利用DNA纤维实验检测人细胞中复制后缺口的积累与修复

摘要

本文介绍了DNA纤维实验的两种改进方法，用于在诱导损伤后研究复制DNA中的单链DNA缺口。S1纤维实验利用特异性识别单链DNA的S1核酸内切酶来检测复制后缺口，而缺口填补实验则可用于可视化并定量分析缺口修复过程。

摘要

DNA纤维实验是一种简单且可靠的分析人细胞中DNA合成期间掺入的核苷酸类似物的方法，用于研究复制叉动态。然而，该技术的分辨率有限，仅为几千千碱基。因此，标准实验无法检测到低至数百个碱基的微小复制后单链DNA（ssDNA）缺口。本文介绍一种改良的DNA纤维实验方法，该方法利用S1核酸酶——一种特异性切割单链DNA的酶。当存在复制后ssDNA缺口时，S1核酸酶会靶向并切割这些缺口，产生较短的DNA片段，从而作为正在进行复制的复制叉上ssDNA缺口的检测指标。这些复制后ssDNA缺口是在受损DNA发生不连续复制时形成的，它们可以被修复 通过 与基因组复制无关的机制，这一过程被称为间隙填补或复制后修复。由于间隙填补机制涉及不依赖于S期的DNA合成，因此也可通过改变DNA纤维标记方案来监测间隙填补事件。总体而言，这些对DNA纤维实验的改进方法是研究人类细胞基因组中复制后间隙如何形成与填补的有力策略。

引言

早期的研究已提供证据表明，在细菌¹和人类细胞^2,3中，经DNA损伤剂处理后会出现复制后单链DNA（ssDNA）缺口的积累。在受损DNA模板的复制过程中，DNA合成机制可通过特定的跨损伤合成DNA聚合酶或模板转换机制绕过损伤位点。此外，复制体也可能直接跳过损伤位点，留下一个ssDNA缺口，待后续修复。最近的一项研究利用电子显微镜观察复制中间体的特定结构，明确证实了在真核生物中，基因毒性试剂处理会导致ssDNA缺口的形成⁴。最初认为，这些复制后缺口区域的形成仅仅是DNA半不连续复制模式的简单结果²。在此情况下，滞后链上的损伤可阻断冈崎片段的延伸，但复制叉的前进可通过下一个冈崎片段自然恢复，从而留下一个ssDNA缺口。然而，后续研究进一步表明，前导链上同样可能形成缺口，这一点最早在细菌中被发现⁵。在真核生物中，PRIMPOL是一种具有引物酶活性的独特DNA聚合酶，已被证明可通过其重新引物合成活性，在复制阻断性损伤的下游重启DNA合成^6,7,8

方案

由于本研究使用人类细胞，相关工作已获得圣保罗大学生物医学科学研究所（ICB-USP，批准号 #48347515.3.00005467）伦理委员会的批准，允许开展涉及人类样本的研究。

注意：此处描述的实验方案在先前的出版物中已使用过，仅做了少量修改^14,16,28。本文重点介绍以紫外光C（UVC）作为DNA损伤剂的应用，但其他DNA损伤剂（如顺铂和羟基脲）也已成功使用²⁸。该实验方案适用于多种细胞系，包括U2OS、HEK293T、人成纤维细胞及其他细胞系^14,28,29。在开展本实验前，必须明确研究的科学问题。使用S1核酸酶的DNA纤维实验（以下简称S1 Fiber）用于检测复制后单链DNA（ssDNA）缺口的存在，而缺口填补（或称PRR）实验则用于定量G2期的缺口填补事件。因此，若研究目标为分析复制后ssDNA缺口的存在情况，研究者应执行第2节（S1 Fiber实验设置），并直接进入第4节（铺展法DNA纤维制备）；若研究目标为分析缺口填补事件，则应直接进入第3....

结果

在 S1 纤维实验中，如果使用遗传毒性试剂处理导致复制后单链 DNA 缺口的产生，则与未经处理的样本以及经遗传毒性试剂处理但未进行 S1 切割的样本相比，经 DNA 损伤处理后 S1 处理的细胞核所获得的 DNA 纤维总长度会更短（图 1）。

或者，如果使用 S1 核酸酶处理对 DNA 纤维长度的影响与未处理细胞相比无明显差异，则可能存在以下几种解释：（1）在所使用的基因毒性试剂处理下，以及在特定的遗传背景下，未发生复制后单链 DNA 间隙（ssDNA gaps）的形成。事实上，我们此前已证明，在核苷酸切除修复缺陷（NER，XP-C 细胞）的细胞中，紫外线诱导的 6-4 光产物（6-4PP）会导致 ssDNA 间隙的形成，而环丁烷嘧啶二聚体（CPD）则不会¹⁴。（2）ssDNA 间隙已被修复，因而无法再被检测到。（3）由基因毒性试剂单独处理引起的 DNA 纤维缩短程度过于显著，从而掩盖了 S1 切割所导致的进一步缩短，使其无法被检测。

讨论

标准DNA纤维实验方案的关键步骤已在先前的出版物中讨论过³²。本文中，我们描述了标准DNA纤维实验的改进版本，用于研究复制后单链DNA（ssDNA）缺口的存在及其通过填补修复的过程，该方法最初在文献¹⁴中被描述。在检测复制后ssDNA缺口存在的情况下，使用S1纤维法时加入S1核酸酶，通常在细胞暴露于基因毒性试剂至少1小时后进行较为合适，以确保有足够时间形成并检测到缺口。然而，必须注意的是，在某些细胞系或遗传背景下，即使未额外施加基因毒性处理，使用S1核酸酶也可能导致纤维片段变短^33,34。因此，必须设置完整的对照组，以准确判断基因毒性试剂处理是否确实导致了缺口的累积。此外，还需在ssDNA缺口不再形成或已被修复的条件下重复实验，以进一步验证S1纤维法的结果。

关于填补缺口（PRR）实验，优化UVC剂量或药物浓度至关重要，需确保其不影响DNA纤维的总体长度，因为结果是以每千.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
冰醋酸	合成	64-19-7	或者，BSA - Biosera - 货号 PM-T1725/100
氨水	合成	1336-21-6	或类似情况
抗体 anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11005	-
抗体 anti-rat Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21470	-
抗体 小鼠抗BrdU	Becton Dickinson	347580	-
抗体 大鼠抗BrdU	Abcam	Ab6326	-
生物安全柜	Pachane	PA 410	使用实验室中配备的通风橱
BSA（牛血清白蛋白）	Sigma-Aldrich	A3294	或类似情况
细胞刮刀	赛默飞世尔科技	179693	或类似情况
CldU	Millipore-Sigma	C6891	-
盐酸	合成	7647-01-0	或类似情况
蔡司共聚焦 LSM 系列（7、8 或 9）	Zeiss	-	或类似情况
盖玻片	赛默飞世尔科技	152460	或者，Olen - Kasvi 盖玻片（24 × 60 mm）- K5-2460
DMEM - 高糖	LGC/Gibco	BR30211-05/12100046	使用适用于所用细胞系的特定培养基。
EDTA（乙二胺四乙酸二钠盐二水合物）	Sigma-Aldrich	E5314	或类似情况
倒置荧光显微镜 Axiovert 200	蔡司	-	或类似情况
FBS（胎牛血清）	Gibco	12657-029	或类似情况
Forma Series II 水套式 CO2 培养箱	Thermo Scientific 3110	13-998-074	使用实验室中的细胞培养箱
玻璃载玻片缸	Sigma-Aldrich	S5516	或类似情况
甘油	Sigma-Aldrich	56-81-5	或类似情况
Idu	Millipore-Sigma	I7125	-
氯化镁	合成	7791-18-6	或类似情况
甲醇	默克	67-56-1	或类似情况
显微镜载玻片	丹维尔	M1021	或者，Olen - Kasvi 显微镜载玻片 - K5-7105 <强>或 精密玻璃管 - 7105-1
MOPS（3-吗啉代丙磺酸）Ácido 3-吗啉代丙烷 1-磺酸ônico	合成	1132-61-2	或类似情况
诺考达唑	Sigma-Aldrich	31430-18-9	-
PBS（磷酸盐缓冲液）	Life Technologies	3002	或类似情况
青霉素-链霉素	Gibco	15140122	或类似情况
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Invitrogen	P36930	任何用于免疫荧光的抗荧光淬灭封片剂均可使用
来自的S1核酸酶纯化自 米曲霉	Invitrogen	18001-016	将S1核酸酶用生产商提供的S1核酸酶稀释缓冲液预稀释（1/100 - 1/200），分装后于-20℃保存 °C
SDS（十二烷基硫酸钠）	伯乐（BioRad）	161-0302	或类似情况
三水合醋酸钠	Sigma-Aldrich	6131-90-4	或类似情况
氯化钠	合成	7647-14-5	或类似情况
蔗糖	Sigma-Aldrich	57-50-1	或类似情况
Tris碱	West 实验室研究	BP152-1	或类似情况
Triton X-100	合成	9002-93-1	或类似情况
胰蛋白酶	Gibco	25200072	或类似情况
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379	或类似情况
UVC 灯	非特异性	-	必需：254 nm 发射波长
VLX-3W 紫外辐射计	Vilber Loumart	-	或类似情况
乙酸锌	Sigma-Aldrich	557-34-6	或类似情况