啮齿类动物手术诱导青光眼的角膜缘血管丛全周电凝术

摘要

本实验方案的目的是表征一种基于360°热凝烧灼角膜缘血管丛以诱导亚急性眼内高压的青光眼神经变性新模型。

摘要

青光眼是全球导致失明的第二大原因，是一组具有异质性的眼部疾病，其特征为视神经结构损伤和视网膜神经节细胞（RGC）变性，通过中断视觉信息从眼睛向大脑的传递而导致视觉功能障碍。眼内压升高是最重要的危险因素；因此，研究人员已通过遗传或实验方法在啮齿类动物中建立了多种眼高压模型，以探究该疾病的病因与病理机制。在这些模型中，已报道存在若干局限性，例如手术侵入性强、功能评估不足、需要大量培训以及视网膜损伤程度变异较大。本研究描述了一种简单、低成本且高效的方法，通过低温对角膜缘血管丛——房水引流系统的主要组成部分——进行全周烧灼，从而在啮齿类动物中诱导眼高压。该新模型技术操作简便、非侵入性强、可重复性好，可产生亚急性眼高压，并伴随进行性RGC和视神经变性，且具有独特的术后临床恢复率，允许 体内 通过电生理学和行为学方法进行的功能研究。

引言

医学文献将青光眼理解为一组异质性的视神经病变，其特征是视网膜神经节细胞（RGCs）及其树突、胞体和轴突进行性退化，导致视盘结构性凹陷（挖空）以及视神经功能恶化，若未得到有效控制，最终会因中断视觉信息从眼睛向大脑的传递而导致失明¹。目前，青光眼是全球范围内不可逆性失明的最主要原因，预计到2040年将影响约1.118亿人²，因而严重影响患者的生活质量（QoL），并引发重大的社会经济问题³。

眼内压（IOP）升高是青光眼发生和进展最重要的、也是唯一可调节的危险因素。在多种类型的青光眼中，除正常眼压性青光眼（NTG）外，其余所有类型在疾病临床病程中的某个阶段均伴有眼内压升高。尽管在降低眼内压以减缓或阻止疾病进展方面已取得显著的临床和手术进展，患者仍可能因青光眼而丧失视力^4,5。因此，深入理解该疾病复杂且多因素的病理生理机制，对于开发更有效的治疗方法至关重要，尤其是为视网膜神经节细胞（RGCs）提供神经保护。

在研究疾病机制的多种实验方法中，基于眼内压升高（OHT）的动物模型最接近人类青光眼。啮齿类动物模型尤其有用，因为它们 成本低、易于操作 ，可进行遗....

方案

所有操作均遵循视觉与眼科研究协会（ARVO）发布的《眼科与视觉研究中动物使用声明》，并经里约热内卢联邦大学健康科学中心动物实验伦理委员会批准（方案编号 083/17）。本研究使用了2-3月龄、体重180-320 g的Lister Hooded大鼠，雌雄均有。然而，该操作可适用于不同品系及不同年龄范围的大鼠。

1. 眼压升高手术及临床随访

1. 在受控温度环境和12小时光照/黑暗循环（上午6点开灯，下午6点关灯）条件下饲养实验动物，提供标准颗粒状γ射线辐照饲料（Nuvilab® CR-1，Quimtia S/A，巴西）和经过三重过滤（含无毒活性炭）的饮水 随意摄取.
2. 配制一种麻醉剂储备混合液，由三份10%盐酸氯胺酮和一份2%盐酸赛拉嗪（溶剂：无菌水）组成。
3. 轻轻抓住动物背部皮肤以固定，并通过以下方法诱导麻醉 按每克体重1 µL的剂量腹腔注射混合物（氯胺酮：75 mg/kg；赛拉嗪：5 mg/kg）。约5分钟后通过夹趾反应检查麻醉效果。
4. 使用0.5%盐酸丙美卡因滴眼液对双眼表面进行局部麻醉。等待30-60秒后，用无菌小棉签轻轻接触鼻侧或外侧球结膜，清除眼球前部残留的溶液。
5. 将动物置于实验台面上的仰卧位，使其角膜表面易于接触眼压计探头，测量实验眼及对侧对照眼的基础眼压。
6. 使用压平式或回弹式手持眼压计（

结果

定量变量以均值 ± 均值标准误（SEM）表示。除眼压（IOP）动态在高眼压（OHT）组与对照组之间的比较（图1F）外，统计分析均采用双因素方差分析，随后进行Sidak多重比较检验。以p值 < 0.05为具有统计学显著性。

图1展示了全周角膜缘丛烧灼（LPC）模型的手术步骤，关键解剖标志包括360°热诱导的角膜缘血管消失，以及手术结束时患眼出现轻度至中度瞳孔散大。

在本系列131只大鼠中，全周角膜缘脉丛烧灼术（LPC）导致术后即刻眼压从基线水平的13.0 ± 0.2 mmHg升高至22.7 ± 0.4 mmHg。术后眼压峰值出现在术后第1天（25.3 ± 0.6 mmHg），随后逐渐恢复至基线水平，于第6周时达到稳定^th 术后第几天（统计分析：采用 Holm-Sidak 法进行多重比较校正的多次 t 检验； 图1F）。角膜纤维化或.......

讨论

角膜缘血管丛烧灼术（LPC）是一种新型的术后小梁模型，其优势在于靶向易于接触的血管结构，无需结膜或腱膜分离^17,28。与涡静脉烧灼模型（一种基于脉络膜静脉引流功能受损的著名高眼压模型）不同，在LPC模型中，由于角膜缘静脉位于房水外流通路的上游，静脉淤血不会影响眼内压升高。此外，该技术易于掌握且成本较低，主要需要低温热凝设备即可完成。更重要的是，该模型具有独特的高眼压诱导率和完全临床恢复率（> 90%，如先前报道）²³，从而减少了实验所需动物数量，并支持进行电生理学和行为学分析。最后，术后相对较短时间内即可观察到视网膜神经节细胞层和视神经均出现青光眼性退行性改变，适用于短期或中期实验设计²³。未来仍需进一步研究以阐明全周角膜缘血管系统烧灼对各视网膜分层的具体影响。

手术方案中的关键步骤包括：（1）电凝针尖必须平行于血管轴轻轻接触巩膜缘；（2）在电凝过程中以及动物操作过.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丙酮	Isofar	201	用于电子显微镜组织制备（步骤5）
视网膜电图用活性电极	Hansol Medical Co	-	不锈钢针，0.25 mm × 15 mm
Anestalcon	Novartis Biociências S/A	MS-1.0068.1087	盐酸丙美卡因 0.5%
氯化钙	Vetec	560	用于电子显微镜组织制备（步骤5）
低温精细尖烧灼器 10/盒	Bovie Medical Corporation	AA00	低温眼科烧灼器
Cetamin	Syntec do Brasil Ltda	000200-3-000003	盐酸氯胺酮 10%
DAKO	Dako North America	S3023	抗荧光淬灭封片剂
DAPI	Thermo Fisher Scientific	28718-90-3	二脒基-2-苯基吲哚；蓝色荧光核复染剂；发射波长 452±3 nm
Ecofilm	Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda	MS-1.0298.0487	羧甲基纤维素钠 0.5%
EPON 树脂	Polysciences, Inc.	-	用于电子显微镜的环氧树脂，由四种试剂混合组成：Poly/Bed 812 树脂（货号#08791）；DDSA - 十二烯基琥珀酸酐（货号#00563）；NMA - 纳迪克甲基酸酐（货号#00886）；DMP-30 - 2,4,6-三（二甲氨基甲基）苯酚（货号#00553）
戊二醛	Electron Microscopy Sciences	16110	用于电子显微镜组织制备（步骤5）
Hyabak	União Química Farmacêutica Nacional S/A	MS-8042140002	透明质酸钠 0.15%
Icare Tonolab	Icare Finland Oy	TV02（型号）	手持式回弹式眼压计
驴抗小鼠 IgG 抗体 + Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A31570	二抗溶液
23 英寸 LCD 显示器	Samsung Electronics Co. Ltd.	S23B550	型号 LS23B550，用于视网膜电图记录
LSM 510 Meta	Carl Zeiss	-	共聚焦落射荧光显微镜
Maxiflox	Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda	MS-1.0298.0489	环丙沙星 3.5 mg/g
MEB-9400K	Nihon Kohden Corporation	-	视网膜电图记录系统
单克隆小鼠 IgG1 抗 Brn3a 抗体	MilliporeSigma	MAB-1585	Brn3a 一抗溶液
Neuropack Manager v08.33	Nihon Kohden Corporation	-	视网膜电图信号处理软件
Optomotry	CerebralMechanics	-	视觉运动反应分析系统
四氧化锇	Electron Microscopy Sciences	19100	用于电子显微镜组织制备（步骤5）
亚铁氰化钾	Electron Microscopy Sciences	20150	用于电子显微镜组织制备（步骤5）
视网膜电图用参考电极和接地电极	Chalgren Enterprises	110-63	不锈钢针，0.4 mm × 37 mm
二甲胂酸钠缓冲液	Electron Microscopy Sciences	12300	用于电子显微镜组织制备（步骤5）
Ster MD	União Química Farmacêutica Nacional S/A	MS-1.0497.1287	醋酸泼尼松龙 0.12%
Terolac	Cristália Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda	MS-1.0497.1286	酮咯酸氨丁三醇 0.5%
Terramicina	Laboratórios Pfizer Ltda	MS-1.0216.0024	盐酸土霉素 30 mg/g + 多粘菌素B 10,000 U/g
Tono-Pen XL	Reichert Technologies	230635	数字压平式手持眼压计
TO-PRO-3	Thermo Fisher Scientific	T3605	远红荧光核复染剂；发射波长 661 nm
吐温 X-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5	非离子型表面活性剂
醋酸铀酰	Electron Microscopy Sciences	22400	用于电子显微镜组织制备（步骤5）
Xilazin	Syntec do Brasil Ltda	7899	盐酸赛拉嗪 2%
	Carl Zeiss	-	用于手术和视网膜解剖的体视显微镜