使用DNA纤维测定检测人细胞中复制后间隙的积累和修复

Summary

在这里，我们描述了DNA纤维测定的两种修饰，以研究病变诱导后复制DNA的单链DNA间隙。S1纤维测定能够使用ssDNA特异性S1内切酶检测复制后间隙，而间隙填充测定允许间隙修复的可视化和定量。

Abstract

DNA纤维测定是一种简单而稳健的复制叉动力学分析方法，基于在人类细胞DNA合成过程中掺入的核苷酸类似物的免疫检测。然而，这种技术的分辨率有限，只有几千个千基。因此，标准测定无法检测到小至几百个碱基的复制后单链DNA（ssDNA）间隙。在这里，我们描述了利用S1核酸酶的DNA纤维测定的修饰版本，S1核酸酶是一种特异性切割ssDNA的酶。在存在复制后ssDNA间隙的情况下，S1核酸酶将靶向并切割间隙，产生较短的束，可用作正在进行的分叉上ssDNA间隙的读数。这些复制后ssDNA间隙是在不连续复制受损DNA时形成的。它们可以通过与基因组复制分离 的机制进行 修复，该过程称为间隙填充或复制后修复。由于间隙填充机制涉及独立于S期的DNA合成，因此DNA纤维标记方案的改变也可用于监测间隙填充事件。总而言之，DNA纤维测定的这些修饰是了解复制后间隙如何在人类细胞基因组中形成和填充的强大策略。

Introduction

开创性工作提供了在细菌¹和人类细胞^2，3中用DNA损伤剂处理后复制后单链（ssDNA）间隙积累的证据。在复制受损的DNA模板期间，DNA合成机制可以通过采用特定的转座合成DNA聚合酶或通过模板切换机制来绕过病变。或者，重复体也可以简单地跳过病变，留下一个ssDNA间隙，以便以后修复。最近，一项研究清楚地表明，利用电子显微镜可视化复制中间体的特定结构，用基因毒性剂治疗会导致真核生物中的ssDNA间隙⁴。这些复制后间隙区域的形成最初被认为是DNA复制²的半不连续模式的简单结果。在这种情况下，滞后链上的病变可以阻断冈崎片段的伸长，但叉子进展自然被以下冈崎片段挽救，留下ssDNA间隙。然而，进一步的研究表明，在前导链上形成间隙也是可能的，如细菌⁵所示。在真核生物中，PRIMPOL是一种具有primase活性的独特DNA聚合酶，被证明能够通过其重注活性^6，7，⁸，⁹

Protocol

由于该研究使用人类细胞，这项工作得到了圣保罗大学生物医学科学研究所伦理委员会（ICB-USP，批准号#48347515.3.00005467）的批准，用于人类样本的研究。

注:此处描述的协议在以前的出版物中使用，但略有修改^14，16，28。这里的重点是使用紫外线C（UVC）作为DNA损伤剂。然而，其它DNA损伤剂如顺铂和羟基脲也已成功采用²⁸种。该方案可以在一系列细胞系中进行，包括U2OS，HEK293T，人成纤维细胞和其他^14，28，29。在执行此协议之前，必须确定实验问题。使用S1核酸酶（以下称为S1纤维）的DNA纤维测定用于检测复制后ssDNA间隙的存在，而进行间隙填充（或PRR）测定以量化G2期的间隙填充事件。因此，如果分析复制后ssDNA间隙的存在，研究者应执行方案的第2部分（S1纤维实验设置）并直接进入方案的第4部分（通过铺展制备DNA纤维）。如果分析间隙填充事件，研究者应直接进入第3部分（间隙填充（PRR）实验设置）。

Results

在S1纤维测定中，如果用基因毒性剂处理导致复制后ssDNA间隙，则与未处理的样品以及用遗传毒性剂处理但未提交S1裂解的样品相比，S1处理过的细胞核的DNA纤维的总长度在处理DNA损伤时将更短（图1）。

或者，如果与未处理的细胞相比，用S1核酸酶治疗不会显着影响DNA纤维的长度，则可能有不同的解释:（1）使用所使用的遗传毒性剂治疗时，和/或在研究的特定遗传背景中，不会形成复制后ssDNA间隙。事实上，我们之前已经证明，紫外线诱导的6-4光产物（6-4PP）而不是环丁烷嘧啶二聚体（CPD）导致在缺乏核苷酸切除修复的细胞（NER，XP-C细胞）中形成ssDNA间隙¹⁴。（2）ssDNA间隙被修复，无法再检测。（3）单独使用遗传毒性剂治疗诱导的缩短太明显，无法通过S1裂解检测到进一步的缩短。

值得注意的是，S1的缺乏效果也可能反映技术问题，例如S1活性受损的条件，包括S1缓冲液的pH值不合适或锌的量有限。

Discussion

标准DNA纤维测定方案的关键步骤在先前的出版物³²中进行了讨论。在这里，我们描述了标准DNA纤维测定的修饰版本，以研究复制后ssDNA间隙的存在以及通过间隙填充对其进行修复，最初在¹⁴中描述。在复制后ssDNA间隙存在的背景下，在S1 Fiber方案中使用S1核酸酶很可能是在暴露于遗传毒性剂至少1小时后，以允许间隙形成和随后检测的时间。然而，必须注意的是，在某些细胞系或遗传背景中，即使没有用遗传毒性剂^33，34进行额外处理，使用S1核酸酶也可能产生较短的束。因此，至关重要的是要包括所有对照，以确保正确得出结论，使用基因毒性药物治疗是否会导致间隙积累。此外，重要的是通过在ssDNA间隙不再形成或修复的条件下重复测定来进一步验证S1纤维结果。

关于间隙填充（PRR）测定，重要的是优化不影响DNA纤维总长度的UVC剂量/药物浓度，因为结果是按每千碱基密度计算的。如果使用诱导尿路.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
乙酸，冰川	合成	64-19-7	或者，BSA - Biosera - REF PM-T1725/100
氢氧化铵	合成	1336-21-6	或类似
抗体抗小鼠 IgG1 Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11005	-
抗体 抗大鼠 Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21470
-抗体小鼠抗 BrdU	BectonDisckson	347580	-
抗体大鼠抗 BrdU	Abcam	Ab6326	-
生物安全罩	Pachane	PA 410	使用实验室中的罩
BSA（牛血清白蛋白）	Sigma-Aldrich	A3294	或类似
细胞刮刀	Thermo Scientific	179693	或类似
物 CldU	Millipore-Sigma	C6891-Cloridric
acid	Synth	7647-01-0	或类似
共聚焦蔡司 LSM 系列（7、8 或 9）	蔡司		或类似
盖玻片（或盖玻片）	Thermo Scientific	152460	或者，Olen - Kasvi 盖玻片 （24 x 60 mm） - K5-2460
DMEM - 高葡萄糖	LGC/Gibco	BR30211-05/12100046	使用所用细胞系专用的培养基。
EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐二水合物）	Sigma-Aldrich	E5314	或类似
落射荧光显微镜 Axiovert 200	Zeiss	-	或类似
FBS（胎牛血清）	Gibco	12657-029	或类似物
Forma 系列 II 水套式 CO2 培养箱	Thermo Scientific 3110	13-998-074	使用细胞培养箱实验室
载玻片罐	Sigma-Aldrich	S5516	或类似
甘油	Sigma-Aldrich	56-81-5	或类似
Idu	Millipore-Sigma	I7125	-
氯化镁	合成	7791-18-6	或类似
物 甲醇	Merck	67-56-1	或类似
显微镜载玻片	Denville	M1021	或者，Olen - Kasvi显微镜载玻片 - K5-7105 <强>或精密玻璃线 - 7105-1
MOPS （ÁCido 3-Morfolinopropano 1-sulfônico）	Synth	1132-61-2	或类似
诺考达唑	Sigma-Aldrich	31430-18-9-PBS
（磷酸盐缓冲盐水）	Life Thechnologies	3002	或类似
物 青霉素-链霉素	Gibco	15140122	或类似
ProLong Gold 抗淬灭封片剂	Invitrogen	P36930	任何抗淬灭剂溶液免疫荧光
可从 米曲霉	Invitrogen	18001-016	S1 核酸酶 （1/100 - 1/200） 在制造商提供的 S1 核酸酶稀释缓冲液中预稀释，分装并储存在 -20 °C;C
SDS（十二烷基硫酸钠）	BioRad	161-0302	或类似
乙酸钠三水合	Sigma-Aldrich	6131-90-4	或类似
氯化钠	合成器	7647-14-5	或类似
蔗糖	Sigma-Aldrich	57-50-1	或类似的
Tris Base	West Lab Research	BP152-1	或类似的
Triton X-100	Synth	9002-93-1	或类似
的胰蛋白酶	Gibco	25200072	或类似的
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	或类似
的 UVC 灯	非特异性	-	必要：发射长度为 254 nm
VLX-3W 紫外辐射计	Vilber Loumart	-	或类似
醋酸锌	Sigma-Aldrich	557-34-6	或类似产品