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方法文章

啮齿类动物手术诱导青光眼的角膜缘血管丛全周电凝术

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DOI：

10.3791/63442

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2022年2月15日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro

本文内容

摘要

本实验方案的目的是表征一种基于360°热凝烧灼角膜缘血管丛以诱导亚急性眼内高压的青光眼神经变性新模型。

摘要

青光眼是全球导致失明的第二大原因，是一组具有异质性的眼部疾病，其特征为视神经结构损伤和视网膜神经节细胞（RGC）变性，通过中断视觉信息从眼睛向大脑的传递而导致视觉功能障碍。眼内压升高是最重要的危险因素；因此，研究人员已通过遗传或实验方法在啮齿类动物中建立了多种眼高压模型，以探究该疾病的病因与病理机制。在这些模型中，已报道存在若干局限性，例如手术侵入性强、功能评估不足、需要大量培训以及视网膜损伤程度变异较大。本研究描述了一种简单、低成本且高效的方法，通过低温对角膜缘血管丛——房水引流系统的主要组成部分——进行全周烧灼，从而在啮齿类动物中诱导眼高压。该新模型技术操作简便、非侵入性强、可重复性好，可产生亚急性眼高压，并伴随进行性RGC和视神经变性，且具有独特的术后临床恢复率，允许 体内 通过电生理学和行为学方法进行的功能研究。

引言

医学文献将青光眼理解为一组异质性的视神经病变，其特征是视网膜神经节细胞（RGCs）及其树突、胞体和轴突进行性退化，导致视盘结构性凹陷（挖空）以及视神经功能恶化，若未得到有效控制，最终会因中断视觉信息从眼睛向大脑的传递而导致失明1。目前，青光眼是全球范围内不可逆性失明的最主要原因，预计到2040年将影响约1.118亿人2，因而严重影响患者的生活质量（QoL），并引发重大的社会经济问题3。

眼内压（IOP）升高是青光眼发生和进展最重要的、也是唯一可调节的危险因素。在多种类型的青光眼中，除正常眼压性青光眼（NTG）外，其余所有类型在疾病临床病程中的某个阶段均伴有眼内压升高。尽管在降低眼内压以减缓或阻止疾病进展方面已取得显著的临床和手术进展，患者仍可能因青光眼而丧失视力4,5。因此，深入理解该疾病复杂且多因素的病理生理机制，对于开发更有效的治疗方法至关重要，尤其是为视网膜神经节细胞（RGCs）提供神经保护。

在研究疾病机制的多种实验方法中，基于眼内压升高（OHT）的动物模型最接近人类青光眼。啮齿类动物模型尤其有用，因为它们 成本低、易于操作 ，可进行遗传操作，寿命短，并具有与人类相似的眼部解剖和生理特征，例如房水的生成与引流6,7,8,9,10,11,12,13。目前使用的模型包括：向巩膜上静脉注射高渗盐水导致小梁网硬化14、前房注射微珠15 或黏弹性物质16、涡静脉烧灼17、使用氩激光对小梁网进行光凝18、角膜缘周围缝扎19，以及使用与年龄相关的OHT转基因模型（DBA/2J小鼠）8。然而，现有模型存在一些已报道的缺陷，如侵入性强、术后角膜混浊、眼前段结构破坏、学习曲线长、设备昂贵以及术后眼内压（IOP）变异大等，因此亟需开发一种替代性OHT模型以克服这些问题20,21,22。

本方案确立了一种基于啮齿类动物角膜缘血管丛烧灼术（LPC）诱导高眼压（OHT）以模拟青光眼的新型手术方法23一种简便、可重复、易于操作且非侵入性的模型，可实现高效、低变异的眼压升高，并具有独特的高比例完全临床恢复，因而提供 在体 在每次实验中使用较少数量的动物即可完成功能评估。该手术技术可诱导出亚急性眼压升高，眼压在数天内逐渐恢复至基线水平，模拟了急性闭角型青光眼中所见的高血压发作。此外，该模型在眼压恢复后仍持续出现青光眼性神经退行性变，这对于研究在人类青光眼中即使眼压得到良好控制后仍发生的视网膜神经节细胞继发性退变的机制具有重要意义。

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方案

所有操作均遵循视觉与眼科研究协会（ARVO）发布的《眼科与视觉研究中动物使用声明》，并经里约热内卢联邦大学健康科学中心动物实验伦理委员会批准（方案编号 083/17）。本研究使用了2-3月龄、体重180-320 g的Lister Hooded大鼠，雌雄均有。然而，该操作可适用于不同品系及不同年龄范围的大鼠。

1. 眼压升高手术及临床随访

  1. 在受控温度环境和12小时光照/黑暗循环（上午6点开灯，下午6点关灯）条件下饲养实验动物，提供标准颗粒状γ射线辐照饲料（Nuvilab® CR-1，Quimtia S/A，巴西）和经过三重过滤（含无毒活性炭）的饮水 随意摄取.
  2. 配制一种麻醉剂储备混合液，由三份10%盐酸氯胺酮和一份2%盐酸赛拉嗪（溶剂：无菌水）组成。
  3. 轻轻抓住动物背部皮肤以固定，并通过以下方法诱导麻醉 按每克体重1 µL的剂量腹腔注射混合物（氯胺酮：75 mg/kg；赛拉嗪：5 mg/kg）。约5分钟后通过夹趾反应检查麻醉效果。
  4. 使用0.5%盐酸丙美卡因滴眼液对双眼表面进行局部麻醉。等待30-60秒后，用无菌小棉签轻轻接触鼻侧或外侧球结膜，清除眼球前部残留的溶液。
  5. 将动物置于实验台面上的仰卧位，使其角膜表面易于接触眼压计探头，测量实验眼及对侧对照眼的基础眼压。
  6. 使用压平式或回弹式手持眼压计（图1A将眼压计探头置于与角膜中央区垂直的位置，使其轻微接触角膜。获取3至5次可靠的仪器自动平均值。每次平均值由设备在完成六次成功的单次测量后自动计算得出。
    1. 将回弹式眼压计装入探针，将设备尖端朝上放置，然后按一次测量按钮以开机，以避免探针脱落。开机后，显示屏将显示 00 表明设备已准备就绪，可以进行测量。
    2. 将设备置于探头尖端距离角膜1-4 mm的位置，快速而小心地按下测量按钮进行测量，过程中不得移动设备。每次成功测量均会发出短促的蜂鸣声提示，完成六次测量后，设备屏幕将显示平均值。
      注意：尽管压平式眼压计使用经验丰富，但作者建议采用回弹式眼压计以优化整个操作流程，后者更易于获得可靠的眼内压测量值。
  7. 将动物置于体视显微镜下稍呈侧卧位，于40倍放大下观察实验眼，仔细规划手术方案。操作过程中切勿忘记通过滴加羧甲基纤维素钠或透明质酸钠滴眼液，保持对侧对照眼的湿润。
  8. 借助弯钳，轻柔地向前推动实验眼球，以暴露围绕角膜缘360°的血管网络13用另一只手，使用低温眼科电灼器（1,300 °F；Bovie Medical, USA）轻轻烧灼角膜周围的所有血管（图1B-).
    注意：所述电灼器具有圆形尖端，应纵向接触角膜缘血管。
  9. 注意避免烧灼角膜周边部，因为这可能导致术后角膜混浊，从而妨碍后续观察 体内 视网膜功能评估
  10. 观察手术眼巩膜缘出现的小圆形烧灼痕迹、角膜缘血管闭塞以及瞳孔散大，这些是手术成功的标志。
    注意：由于大鼠和小鼠的角膜缘血管结构在解剖学上相似13,24 并且所使用的电灼器具有轻柔的细小尖端，该方案也可直接用于小鼠眼睛，无需任何调整。
  11. 术后检查双眼的眼压，方法如步骤1.5所述。
  12. 滴加一滴眼用醋酸泼尼松龙（1.2 mg/mL），使其与实验眼的前表面接触约40秒，随后更换为抗生素眼膏（盐酸土霉素30 mg/g加多粘菌素B 10,000 U/g；或环丙沙星3.5 mg/g）。术后给予盐酸曲马多肌肉注射（单次剂量；2 mg/kg）以预防疼痛。
  13. 密切观察动物从麻醉中的恢复情况，最好在温暖的环境中进行，例如使用加热垫，或将其置于铺有适当垫料的饲养笼内。注意观察其呼吸模式。
  14. 每天对实验眼进行临床随访，使用局部药物治疗，包括非甾体抗炎药（NSAID，例如酮咯酸氨丁三醇0.5%滴眼液）和抗生素眼膏（ preferably 与术后立即使用的相同）。
    注意：建议使用非甾体抗炎药（NSAID）而非甾体类抗炎眼药水，因为后者可能诱发眼压升高，且常用于啮齿类动物糖皮质激素诱导性青光眼模型的建立。
    1. 在轻度镇静（氯胺酮：18.75 mg/kg；赛拉嗪：1.25 mg/kg）条件下，优先选择每天相同时间段测量眼内压（IOP），以避免因生理性昼夜节律性眼内压波动而产生偏差。
    2. 在眼部检查期间，需注意罕见的临床并发症，如前房积血、角膜纤维化或与葡萄膜脱出相关的巩膜变薄。角膜水肿、结膜水肿和结膜充血较为常见，但为暂时性表现。
    3. 术后约第7天可见完全的临床恢复。角膜缘血管重建通常在术后前两天开始，与眼压预期逐渐恢复至基线水平相一致。

2. 视动反应（OMR）分析

注意：本实验步骤使用了特定系统25。

  1. 将四台计算机显示器排列成四边形，围成一个中央带有平台的实验区域。在显示器上显示一个虚拟圆柱体的图像，该圆柱体具有垂直方向的正弦波光栅（交替的黑白条纹），并以恒定速度（12度/秒）和对比度（100%）绕平台旋转。
  2. 在平台正上方放置一台摄像机，以便实验者观察动物的运动。实验在明视觉条件下进行，并将软件优先设置为手动/独立模式，以分别评估每只眼睛的反应。
  3. 让动物在平台上适应约2分钟。在动物自由活动时，将视频画面上的红色十字准星光标保持在其两眼之间，该光标指示虚拟圆柱体的中心位置（图1G）25。
  4. 观察由旋转光栅诱发的动物头部和颈部的反射性追踪行为，即视动反应（OMR）。通过分别顺时针和逆时针旋转正弦波光栅的方向，测试左侧和右侧的视觉通路。
    1. 首先呈现低空间频率的刺激（0.042 周/度），然后逐步增加频率，直至不再观察到追踪运动。能够引发清晰视动反应的最高空间频率即为被测眼的阈值空间频率。
    2. 若动物在测试过程中从平台上掉落，应立即将其放回平台并继续测试。

3. 图形视网膜电图（PERG）的记录

注意：视网膜电图采用特定的信号处理系统以及用于波形存储和分析的相关软件进行记录。

  1. 通过肌内注射盐酸氯胺酮和盐酸赛拉嗪（分别为 75 mg/kg 和 5 mg/kg）使动物深度麻醉。深度麻醉（外科麻醉平面）可减少检查过程中因不自主肌肉运动或其他噪声源引起的伪迹。通过夹捏足趾观察有无反应来确认麻醉效果是否充分。
    注意：上述麻醉剂不会影响反应幅度26。由于将插入角膜的小针作为活性电极，因此优先选择肌内麻醉而非腹腔注射，因为若大鼠需要追加剂量（初始剂量的一半）时，肌内注射更易于重复给药，且电极位置变动的可能性较低，从而在整个实验过程中（可持续长达 60 分钟）获得更可重复的记录。
  2. 使用 0.5% 盐酸丙美卡因滴眼液对角膜进行局部麻醉，并用眼科润滑剂保持对侧眼的湿润。
  3. 将活性电极（不锈钢针，0.25 mm × 15 mm）小心插入角膜颞侧周边部。同时，将参考电极和接地电极（不锈钢针，0.4 mm × 37 mm）分别插入同侧眼外眦的皮下组织和一只后肢中（图 1I）。
  4. 进行模式视网膜电图（PERG）时，设置刺激为黑白翻转的棋盘格图形，以每秒 15 次翻转的频率交替，平均亮度保持恒定（250 cd/m²）。将带通滤波器设置为 1 Hz–100 Hz。
    注意：快速翻转刺激可产生稳态 PERG，这是一种稳定且可重复的正弦波形，包含了最可能与视网膜神经节细胞（RGC）生物电反应相关的波组成分，即瞬态 PERG 中的 NII 偏转。
  5. 将动物置于距刺激屏幕 20 cm 处（LCD 显示器，0.58 m； 图 1I），监测信号基线，然后按下采集系统上的 分析 按钮开始 PERG 信号采集。 
  6. 在操作过程中，保持动物适应环境光照（约 140 lux 的白光）。本实验中，以随机顺序呈现六种不同的空间频率（单位：周/度：0.018、0.037、0.073、0.146、0.292、0.585）。
    注意：用于信号处理的软件会自动进行平均化处理。通常对 200–300 个独立波形进行平均即可有效突出于背景噪声，从而用于分析波幅。

4. 视网膜神经节细胞胞体的定量分析

注意：以下步骤用于基于视网膜平铺切片的免疫组织化学染色，通过针对脑特异性同源盒/POU结构域蛋白3A（Brn3a）的抗体对标记的视网膜神经节细胞胞体进行定量分析。

  1. 对实验动物实施颈椎脱位法安乐死，操作前应 通过吸入二氧化碳诱导意识丧失。
  2. 安乐死后立即在体视显微镜下用有齿镊和弯头剪刀解剖双眼。
  3. 仔细解剖，使眼外肌的远端部分和泪阜仍附着于眼球，因其为视网膜地形定位的重要解剖标志（见步骤4.5）。尽量保留尽可能长的一段与眼球相连的视神经，以供后续分析使用。
  4. 摘除眼球后，将眼睛置于含有1 mL 4%多聚甲醛（4% PFA）的0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS）中，固定24小时以确保充分的化学固定。
  5. 将视网膜与其余眼组织分离。
    1. 在解剖显微镜下，将眼球置于盛有1×PBS的培养皿中，并注意重要的解剖标志，如鼻侧泪阜、脉络膜裂和涡静脉的巩膜压迹，以确保正确的位置定向。27.
    2. 使用有齿镊和弯剪（Westcott）从角膜中央穿入前房。在巩膜的上方（背侧）做两个朝向视神经巩膜孔的放射状切口，以界定眼球的背侧象限。
    3. 在巩膜角膜缘处沿纵向进行360°环形切割，将角膜与眼球其余部分分离。移除晶状体和虹膜，并利用上述步骤（4.5.2）所述的相同巩膜放射状标记界定背侧视网膜象限。
    4. 小心地将视网膜组织从脉络膜和巩膜上分离，避免在组织中造成随机撕裂以及最终丧失拓扑定位方向。
    5. 将睫状体与视网膜分离 锯齿缘使用弯头无齿镊和弯头剪刀（牵拉玻璃体并在内界膜附近进行分离）以及小毛刷，仔细去除视网膜杯中残留的玻璃体。
      注意：去除玻璃体是获得强而清晰的免疫组织化学信号的重要步骤。
  6. 将分离的视网膜转移至24孔培养板中（每孔一个视网膜），每孔加入1 mL 1×PBS，保持视网膜内层朝上。
  7. 用含0.5%非离子型表面活性剂的1×PBS（0.3 mL）洗涤组织3次，每次10分钟，以进行透化处理。随后将组织置于含有5%牛血清白蛋白（BSA）、2%非离子型表面活性剂和1×PBS的封闭液（0.25 mL）中，室温下轻轻振荡孵育60分钟。
  8. 在步骤4.7中，将Brn3a一抗按1:200比例溶于含0.5%非离子型表面活性剂和5% BSA的1x PBS溶液中，配制抗体工作液，并于4 °C保存。
  9. 组织块制备60 min后，将视网膜置于4 °C、0.2 mL一抗溶液中孵育72 h，期间轻柔振荡。
  10. 用1×PBS清洗组织3次，每次10分钟，然后将组织在含有5% BSA的1×PBS中稀释1:750的二抗溶液0.2 mL中，室温孵育2小时。
  11. 此外，将组织在核复染溶液中孵育10分钟，以进行荧光核染色。最后用1×PBS（0.3 mL）洗涤3次，每次重复，完成免疫组织化学染色步骤。
  12. 借助两把小刷子将视网膜转移至玻璃载玻片上，保持玻璃体面朝上。将背侧视网膜象限朝上放置于载玻片上（此前已在步骤4.5.3中划定边界）。再作两条朝向视神经头的放射状切口，以界定其余三个象限（鼻侧、腹侧和颞侧）。
    注意：切割的尺寸并非固定不变。尺寸不应过短，以免影响视网膜在载玻片上有效展平；也不应过长，以免达到视神经孔并使所界定的视网膜象限完全脱离其余组织。
  13. 最后，在玻璃盖玻片上滴加0.2 mL抗荧光淬灭封片剂，将其覆盖于平铺的视网膜组织上，用于显微镜观察。为评估视网膜神经节细胞（RGCs）密度，使用40x/1.3物镜在共聚焦落射荧光显微镜下观察平铺样品。
  14. 对于视网膜的每个象限，拍摄八张照片：中央视网膜区两张（距视盘约0.9 mm），中周视网膜区三张（距视盘约2.0 mm），周边视网膜区三张（距视盘约3.7 mm），每只视网膜共拍摄32张照片。使用FIJI软件计数Brn3a阳性细胞，并估算平均细胞密度。

5. 视神经检查

  1. 安乐死后摘除眼球（步骤 4.1–4.3），切取视神经眶内段近端部分（1–2 mm），包括部分眼内段，并立即将样本放入含有 0.2–0.3 mL 冷固定液（含 2.5% 戊二醛的 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液，pH 7.4）的样品管中，固定 2 小时。
    注意：以下视神经处理步骤均在步骤 5.1 的同一管中进行
  2. 用冷的 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液清洗材料 3 次，每次 5 分钟。在 4 °C 条件下，于含 1.0% 四氧化锇、0.8% 铁氰化钾和 5 nM 氯化钙的 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液（0.1–0.2 mL）中轻轻振荡后固定 1 小时。
  3. 用冷的 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液清洗视神经片段 3 次，每次 5 分钟，随后用冷蒸馏水清洗 3 次，每次 1 分钟。在 4 °C 条件下，将材料置于含 1.0% 醋酸铀的蒸馏水溶液中染色过夜（0.1–0.2 mL），并轻轻振荡。再用冷蒸馏水清洗片段 3 次。
  4. 使用梯度丙酮溶液（每次 0.5 mL）逐步脱水：在冰浴丙酮中分别进行以下步骤：15% 丙酮，2 次，每次 7 分钟；30% 丙酮，2 次，每次 7 分钟；50% 丙酮，2 次，每次 7 分钟；70% 丙酮，2 次，每次 7 分钟；80% 丙酮，2 次，每次 7 分钟；90% 丙酮，2 次，每次 7 分钟；最后在室温下用 100% 丙酮处理 2 次，每次 15 分钟。
  5. 进行 3 次渗透/包埋步骤，依次更换以下溶液：环氧树脂:丙酮 = 1:2（总体积 0.5 mL），室温处理 12 小时；环氧树脂:丙酮 = 1:1（总体积 0.5 mL），室温处理 12 小时；环氧树脂:丙酮 = 2:1（总体积 0.5 mL），室温处理 12 小时。最后在纯环氧树脂中室温渗透 24 小时。
  6. 将样品从样品载体中取出，转移至包埋模具中，在 60 °C 下聚合 48 小时。使用超薄切片机对视神经片段进行横切，制备半薄切片（300–400 nm），收集切片并转移至显微镜载玻片上。用甲苯胺蓝染色，并在光学显微镜下以 100 倍放大倍数成像。
  7. 进行超微结构分析时，制备超薄横切片（70 nm），将切片收集于铜网上，用醋酸铀和柠檬酸铅染色。在透射电子显微镜下观察切片。

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结果

定量变量以均值 ± 均值标准误（SEM）表示。除眼压（IOP）动态在高眼压（OHT）组与对照组之间的比较（图1F）外，统计分析均采用双因素方差分析，随后进行Sidak多重比较检验。以p值 < 0.05为具有统计学显著性。

图1展示了全周角膜缘丛烧灼（LPC）模型的手术步骤，关键解剖标志包括360°热诱导的角膜缘血管消失，以及手术结束时患眼出现轻度至中度瞳孔散大。

在本系列131只大鼠中，全周角膜缘脉丛烧灼术（LPC）导致术后即刻眼压从基线水平的13.0 ± 0.2 mmHg升高至22.7 ± 0.4 mmHg。术后眼压峰值出现在术后第1天（25.3 ± 0.6 mmHg），随后逐渐恢复至基线水平，于第6周时达到稳定th 术后第几天（统计分析：采用 Holm-Sidak 法进行多重比较校正的多次 t 检验； 图1F）。角膜纤维化或...

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讨论

角膜缘血管丛烧灼术（LPC）是一种新型的术后小梁模型，其优势在于靶向易于接触的血管结构，无需结膜或腱膜分离17,28。与涡静脉烧灼模型（一种基于脉络膜静脉引流功能受损的著名高眼压模型）不同，在LPC模型中，由于角膜缘静脉位于房水外流通路的上游，静脉淤血不会影响眼内压升高。此外，该技术易于掌握且成本较低，主要需要低温热凝设备即可完成。更重要的是，该模型具有独特的高眼压诱导率和完全临床恢复率（> 90%，如先前报道）23，从而减少了实验所需动物数量，并支持进行电生理学和行为学分析。最后，术后相对较短时间内即可观察到视网膜神经节细胞层和视神经均出现青光眼性退行性改变，适用于短期或中期实验设计23。未来仍需进一步研究以阐明全周角膜缘血管系统烧灼对各视网膜分层的具体影响。

手术方案中的关键步骤包括：（1）电凝针尖必须平行于血管轴轻轻接触巩膜缘；（2）在电凝过程中以及动物操作过...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢实验室技术人员 José；Nilson dos Santos、Daianne Mandarino Torres、José Francisco Tibúrcio、Gildo Brito de Souza 以及 Luciano Cavalcante Ferreira。本研究由 FAPERJ、CNPq 和 CAPES 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
丙酮Isofar201用于电子显微镜组织制备（步骤5）
视网膜电图用活性电极Hansol Medical Co-不锈钢针，0.25 mm × 15 mm
AnestalconNovartis Biociências S/AMS-1.0068.1087盐酸丙美卡因 0.5%
氯化钙Vetec560用于电子显微镜组织制备（步骤5）
低温精细尖烧灼器 10/盒Bovie Medical CorporationAA00低温眼科烧灼器
CetaminSyntec do Brasil Ltda000200-3-000003盐酸氯胺酮 10%
DAKODako North AmericaS3023抗荧光淬灭封片剂
DAPIThermo Fisher Scientific28718-90-3二脒基-2-苯基吲哚；蓝色荧光核复染剂；发射波长 452±3 nm
EcofilmCristália Produtos Químicos Farmacêuticos LtdaMS-1.0298.0487羧甲基纤维素钠 0.5%
EPON 树脂Polysciences, Inc.-用于电子显微镜的环氧树脂，由四种试剂混合组成：Poly/Bed 812 树脂（货号#08791）；DDSA - 十二烯基琥珀酸酐（货号#00563）；NMA - 纳迪克甲基酸酐（货号#00886）；DMP-30 - 2,4,6-三（二甲氨基甲基）苯酚（货号#00553）
戊二醛Electron Microscopy Sciences16110用于电子显微镜组织制备（步骤5）
HyabakUnião Química Farmacêutica Nacional S/AMS-8042140002透明质酸钠 0.15%
Icare TonolabIcare Finland OyTV02（型号）手持式回弹式眼压计
驴抗小鼠 IgG 抗体 + Alexa Fluor 555Thermo Fisher ScientificA31570二抗溶液
23 英寸 LCD 显示器Samsung Electronics Co. Ltd.S23B550型号 LS23B550，用于视网膜电图记录
LSM 510 MetaCarl Zeiss-共聚焦落射荧光显微镜
MaxifloxCristália Produtos Químicos Farmacêuticos LtdaMS-1.0298.0489环丙沙星 3.5 mg/g
MEB-9400KNihon Kohden Corporation-视网膜电图记录系统
单克隆小鼠 IgG1 抗 Brn3a 抗体MilliporeSigmaMAB-1585Brn3a 一抗溶液
Neuropack Manager v08.33Nihon Kohden Corporation-视网膜电图信号处理软件
OptomotryCerebralMechanics-视觉运动反应分析系统
四氧化锇Electron Microscopy Sciences19100用于电子显微镜组织制备（步骤5）
亚铁氰化钾Electron Microscopy Sciences20150用于电子显微镜组织制备（步骤5）
视网膜电图用参考电极和接地电极Chalgren Enterprises110-63不锈钢针，0.4 mm × 37 mm
二甲胂酸钠缓冲液Electron Microscopy Sciences12300用于电子显微镜组织制备（步骤5）
Ster MDUnião Química Farmacêutica Nacional S/AMS-1.0497.1287醋酸泼尼松龙 0.12%
TerolacCristália Produtos Químicos Farmacêuticos LtdaMS-1.0497.1286酮咯酸氨丁三醇 0.5%
TerramicinaLaboratórios Pfizer LtdaMS-1.0216.0024盐酸土霉素 30 mg/g + 多粘菌素B 10,000 U/g
Tono-Pen XLReichert Technologies230635数字压平式手持眼压计
TO-PRO-3Thermo Fisher ScientificT3605远红荧光核复染剂；发射波长 661 nm
吐温 X-100Sigma-Aldrich9036-19-5非离子型表面活性剂
醋酸铀酰Electron Microscopy Sciences22400用于电子显微镜组织制备（步骤5）
XilazinSyntec do Brasil Ltda7899盐酸赛拉嗪 2%
Carl Zeiss-用于手术和视网膜解剖的体视显微镜

参考文献

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