STAR Protocols. 2 (2), 100502(2021).
  22. Lee, G. -H., Suh, Y., Park, J. Y. A paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55548(2018).
  23. Becerra, D., Wu, T., Jeffs, S., Ott, H. C. High-throughput culture method of induced pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells. Tissue Engineering Part C - Methods. 27 (12), 639-648 (2021).
  24. Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current Opinion Biotechnology. 22 (5), 667-673 (2011).
  25. De Moor, L., et al. High-throughput fabrication of vascularized spheroids for bioprinting. Biofabrication. 10 (3), 035009(2018).

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