使用DNA纤维测定检测人细胞中复制后间隙的积累和修复

Summary

在这里，我们描述了DNA纤维测定的两种修饰，以研究病变诱导后复制DNA的单链DNA间隙。S1纤维测定能够使用ssDNA特异性S1内切酶检测复制后间隙，而间隙填充测定允许间隙修复的可视化和定量。

Abstract

DNA纤维测定是一种简单而稳健的复制叉动力学分析方法，基于在人类细胞DNA合成过程中掺入的核苷酸类似物的免疫检测。然而，这种技术的分辨率有限，只有几千个千基。因此，标准测定无法检测到小至几百个碱基的复制后单链DNA（ssDNA）间隙。在这里，我们描述了利用S1核酸酶的DNA纤维测定的修饰版本，S1核酸酶是一种特异性切割ssDNA的酶。在存在复制后ssDNA间隙的情况下，S1核酸酶将靶向并切割间隙，产生较短的束，可用作正在进行的分叉上ssDNA间隙的读数。这些复制后ssDNA间隙是在不连续复制受损DNA时形成的。它们可以通过与基因组复制分离 的机制进行 修复，该过程称为间隙填充或复制后修复。由于间隙填充机制涉及独立于S期的DNA合成，因此DNA纤维标记方案的改变也可用于监测间隙填充事件。总而言之，DNA纤维测定的这些修饰是了解复制后间隙如何在人类细胞基因组中形成和填充的强大策略。

Introduction

开创性工作提供了在细菌¹和人类细胞^2，3中用DNA损伤剂处理后复制后单链（ssDNA）间隙积累的证据。在复制受损的DNA模板期间，DNA合成机制可以通过采用特定的转座合成DNA聚合酶或通过模板切换机制来绕过病变。或者，重复体也可以简单地跳过病变，留下一个ssDNA间隙，以便以后修复。最近，一项研究清楚地表明，利用电子显微镜可视化复制中间体的特定结构，用基因毒性剂治疗会导致真核生物中的ssDNA间隙⁴。这些复制后间隙区域的形成最初被认为是DNA复制²的半不连续模式的简单结果。在这种情况下，滞后链上的病变可以阻断冈崎片段的伸长，但叉子进展自然被以下冈崎片段挽救，留下ssDNA间隙。然而，进一步的研究表明，在前导链上形成间隙也是可能的，如细菌⁵所示。在真核生物中，PRIMPOL是一种具有primase活性的独特DNA聚合酶，被证明能够通过其重注活性^6，7，⁸，⁹，^10，11在复制阻断病变下游重新开始DNA^合成。因此，PRIMPOL primase活性可以解释在用DNA损伤剂处理人细胞¹²时在前链中形成复制后ssDNA间隙。尽管如此，直到最近，这些间隙的检测以及间隙修复都需要间接或耗时的方法，例如电子显微镜⁴或基于质粒的测定¹³。使用ssDNA特异性S1核酸酶来检测人类细胞中的间隙是四十多年前早期研究的先驱，使用蔗糖梯度技术^2，3。最近，我们的小组应用这种核酸酶来检测使用其他方法（如DNA纤维和彗星测定¹⁴）复制DNA（复制后间隙）中的ssDNA。这些新方法为目前关于复制后差距的研究激增铺平了道路。在这里，我们描述了一种使用S1核酸酶通过DNA纤维测定来检测复制后ssDNA间隙的策略，并解释了DNA纤维方案中的差异标记方案如何允许研究这些间隙的修复。

DNA纤维测定是一种强大的技术，已被越来越多的实验室使用，并为复制叉动力学和复制应激反应机制提供了有价值的见解。简而言之，该技术基于在复制DNA中连续掺入核苷酸类似物（例如CldU -5-氯-2'-脱氧尿苷和IdU-5-碘-2'-脱氧尿苷）。收获后，裂解细胞，DNA分子在正涂层的载玻片上扩散。然后通过特异性抗体检测CldU和IdU，这些抗体可以在荧光显微镜中可视化为双色纤维。最后，测量IdU和CldU束的长度，以识别DNA损伤诱导引起的DNA复制动力学的任何改变。该技术可用于研究不同的现象，例如叉子失速，分叉减速，新生DNA降解以及起源放电^{频率的变化15，16}。

DNA纤维测定的一个局限性是其对几千碱基的分辨率。由于复制后ssDNA间隙可能在数百个碱基的范围内，因此不可能通过标准DNA纤维方案直接可视化这些间隙。ssDNA间隙在用基因毒性药物处理的人类细胞中复制DNA的存在以前已经间接涉及。例如，通过在S期外的细胞中募集ssDNA结合蛋白，复制蛋白A（RPA）来评估ssDNA的观察，或者通过碱性DNA解卷检测到的ssDNA的形成，以及DNA纤维测定^{12，17，18，19，20，21}没有长时间的分叉失速 归因于ssDNA间隙的积累。此外，复制后ssDNA间隙诱导ATR依赖性G2 / M相检查点并阻止用复制毒物处理的细胞^{18，19，20，21，22}。

S1核酸酶降解单链核酸，释放5'-磷酸基单核苷酸或寡核苷酸，与RNA相比，对ssDNA的亲和力高5倍。双链核酸（DNA:DNA、DNA:RNA 或 RNA:RNA）对 S1 核酸酶具有抗性，除非在极高浓度下使用。S1核酸酶还可以在由缺口，间隙，不匹配或环引起的单链区域切割双链DNA。因此，S1核酸酶是一种ssDNA特异性内切酶，能够切割ssDNA间隙，最终产生双链断裂^23，24。因此，将S1核酸酶消化步骤添加到DNA纤维方案中间接能够检测复制后ssDNA间隙。在存在间隙的情况下，在DNA扩散之前用S1核酸酶处理暴露的细胞核将产生较短的束，这是由于ssDNA的S1裂解固有地存在于间隙¹⁴中。因此，束缩短是使用这种方法的ssDNA间隙的读出。与标准DNA纤维方案相比，具有S1核酸酶的DNA纤维只需要两个额外的步骤:细胞核暴露（细胞通透化）和用S1核酸酶处理。重要的是要注意，适当的对照是强制性的，例如用遗传毒性剂处理但没有S1核酸酶的样品和用S1核酸酶处理的没有遗传毒性剂的样品。方案本身，包括类似物的掺入，S1处理和扩散，可以在一天内完成，不需要特殊的材料。它只需要胸苷类似物，纯化的S1核酸酶，适当的一抗和二抗以及荧光显微镜。总体而言，采用S1核酸酶的DNA纤维使用相对简单的方法检测正在进行的复制分叉上的ssDNA间隙。

复制应激反应机制产生的复制后ssDNA间隙可以通过不同的机制进行修复（或填充），包括转座DNA合成或模板切换，该过程称为间隙填充或复制后修复（PRR）²⁵。这些过程发生在前进的分叉后面，涉及复制无关的DNA合成^14，26，27。基于这些发现，可以执行与标准DNA纤维测定不同的标记方案，以直接可视化G2相^{14，16，26，28}中的间隙填充事件。具体而言，一个胸苷类似物可用于在遗传毒性治疗和复制后ssDNA间隙形成时标记复制叉，而另一个胸苷类似物可用于标记间隙填充事件。在该方案中，在基因毒性治疗1小时后立即或同时用第一胸苷类似物（例如IdU）标记细胞，以便在间隙形成时标记新生的DNA。在处理12-24小时之间的任何地方添加诺考达唑以阻止G2 / M中的细胞，防止以下S期。对于诺考达唑治疗的最后4小时，将第二个胸苷类似物（例如CldU）添加到要在间隙填充期间掺入的培养基中。重要的是，该测定只能用于检测G2中的间隙填充事件，因为来自CldU的间隙填充信号无法与由于CldU掺入S期复制DNA的信号而与信号区分开来。因此，为了最大限度地减少背景信号，损伤诱导后加入CldU的时间应与大多数细胞群进入G2相¹⁴的时间相吻合。因此，这个时间会根据细胞系和治疗条件而有所不同。建议在采用该测定之前优化细胞周期进展。这些胸苷类似物的共染色允许在基因毒性治疗期间合成的新生DNA（IdU束）上间隙填充（PRR）束（CldU贴片）的可视化，当ssDNA间隙产生时。

Protocol

由于该研究使用人类细胞，这项工作得到了圣保罗大学生物医学科学研究所伦理委员会（ICB-USP，批准号#48347515.3.00005467）的批准，用于人类样本的研究。

注:此处描述的协议在以前的出版物中使用，但略有修改^14，16，28。这里的重点是使用紫外线C（UVC）作为DNA损伤剂。然而，其它DNA损伤剂如顺铂和羟基脲也已成功采用²⁸种。该方案可以在一系列细胞系中进行，包括U2OS，HEK293T，人成纤维细胞和其他^14，28，29。在执行此协议之前，必须确定实验问题。使用S1核酸酶（以下称为S1纤维）的DNA纤维测定用于检测复制后ssDNA间隙的存在，而进行间隙填充（或PRR）测定以量化G2期的间隙填充事件。因此，如果分析复制后ssDNA间隙的存在，研究者应执行方案的第2部分（S1纤维实验设置）并直接进入方案的第4部分（通过铺展制备DNA纤维）。如果分析间隙填充事件，研究者应直接进入第3部分（间隙填充（PRR）实验设置）。

1. 试剂和设置

1. 胸苷类似物:将5-碘-2'-脱氧尿苷（IdU）和5-氯-2'-脱氧尿苷（CldU）重悬于1 N NH₄OH中至终浓度为100mM。通过无菌注射器过滤器（0.2μm），等分试样过滤类似物，并将其储存在-20°C。
2. 抗体:原代 - 抗BrdU大鼠（Biorad）和抗BrdU小鼠（BD）;次级 - 抗鼠Alexa Fluor 488和抗鼠Alexa Fluor 594。
3. 用于S1纤维的细胞通透性CSK100缓冲液:在蒸馏的H 2 O中加入100 mM NaCl，10 mM MOPS [pH 7]，3 mM MgCl₂ [pH_7.2]，300 mM蔗糖和0.5%Triton X-100。
4. S1 核酸酶缓冲液 [pH 4.6]:在 H₂O 中加入 30 mM 乙酸钠 [pH 4.6]、10 mM 乙酸锌、50 mM NaCl 和 5% 甘油。
   注意:S1核酸酶缓冲液的最终pH值必须为4.6，因为S1活性在pH值>4.9时下降50%。
5. 等分试样并将从米 曲 霉中纯化的S1核酸酶在制造商提供的S1核酸酶稀释缓冲液中预先稀释的S1核酸酶储存在-20°C。
6. 将DMSO中的诺考达唑重构至终浓度为2mM以进行间隙填充。测定。
7. 裂解缓冲液:在H_{2 O中}加入200 mM Tris-HCl [pH 7.5]，50 mM EDTA和0.5%SDS。
8. 制备磷酸盐缓冲盐水（PBS）。
9. 通过在PBS中添加0.1%吐温-20来制备PBS-T。
10. 在PBS中制备5%牛血清白蛋白（BSA）。
11. 在PBS中准备0.1%的BSA。
12. 通过在PBS-T中添加1%的BSA来制备PBS-T-BSA。
    注意:使用带有510 nm波长和42 nm带宽GFP（FITC，Alexa Fluor 488）发射滤光片和624 nm波长和40 nm带宽德克萨斯红（Alexa Fluor 594）发射滤光片的汞或氙气灯的落射荧光显微镜，或使用488 nm线（蓝色）激光检测绿色荧光（在510和560 nm之间检测到）和561 nm线（黄色）激光以检测红色荧光（在575和680 nm之间检测到）。浸入式物镜（40x、63x 或 100x）。

2. S1光纤实验设置（2天）

1. 第1天:为每个细胞系建立4个孔:±UVC和±S1核酸酶与70-90%汇合的细胞。
   注意:实验可以以小至12孔板的格式进行。在这种情况下，所有溶液均以0.5 mL /孔使用。
2. 第2天:在预热（37°C）细胞培养基中制备20μM的新鲜IdU和200μM的CldU。
3. 吸出培养基并立即加入20μM IdU培养基，并将细胞在37°C，5%CO₂ （细胞培养箱）下孵育20分钟。
4. 用预热（37°C）PBS快速洗涤细胞两次。
5. 用20 J / m² UVC照射细胞。使用未经处理的细胞作为对照。
6. 立即加入200μM CldU培养基，并将细胞在37°C，5%CO₂ （细胞培养箱）下孵育60分钟。
   注意:IdU和CldU标签可以互换，但第二个模拟物的浓度应比第一个模拟物高5-10倍。模拟孵育的时间可以适应所使用的遗传毒性剂，但是第二次类似物孵育的时间应足够长，以确保有足够的时间形成间隙^14，16。如果使用DNA损伤药物，请将药物与CldU^28，29，30一起加入。
7. 用预热（37°C）PBS洗涤细胞两次。
8. 用CSK100缓冲液在室温（RT）下透化细胞8-10分钟。
   注意:成功的透化可以在明场显微镜下检查，其中只有原子核是可观察的
9. 用PBS小心地洗涤细胞核（将0.5 mL倒入每个孔的侧面，只需几秒钟）。
10. 用S1缓冲液小心地洗涤细胞核（将0.5mL倒入每个孔的侧面，只需几秒钟）。
11. 用S1缓冲液与S1核酸酶（20 U / mL）或无（作为对照）在37°C（细胞培养箱）下孵育细胞核30分钟。
12. 吸出S1缓冲液并在PBS中加入0.1%BSA。
13. 刮取细胞核并将其转移到适当注释的1.5 mL管中。始终将管子放在冰上。
    注意:可以在明场显微镜下检查细胞核的成功分离。
14. 沉淀细胞核:在4°C下以〜4600× g 离心5分钟。
    注意:与标准DNA纤维测定不同，细胞核不能计数，因此请考虑接种细胞的初始数量。或者，可以使用未经透化的额外孔来估计使用血细胞计数器或细胞计数器的细胞计数。
15. 将沉淀以约1500个细胞/ μL的浓度在PBS中充分重悬，将试管放在冰上，并通过铺展（第4节）方案立即进行DNA纤维制备

3. 填隙（PRR）实验设置（3天）

1. 第1天:为每个细胞系建立2个孔:±UVC，细胞汇合度约为70%。
2. 第2天:在预热（37°C）细胞培养基中以20μM制备新鲜的IdU。
3. 用20 J / m² UVC照射细胞。
4. 立即加入20μM IdU培养基，并将细胞在37°C，5%CO 2（细胞培养箱）下孵育60分钟。
5. 用预热（37°C）PBS洗涤细胞两次。
6. 立即加入200ng / mL诺考达唑的培养基，并将细胞在37°C，5%CO₂ （细胞培养箱）下孵育12-24小时（此步骤的时间必须在实验之间保持一致）。
   注意:诺考达唑的浓度可能需要根据所使用的细胞系进行调整。如果使用遗传毒性药物，则将细胞与IdU±药物²⁸一起孵育。
7. 第3天:吸出培养基，加入培养基与20μM CldU +诺考达唑，并在37°C，5%CO₂ （细胞培养箱）下孵育诺考达唑处理的最后4小时。
8. 用预热（37°C）PBS洗涤细胞。
9. 加入胰蛋白酶并在37°C，5%CO 2（细胞培养箱）下孵育_1-2 分钟以分离细胞。
10. 加入相同体积的细胞培养基，并将细胞（培养基+胰蛋白酶）收集在适当注释的1.5mL试管中。始终将管子放在冰上。
11. 使用血细胞计数器或细胞计数器计数细胞。
12. 沉淀细胞:在4°C下以〜350× g 离心5分钟。
13. 除去上清液，以~1500个细胞/μL的速度将细胞重悬于PBS中，将细胞保持在冰上，并通过立即铺展方案开始DNA纤维制备（第3天或第4天）。

4.通过铺展制备DNA纤维（约1小时，12张载玻片）

1. 用碳铅笔注释显微镜载玻片，并将其平放在托盘上。
2. 点击管的底部以确保均质化。
3. 在相应载玻片的顶部加入2μL细胞。
   注:可以添加两滴，一滴在载玻片的顶部，另一滴在载玻片的中间。
4. 加入6μL裂解缓冲液，并通过上下移液约5次来裂解细胞（避免产生气泡）。
5. 用移液器吸头将液滴向载玻片底部稍微拉一点（以引导液滴扩散的路径）。
6. 在室温下孵育5分钟以裂解细胞核。
   注意:如果裂解液干燥过快或干燥不够，可以调整裂解缓冲液的体积和裂解时间。裂解缓冲液体积可在5-7μL之间变化，时间可在4-10分钟之间变化。
7. 将载玻片倾斜约20-40°，让液滴以恒定的低速扩散到载玻片的底部。
8. 让载玻片在黑暗中在室温下干燥（10-15分钟）。
9. 新鲜制备固色液:以3:1的比例混合甲醇:冰醋酸。
10. 将载玻片浸入含有固定溶液的罐中，并在室温下孵育5分钟以将DNA固定在载玻片上。
    注意:甲醇具有高毒性，应保存在化学罩下。丢弃在适当的容器中。
11. 在黑暗中在室温下干燥载玻片，并在4°C下储存，避免光照直至染色。

5. DNA纤维的免疫染色（约6小时）

1. 用PBS洗涤载玻片两次5分钟。
2. 用新鲜制备的2.5M盐酸盐在室温下使DNA变性40-60分钟。
   注意:要制备2.5 M HCl，请将酸倒入水中，切勿相反。这是一种放热反应，因此会略微变暖。
3. 用PBS洗涤载玻片三次，持续5分钟。
4. 用5%BSA（可在20°C下储存最多三次使用）的块，先前在37°C下在37°C下加热30-60分钟。
5. 通过轻轻敲击纸张从载玻片中取出多余的液体。
6. 向载玻片滴加30μL一抗（小鼠抗BrdU 1/20（用于IdU）和在PBS-T-BSA中稀释的大鼠抗BrdU 1/100（用于CldU））并在上面放置盖玻片。在黑暗潮湿的室中在室温下孵育1-1.5小时。
7. 将载玻片放入装有PBS的罐中1-2分钟，然后小心地取下盖玻片。
8. 用PBS-T在罐子中洗涤三次5分钟，然后将载玻片放入PBS中。
9. 轻轻拍打纸张，取出多余的液体。
10. 向载玻片滴加30μL二抗（在PBS-T-BSA中以1/75稀释的抗小鼠Alexa Fluor 594和抗鼠Alexa Fluor 488）滴加到载玻片中，并在上面放置盖玻片。在黑暗潮湿的室中在室温下孵育45-60分钟。
11. 将载玻片放入装有PBS的罐中1-2分钟，然后小心地取下盖玻片。
12. 用PBS-T在罐子中洗涤三次5分钟，然后将载玻片放入PBS中。
13. 轻轻拍打纸张，取出多余的液体。
14. 将20μL安装试剂滴加到载玻片中，并将盖玻片放在顶部。避免气泡。
15. 让载玻片在黑暗中在室温下干燥，然后在4°C（或-20°C以延长保存时间）下储存。

6. 图像采集和分析（每个样品约1小时）

注意:落射荧光显微镜可用于两种方案。然而，对于间隙填充（PRR）测定，强烈建议使用共聚焦显微镜来提高图像的分辨率。

1. 在玻片顶部附近放置一滴浸油（显微镜特异性），该载玻片裂解细胞，并通过搜索背景中的绿点（可以使用40x，63x和100x物镜）使用绿色通道找到焦点。
2. 找到纤维的主要浓度，并移动到边缘，以找到铺展良好的非重叠的单个光纤，仅使用一个通道来选择图片区域并避免潜在的偏差。
3. 每张幻灯片在绿色和红色通道处与整个幻灯片一起拍摄约15-20张照片，并将两个通道合并以获得双色DNA纤维。
   注意:如果使用共聚焦显微镜，请以高分辨率（1024 x 1024像素）拍摄照片，并对红色和绿色荧光使用接近1的针孔值。
4. 使用ImageJ（NIH提供的免费软件，https://imagej.nih.gov/ij/）进行IdU和CldU管道长度测量。
   1. 通过将图片拖动到 ImageJ 框中来打开图片。
   2. 使用显微镜软件生成的比例尺（经过适当校准）将长度转换为千分尺。通过在 ImageJ 框中从左到右选择^第 5 个图标来使用直线工具，以测量图片中提供的微米级比例尺，并获得以像素为单位的测量值。单击"分析>设置比例，然后将"以像素为单位的距离"替换为适当的数字，并将"长度单位"替换为μm。
   3. 在 ImageJ 框中，选择分割 线 工具，方法是从左到右左单击^{第 5 个} 图标，然后从上到下选择第二个选项。
   4. 通过左键单击绘制红色 （IdU） 或绿色 （CldU） 区域的确切路径，通过右键单击停止绘制。按下键盘上的 M 按钮以测量长度。
   5. 对于 S1 光纤，仅分析红绿色（双色光纤）¹⁶。通过跟踪每根光纤的红色和绿色区域测量值，测量来自不同图片的至少150根光纤的红色和绿色区域长度。
   6. 对于间隙填充测定，仅测量含有至少1个CldU（绿色）贴片但没有连续CldU染色的IdU（红色）束的长度。从不同的图片中评分至少10-15个IdU束，至少1个CldU贴片。
      注:其他软件可用于分析，例如蔡司LSM图像浏览器。
5. 对于 S1 光纤，将 IdU 区域长度、CldU 区域长度和比率（CldU/IdU 或反之亦然）绘制为具有中位数的散点图。
6. 以"每千基密度"为单位测量间隙填充事件，将给定长度的IdU（红色）束上的CldU（PRR，绿色）斑块总数除以千基的红色束总长度（考虑1μm = 2.59千基³¹）。然后将数据绘制为具有中位数的散点点图。
7. 在这两个实验中，使用Mann-Whitney（非参数检验）在两个样本之间进行统计分析，并使用Kruskal-Wallis在两个以上的样本之间进行统计分析，然后进行Dunn的多重比较检验。

Results

在S1纤维测定中，如果用基因毒性剂处理导致复制后ssDNA间隙，则与未处理的样品以及用遗传毒性剂处理但未提交S1裂解的样品相比，S1处理过的细胞核的DNA纤维的总长度在处理DNA损伤时将更短（图1）。

或者，如果与未处理的细胞相比，用S1核酸酶治疗不会显着影响DNA纤维的长度，则可能有不同的解释:（1）使用所使用的遗传毒性剂治疗时，和/或在研究的特定遗传背景中，不会形成复制后ssDNA间隙。事实上，我们之前已经证明，紫外线诱导的6-4光产物（6-4PP）而不是环丁烷嘧啶二聚体（CPD）导致在缺乏核苷酸切除修复的细胞（NER，XP-C细胞）中形成ssDNA间隙¹⁴。（2）ssDNA间隙被修复，无法再检测。（3）单独使用遗传毒性剂治疗诱导的缩短太明显，无法通过S1裂解检测到进一步的缩短。

值得注意的是，S1的缺乏效果也可能反映技术问题，例如S1活性受损的条件，包括S1缓冲液的pH值不合适或锌的量有限。

Discussion

标准DNA纤维测定方案的关键步骤在先前的出版物³²中进行了讨论。在这里，我们描述了标准DNA纤维测定的修饰版本，以研究复制后ssDNA间隙的存在以及通过间隙填充对其进行修复，最初在¹⁴中描述。在复制后ssDNA间隙存在的背景下，在S1 Fiber方案中使用S1核酸酶很可能是在暴露于遗传毒性剂至少1小时后，以允许间隙形成和随后检测的时间。然而，必须注意的是，在某些细胞系或遗传背景中，即使没有用遗传毒性剂^33，34进行额外处理，使用S1核酸酶也可能产生较短的束。因此，至关重要的是要包括所有对照，以确保正确得出结论，使用基因毒性药物治疗是否会导致间隙积累。此外，重要的是通过在ssDNA间隙不再形成或修复的条件下重复测定来进一步验证S1纤维结果。

关于间隙填充（PRR）测定，重要的是优化不影响DNA纤维总长度的UVC剂量/药物浓度，因为结果是按每千碱基密度计算的。如果使用诱导尿路...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
乙酸，冰川	合成	64-19-7	或者，BSA - Biosera - REF PM-T1725/100
氢氧化铵	合成	1336-21-6	或类似
抗体抗小鼠 IgG1 Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11005	-
抗体 抗大鼠 Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21470
-抗体小鼠抗 BrdU	BectonDisckson	347580	-
抗体大鼠抗 BrdU	Abcam	Ab6326	-
生物安全罩	Pachane	PA 410	使用实验室中的罩
BSA（牛血清白蛋白）	Sigma-Aldrich	A3294	或类似
细胞刮刀	Thermo Scientific	179693	或类似
物 CldU	Millipore-Sigma	C6891-Cloridric
acid	Synth	7647-01-0	或类似
共聚焦蔡司 LSM 系列（7、8 或 9）	蔡司		或类似
盖玻片（或盖玻片）	Thermo Scientific	152460	或者，Olen - Kasvi 盖玻片 （24 x 60 mm） - K5-2460
DMEM - 高葡萄糖	LGC/Gibco	BR30211-05/12100046	使用所用细胞系专用的培养基。
EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐二水合物）	Sigma-Aldrich	E5314	或类似
落射荧光显微镜 Axiovert 200	Zeiss	-	或类似
FBS（胎牛血清）	Gibco	12657-029	或类似物
Forma 系列 II 水套式 CO2 培养箱	Thermo Scientific 3110	13-998-074	使用细胞培养箱实验室
载玻片罐	Sigma-Aldrich	S5516	或类似
甘油	Sigma-Aldrich	56-81-5	或类似
Idu	Millipore-Sigma	I7125	-
氯化镁	合成	7791-18-6	或类似
物 甲醇	Merck	67-56-1	或类似
显微镜载玻片	Denville	M1021	或者，Olen - Kasvi显微镜载玻片 - K5-7105 <强>或精密玻璃线 - 7105-1
MOPS （ÁCido 3-Morfolinopropano 1-sulfônico）	Synth	1132-61-2	或类似
诺考达唑	Sigma-Aldrich	31430-18-9-PBS
（磷酸盐缓冲盐水）	Life Thechnologies	3002	或类似
物 青霉素-链霉素	Gibco	15140122	或类似
ProLong Gold 抗淬灭封片剂	Invitrogen	P36930	任何抗淬灭剂溶液免疫荧光
可从 米曲霉	Invitrogen	18001-016	S1 核酸酶 （1/100 - 1/200） 在制造商提供的 S1 核酸酶稀释缓冲液中预稀释，分装并储存在 -20 °C;C
SDS（十二烷基硫酸钠）	BioRad	161-0302	或类似
乙酸钠三水合	Sigma-Aldrich	6131-90-4	或类似
氯化钠	合成器	7647-14-5	或类似
蔗糖	Sigma-Aldrich	57-50-1	或类似的
Tris Base	West Lab Research	BP152-1	或类似的
Triton X-100	Synth	9002-93-1	或类似
的胰蛋白酶	Gibco	25200072	或类似的
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	或类似
的 UVC 灯	非特异性	-	必要：发射长度为 254 nm
VLX-3W 紫外辐射计	Vilber Loumart	-	或类似
醋酸锌	Sigma-Aldrich	557-34-6	或类似产品