本文介绍了一种用于筛选土壤生物多样性中参与难降解材料降解的真菌菌株的实验方案。首先，分离能够在腐殖酸或木质纤维素上生长的真菌菌株，随后通过酶学实验以及对烃类和塑料等污染物的降解能力测试其活性。
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摘要
摘要
环境污染问题日益严重，鉴定参与生物修复过程的真菌是一项至关重要的任务。土壤中蕴藏着极为丰富的微生物多样性，是获取此类生物修复真菌的良好来源。本研究旨在通过多种筛选试验，寻找具有生物修复潜力的土壤真菌。采用以难降解物质作为唯一碳源的矿物培养基进行真菌生长试验。首先，将土壤稀释液接种于添加了腐殖酸或木质纤维素的矿物培养基平板上。对生长出的真菌菌落进行分离，并在不同底物上进行测试，包括复杂的烃类混合物（如凡士林和废机油）以及多种塑料聚合物粉末（PET、PP、PS、PUR、PVC）。在生长试验基础上，结合定性酶学检测，分析酯酶、漆酶、过氧化物酶和蛋白酶的产生情况。这些酶参与难降解物质的主要降解过程，所筛选真菌菌株若能组成型分泌这些酶，则具有应用于生物修复的潜力。本研究分离并测试了100多个菌株，发现多个具有较好生物修复潜力的菌株。综上所述，所描述的筛选方法是一种简便且低成本的从土壤中鉴定具有生物修复潜力真菌菌株的技术。此外，可根据实际需求，在基础培养基中添加其他难降解物质，从而针对不同污染物定制相应的筛选试验。
引言
土壤是地球上生命的基本组成部分，也是许多生态系统的基础。土壤中的矿物质、有机质和微生物可被视为一个系统，它们之间存在着密切的关联与相互作用。这些化合物之间的相互作用对陆地过程、环境质量和生态系统健康具有重要影响1。土壤污染在全球范围内造成了严重的环境问题。农药、石油产品、塑料及其他化学品等难降解且有毒物质的随意、长期和过量施用，对土壤生态产生严重影响，并因此可能改变土壤微生物群落。土壤中的微生物群落由多种处于不同生理状态的生物组成，其中大多数为细菌和真菌。土壤中的许多污染物具有中长期稳定性，其持久性可能导致微生物进化出适应性机制，从而利用这些难降解物质作为营养源2,3。因此，这些微生物可被用于生物修复技术。
生物修复利用微生物及其酶来降解或转化废弃物，使其变为毒性较低或无毒的化合物，从而减轻污染的影响。古菌、细菌、藻类和真菌等多种生物均具有这种生物修复能力4。由于真菌具有独特的降解作用，因此在生物修复中尤为具有前景。它们通过菌丝网络攻击不同的底物，能够比其他微生物更有效地穿透土壤基质。此外，它们还能进入污染物难以清除的不可及孔隙5，并且能够在低湿度条件下存活6。更重要的是....
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方案
1. 从土壤中筛选能够降解难降解材料的真菌菌株
- 抗生素溶液的配制。
- 将青霉素（50 mg/L）、链霉素（40 mg/L）、氯四环素（40 mg/L）、新霉素（100 mg/L）和氯霉素（100 mg/L）加入250 mL去离子无菌水中。
- 在将氯霉素加入抗生素溶液之前，先将其溶解于3 mL浓度≥99%的乙醇中。
- 将抗生素溶液置于磁力搅拌器上（不加热），并在溶液中放入磁力搅拌子搅拌10分钟。储存于4 °C条件下。
- 培养基的配制。
- 将1 g商品化腐殖酸、3.26 g Bushnell-Haas肉汤（BH）和15 g琼脂加入1 L去离子水中，于121 °C条件下高压灭菌20分钟（腐殖酸琼脂）。
- 在超净工作台内将腐殖酸琼脂倒入培养皿中。
- 将4 g木质纤维素、3.26 g BH和15 g琼脂加入1 L去离子水中，于121 °C条件下高压灭菌20分钟（木质纤维素琼脂）。
- 在超净工作台内将木质纤维素琼脂倒入培养皿中。
- 在超净工作台内，待培养基在培养皿中凝固后，使用带有0.2 µm滤膜的无菌注射器吸取1 mL抗生素溶液并加至已制备的平板上，以实现灭菌。
- 使用无菌一次性L型涂布棒将抗生素溶液均匀涂布于平板表面，并在超净工作台内自然晾干。 ....
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结果
选择性培养基方法（方案第1部分）能够对土壤中丰富的生物多样性进行筛选，并选出具有高生物修复潜力的真菌。利用腐殖酸和木质纤维素培养基，分离出超过100株真菌。这些真菌可产生参与难降解天然物质生物降解的酶类，而这些天然物质的化学结构与许多污染物相似。然而，通过选择性培养基分离得到的真菌菌株仍需进一步筛选。具体而言，选择性试验用于分离能够降解腐殖酸和木质纤维素的菌株，生长试验则用于筛选能够以特定污染物作为唯一碳源生长的真菌，定性酶活性试验则用于描述其代谢活性。
生长试验主要针对真菌降解碳氢化合物（凡士林和废发动机油）以及塑料（PET、PVC、HDPE、PS、PUR）的能力。在试验中，每种物质均作为所选真菌菌株的唯一碳源。通过比较添加该物质的样品与仅含基本培养基（根据试验不同为BH或BHA）的对照样品之间的菌落生长差异，评估真菌利用这些物质的能力。结果采用定性评分标准进行描述（图1），评分范围从与对照组无生长差异（0），到低（+）、中（++）和高（+++）程度的生长差异。
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讨论
土壤丰富的生物多样性是真菌的丰富来源，这些真菌具有多种代谢能力，其中一些可能成为生物修复的潜在候选者。选择性培养基试验（方案第1部分）是易于操作且有效的方法，可用于分离能够以天然复杂聚合物作为唯一碳源生长的真菌。真菌可产生胞外非特异性水解酶和氧化还原酶30，例如木质素降解酶漆酶和过氧化物酶31。这些酶可降解木质纤维素和腐殖酸，同时也可降解多种不同的异生物质，包括烃类、芳香族化合物和氯化有机化合物32。
所述方法产生的结果易于解读，且实施成本较低。这些特点使其可被非专业人员使用。然而，某些方面，如无菌操作和形态学鉴定，需要特别注意。例如，土壤悬液振荡30分钟（步骤1.3.4）是必要的，以使真菌孢子和繁殖体从土壤微结构中释放出来，并悬浮于溶液中。通过此方式，对土壤悬液进行稀释涂布，即可分离出最多种类的真菌菌株。对真菌菌株进行宏观和显微形态学鉴定，有助于区分不同菌株，避免重复分离同一真菌菌株。此外，保持无菌状态并防止微生物污染至关重要，因为其他活.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢帕维亚大学高等博士培训学院（SAFD）以及索尔维格·托西教授为本工作提供了机会。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96 孔微孔板 | Greiner bio-one | 650185 | |
| 琼脂 | VWR | 84609.05 | |
| Bushnell-Haas 肉汤 | Fluka | B5051 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| 氯霉素 | Eurobio | GABCRL006Z | |
| 金霉素 | Sigma-Aldrich | Y0001451 | |
| CoCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| CuCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3279 | |
| 乙醇 | VWR Chemicals | 20821.296 | |
| FeCl3·6H2O | Sigma-Aldrich | 236489 | |
| 0.2 µm 滤膜 | Whatman | 10462200 | |
| 没食子酸 | Sigma-Aldrich | G7384 | |
| 玻璃盖玻片 | Biosigma | VBS634 | |
| 15 mL 玻璃小瓶 | SciLabware | P35467 | |
| 愈创木酚 | Sigma-Aldrich | G5502 | |
| 高密度聚乙烯 (HDPE) | Sigma-Aldrich | 434272 | |
| 腐殖酸 | Aldrich Chemistry | 53680 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P8281 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| 木质纤维素 | / | / | 经灭菌处理的生物乙醇生产废弃物 |
| L 形涂布棒 | Laboindustria S.p.a | 21133 | |
| 磁力搅拌器 | A.C.E.F | 8235 | |
| 麦芽提取物肉汤 | Sigma-Aldrich | 70146 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | M2643 | |
| 1000 μL 微量移液器 | Gilson | FA10006M | |
| 200 μL 微量移液器 | Gilson | FA10005M | |
| MnCl2·4H2O | Sigma-Aldrich | M5005 | |
| Na2MoO4·2H2O | Sigma-Aldrich | M1651 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| 新霉素 | Sigma-Aldrich | N0401000 | |
| 青霉素 | Sigma-Aldrich | 1504489 | |
| 蛋白胨 | Sigma-Aldrich | 83059 | |
| 聚对苯二甲酸乙二醇酯 (PET) | Goodfellow | ES306031 | |
| 培养皿 | Laboindustria S.p.a | 21050 | |
| 凡士林（液体石蜡） | A.C.E.F | 009661 | |
| 马铃薯葡萄糖肉汤 | Sigma-Aldrich | P6685 | |
| 聚苯乙烯 (PS) | Sigma-Aldrich | 331651 | |
| 聚氨酯 (PUR) | Sigma-Aldrich | GF20677923 | |
| 聚氯乙烯 (PVC) | Sigma-Aldrich | 81388 | |
| 无菌离心管 | Greiner bio-one | 227 261 | |
| 20 mL 无菌玻璃小瓶 | Sigma-Aldrich | SU860051 | |
| 1000 μL 无菌吸头 | Gilson | F172511 | |
| 200 μL 无菌吸头 | Gilson | F172311 | |
| 无菌聚乙烯袋 | WHIRL-PAK | B01018 | |
| 无菌注射器 | Rays | 5523CM25 | |
| 链霉素 | Sigma-Aldrich | S-6501 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 | |
| 使用过的发动机油 | / | / | 由意大利一家私营公司提供的碳氢化合物、发动机添加剂和金属的复杂混合物 |
| 50 mL 小瓶 | Sigma-Aldrich | 33108-U | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | Z0152 |
参考文献
- Mohammadi, K., Heidari, G., Khalesro, S., Sohrabi, Y. Soil management, microorganisms and organic matter interactions: A review. African Journal of Biotechnology. 10 (86), 19840-19849 (2011).
- Daccò, C., Girometta, C., Asemoloye, M. D., Carpani, G., Picco, A. M., Tosi, S.
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重印与许可
