接种策略以感染植物根部的土传微生物

摘要

本方案详细总结了将土传微生物接种至植物根部的策略。以长孢轮枝菌（Verticillium longisporum）和大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）为例，介绍了三种不同的根部侵染体系。文中重点阐述了各体系的潜在应用及可能的后续分析方法，并讨论了每种体系的优缺点。

摘要

根际栖息着一个高度复杂的微生物群落，植物根系在此不断面临挑战。根系与多种多样的微生物密切接触，但针对土传相互作用的研究仍落后于对地上器官的研究。尽管文献中已描述了一些利用模式根部病原体侵染模式植物的接种策略，但要获得系统性的方法学综述仍然困难。为解决这一问题，本文详细描述了三种不同的根部接种体系，可用于深入理解根系-微生物互作的生物学特性。为便于说明， Verticillium 物种（即， V. longisporum 和 V. dahliae）被用作根部侵染的模式病原菌。然而，该方法可轻松适用于其他定殖于根部的微生物——无论是致病性还是有益微生物。通过定殖植物木质部，土传维管束真菌如 Verticillium spp. 具有独特的生活方式。在侵入根部后，它们会扩散 通过 木质部导管向顶运输，到达茎部，并引发病害症状。选取了三种代表性植物作为模式寄主： 拟南芥，具有重要经济价值的油菜（Brassica napus）和番茄（Solanum lycopersicum）。提供了详细的分步操作方案。展示了致病性测定、标记基因转录分析以及报告基因载体独立验证的代表性结果。此外，还深入讨论了每种接种系统的优缺点。这些经过验证的实验方案有助于为根-微生物互作相关研究问题提供研究思路。了解植物如何应对土壤中的微生物，对于开发改进农业的新策略至关重要。

引言

自然土壤中栖息着数量惊人的微生物，它们对植物可能呈中性、有害或有益作用¹。许多植物病原体为土传性，围绕在根部周围并侵袭地下器官。这些微生物属于多种不同的进化分支：真菌、卵菌、细菌、线虫、昆虫以及部分病毒^1,2。一旦环境条件有利于感染，感病植物便会发病，导致作物产量下降。气候变化的影响，如全球变暖和极端天气，将增加土传植物病原体的比例³。因此，研究这些破坏性微生物及其对粮食和饲料生产乃至自然生态系统的影响将变得愈发重要。此外，土壤中还存在与根部密切互作并促进植物生长、发育和免疫能力的互利性微生物。当受到病原体侵袭时，植物可主动招募根际中特定的拮抗微生物，以抑制病原体从而支持宿主存活^4,5,6,7。然而，有益根-微生物互作所涉及的分子机制和信号通路往往仍不清楚⁶。

因此，拓展对根系-微生物相互作用的普遍认知至关重要。为了开展模式研究并将研究成果转化为农业应用，必须建立可....

方案

1. 真菌培养及植物接种系统的培养基

1. 液体马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）：在耐热烧瓶中，将21 g/L PDB溶于超纯水中。
2. 液体察氏葡萄糖肉汤（CDB）：在耐热烧瓶中，将42 g/L CDB溶于超纯水中。
3. 用于培养皿接种系统的培养基：在耐热烧瓶中，将1.5 g/L Murashige和Skoog培养基（MS）与8 g/L琼脂溶于超纯水中。
   注意：该培养基中避免添加糖类，否则接种后会导致真菌过度生长。
4. 用于塑料杯接种系统的培养基：在耐热烧瓶中，将4.4 g/L MS、0.2 g/L MgSO₄、1 g/L KNO₃、0.5 g/L 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）和6.0 g/L琼脂溶于超纯水中，并用5 M KOH调节pH至5.7。
   注意：该培养基中避免添加糖类，否则接种后会导致真菌过度生长。
5. ¼ MS培养基：将1.2 g/L MS溶于超纯水中。
6. 使用高压灭菌锅对上述所有溶液进行灭菌。将玻璃烧瓶放入灭菌篮中，盖紧盖子，在121 °C和98.9 kPa条件下灭菌15分钟。

2. 植物种子表面的灭菌

注意：在播种拟南芥、油菜和番茄种子之前，始终使用以下方案对种子表面....

结果

根据方案，将植物接种 V. longisporum（菌株 Vl43²⁵）或 V. dahliae（分离株 JR2¹⁸）并进行培养。设计了多种实验场景，以验证该方案的有效性并突出其部分功能。图中展示了代表性结果。

参与抗菌性吲哚-葡糖硫苷（IG）生物合成的基因表达诱导是评估Verticillium感染的可靠指标^17,19,26。在拟南芥中，MYB51（MYB结构域蛋白51；AT1G18570）编码一种转录因子，参与激活IG生物合成所需基因的表达²⁷。MYB51可作为指示成功侵染的标记基因，因其在根部持续受到V. longisporum.......

讨论

由于土传植物病原体造成的产量损失巨大¹，亟需改进耕作策略或作物品种。目前对土传病害致病机制的认识仍有限，这阻碍了抗性更强植物的培育。需要深入探究其潜在的致病机制，而这依赖于一个可靠的实验方法平台。已有报道的接种方法表明，通过结合多种系统，可有效解析根系-微生物相互作用中的多因素事件¹⁹。上述方案旨在为本领域的专家以及刚进入该领域的研究人员提供一套常规操作流程。该方法操作简便，可实现独立重复实验，且所需技术设备在标准的植物科学实验室中均具备。

在培养皿系统中可观察早期 Verticillium 感染事件（接种后数小时至6天），在基于土壤的系统中可观察晚期事件（>21天），而在杯式系统中则可观察介于两者之间的时间段（4至21天）。将孢子加入培养皿系统的感染通道后，孢子可直接接触根部，从而便于检测早期防御反应。以MYB51的诱导为例，可通过基因报告系统、qRT-PCR，甚至全基因组范围的"-组学"方法轻松研究基因表达变化

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂（Gelrite）	卡尔·罗特	编号 0039	所有所述系统均需要 Gelrite
拟南芥 野生型	NASC 股票	Col-0 (N1092)
高压灭菌	Systec	VE-100
叶片面积	Datinf GmbH	叶片面积	用于测定叶面积的软件
Brassica napus 野生型	参见 Floerl 等, 2008	快速循环油菜	基因组 ACaacc
头孢噻肟钠	Duchefa	C0111
奇卡内里烧瓶 500 mL	Duran Group / neoLab	E-1090	带四个挡板的锥形瓶
50 mL 收集管	Sarstedt	62.547.254	114 × 28 毫米
Czapek 葡萄糖肉汤培养基	Duchefa	C1714
数码相机	尼康	D3100 18-55 VR
干燥器	Duran Group	200 DN，5.8 L	用盖子密封以容纳氯气
荧光显微镜	Leica	Leica TCS SP5 II
HCl	卡尔·罗斯	P074.3
KNO3	卡尔·罗斯	P021.1	≥ 99 %
KOH	卡尔·罗斯	6751
Leukopor	BSN medical GmbH	2454-00 AP	无纺布胶带 2.5 cm × 9.2 m
MES（2-(N-吗啉代)乙磺酸）	卡尔·罗斯	4256.2	Pufferan ≥ 99 %
MgSO₄4	卡尔·罗斯	T888.1	七水合硫酸镁
穆拉希吉 &Skoog 培养基（MS）	Duchefa	M0222	MS（含维生素）
NaClO	卡尔·罗斯	9062.1
Percival 培养箱	CLF Plant Climatics GmbH	AR-66L2
培养皿	Sarstedt	82.1473.001	大小 ØxH：92 × 16 mm
塑料杯（500 mL，透明）	Pro-pac，沙拉盒	5070	大小：108 × 81 × 102 mm
褶皱纤维素滤膜	Hartenstein	FF12	颗粒保留等级8–12 μm
poly klima 人工气候箱	poly klima GmbH	PK 520 WLED
马铃薯葡萄糖肉汤培养基	SIGMA Aldrich	P6685	用于微生物学
花盆	Pöppelmann GmbH	TO 7 D 或 TO 9.5 D	Ø 7 cm 分别 Ø 9.5 cm
启动子MYB51::YFP	参见 Poncini 等, 2017	MYB51 报告基因系	YFP（即带有NLS的3xmVenus）
2 mL反应管	Sarstedt	72.695.400	PCR性能测试
旋转（轨道）摇床	Edmund Bühler	SM 30 C 控制器
沙（鸟类砂砾）	宠物餐厅，Müller Holding	786157
土壤	特殊育苗土	SP Pikier（SP ED 63 P）
Solanum lycopersicum 野生型	参见 Chavarro-Carrero 等, 2021	类型：Moneymaker
血细胞计数板	Marienfeld	642710	深度 0.020 mm；0.0025 mm2
超纯水（Milli-Q纯化水）	MERK	IQ 7003/7005	经纯化后获得的水
Verticillium dahliae	参见 Reusche 等, 2014	分离 JR2
Verticillium longisporum	Zeise 和 von Tiedemann，2002	菌株 Vl43