小鼠疼痛行为的机械性避冲突检测法

摘要

机械冲突回避实验被用作评估小鼠疼痛敏感性的一种非反射性指标，可用于更好地理解多种小鼠疼痛模型中的情感-动机反应。

摘要

疼痛包含感觉（伤害性）和情感（不愉快）两个维度。在临床前模型中，传统上使用反射性测试来评估疼痛，这些测试能够推断疼痛的伤害性成分，但对疼痛的情感或动机成分提供的信息较少。因此，开发能够捕捉这些疼痛成分的测试具有重要的转化意义。研究人员需要采用非反射性行为检测方法，在相应水平上研究疼痛感知。机械冲突回避（MCA）是一种成熟的自主性非反射行为检测方法，用于在三室实验范式中研究对有害机械刺激的动机反应。通过观察小鼠在面临有害刺激冲突时位置偏好的变化，可以推断强光与足部触觉刺激之间哪种更令人不愉快。本方案概述了MCA检测的一种改进版本，疼痛研究人员可将其用于理解多种小鼠疼痛模型中的情感-动机反应。尽管此处未具体描述，我们的MCA示例数据使用了足底注射完全弗氏佐剂（CFA）、部分神经损伤（SNI）以及骨折/固定模型作为疼痛模型，以展示MCA操作流程。

引言

疼痛是一种包含感觉和情感成分的复杂体验。疼痛感知阈值降低以及对热和/或机械刺激的过敏反应是这种体验的关键特征，刺激诱发的疼痛行为测试可捕捉这些特征（例如 Hargreaves 热敏感性测试和 von Frey 机械敏感性测试）^1,2。尽管这些测试能够提供可靠且可重复的结果，但其局限性在于依赖于对有害刺激的反射性回撤反应。这使得人们开始质疑当前疼痛研究过度依赖此类测试的合理性。为此，疼痛研究领域近年来一直在探索可用于啮齿类动物疼痛模型的替代性或补充性行为学测试方法，以更好地捕捉疼痛的情感和/或动机成分。这些非诱发性、自主性或非反射性指标（例如转轮跑动、挖掘行为、条件性位置偏好^3,4,5）正被逐步引入，旨在提高临床前疼痛研究结果的可转化性。

机械性冲突回避（MCA）实验最初由Harte等人于2016年描述⁶，主要应用于大鼠^7,8，是对早期方法——位置逃避-回避范式的一种改进。在该方法中，通过在原本受动物偏好的暗室中施....

方案

所有涉及小鼠使用及相关操作的实验均经MD Anderson癌症中心和斯坦福大学的机构动物护理和使用委员会批准，严格遵守美国国立卫生研究院的 实验动物护理和使用指南。

1. MCA 构建

1. 使用不透明白色亚克力板（厚度3 mm）制作腔室1，尺寸为125 mm × 125 mm × 125 mm（宽×深×高），用于侧壁、底面和顶面；前壁使用透明的3 mm厚亚克力板。提前使用专用亚克力胶水将各面牢固粘合。
   警告：亚克力胶水属于危险品（易燃，蒸气有害，吞咽可能有害，可能刺激皮肤或眼睛）。此类胶水应严格按照制造商说明使用（即在通风良好的环境中佩戴适当的个人防护装备）。
2. 将腔室1的盖子通过铰链连接，以便于放入和取出小鼠。在盖子内表面粘贴自粘式发光二极管（LED）灯带，提供约4800 lux的照明。
3. 通过滑动不透明亚克力板到位或移出，将腔室1与MCA其余部分隔离开。
4. 将MCA测试腔室（腔室2）制作成一个长270 mm、无照明的腔室，所有侧壁均采用半透明深红色亚克力板（厚度3 mm），顶部配有铰链盖。在腔室2的底面设置一个13 × 31阵列的2 mm孔，使一系列尖端直径为0.5 mm的钝头探针（例如钝化地图钉）可从中突出。
   注：可使用120目砂纸块或类似工具将地图钉打磨成钝头。使用前先用温水加洗涤剂清洗，并用杀孢子消毒剂进....

结果

MCA 检测已成功应用于多种机制不同的小鼠疼痛模型。图2展示了以穿过2号腔室中点作为主要观察指标的结果（图2A）。在神经病理性疼痛的备用神经损伤（SNI）模型中，使用5 mm探针高度时，以中点为指标获得的数据与以逃逸至3号腔室为指标的数据非常相似，分别为约40 s和约45 s¹³。

在CFA诱导的炎性疼痛模型中，对照组小鼠后肢足底注射生理盐水后，其逃避潜伏期与基线相比无变化。单侧后肢足底注射CFA的小鼠在注射后第4天表现出逃避潜伏期显著延长，但仅在探针高度升高至5 mm时观察到该现象。关键的是，在测试开始前90分钟腹腔注射NSAID药物卡洛芬（carprofen，10 mg/kg）的小鼠中，5 mm高度下的逃避潜伏期延长现象并未出现（图2B）。

创伤性神经病理性疼痛的 spared nerve inju.......

讨论

与所有行为学实验一样，在整个实验过程中，对动物进行正确的操作、随机分组以及对处理方式实施盲法至关重要。鉴于复杂行为和决策受到多种因素的影响，必须尽可能一致地进行动物操作、适应性训练和测试，同时尽量减少动物的应激反应。此外，还应注意保持小鼠放入1号箱的时间、LED灯开启时间以及移除隔板时间的一致性，因为这些环节的差异可能会影响后续行为表现。

需要注意的是，图1A 中所示的不同结果指标之间存在相互关联。例如，小鼠进入2号腔室后通常会穿过该腔室的中点，并几乎总是最终逃逸至3号腔室。这意味着结果指标I、II和IV彼此相关。结果指标III和V分别测量在2号腔室的总停留时间以及在所有3个腔室中停留时间的比例，因此这些指标也密切相关。然而，理论上，无论小鼠穿过中点或逃入3号腔室的潜伏期较短、较长，或甚至未发生上述行为，其在2号腔室仍可能累积较长的停留时间。

已有多种该方法的变体或改良方案被报道。除了此处列出的不同结果测量指标（图1

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
32.8 英尺 3000K-6000K 可调白光 LED 灯带，可调光超亮 LED 灯条，带 600 颗 SMD 2835 LED	麻风病	SKU: 410087-DWW-US	用于照明室1。https://www.lepro.com/32ft-dimmable-tunable-white-led-strip-lights.html
3D打印“刺状床”和“腔室2底板”	Shapeways	N/A	可选，可用于机械探针，作为钝头地图图钉的替代品。
70% 乙醇	各种	N/A	在小鼠之间清洁大脑中动脉
丙烯酸铰链 2	TAP Plastics	N/A	用于将腔室盖固定到后壁。https://www.tapplastics.com/product/plastics/handles_hinges_latches/acryl_hinge_2/122
Chemcast 透明丙烯酸板	TAP Plastics	N/A	3 mm 厚，用于腔室 1 的前壁。https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_cast_clear/510
Chemcast 透明彩色丙烯酸树脂，透明深红色 - 50%	TAP Plastics	N/A	3 毫米厚，50% 透光率，用于第 2 和第 3 腔室的壁和盖板。https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_transparent_colors/519
Chemcast 透明型 && 不透明彩色浇铸亚克力，标识不透明白色 - 0.1%	TAP Plastics	N/A	3毫米厚。用于腔室1的侧壁和盖板。https://www.tapplastics.com/product/plastics/cut_to_size_plastic/acrylic_sheets_color/341
消毒剂（例如 Quatricide）	Pharmacal Research Laboratories, Inc.	65020F	在测试结束后对MCA进行消毒。
白板笔和白板	各种	N/A	在视频片段开头添加实验信息。
地图标记	各种	N/A	可选，适用于机械探针。使用前用砂纸磨钝尖锐部分。可替代3D打印部件。
纸巾	各种	N/A	清洁/消毒MCA。
SCIGRIP Weld-On #3 丙烯酸粘合剂	TAP Plastics	N/A	用于将亚克力板组装成腔室并固定铰链。https://www.tapplastics.com/product/repair_products/plastic_adhesives/weld_on_3_cement/131
秒表	各种	N/A	实时或从录制的视频中记录逃避潜伏期/停留时间。
计时器	各种	N/A	为确保LED开启，障碍物移除与测试完成的时间需保持一致。
摄像机	各种	HDRCX405 Handycam 摄录一体机	在MCA装置中记录小鼠行为。可使用任何能够达到1080p分辨率的消费级视频摄像机替代。
三脚架	法迈尔	N/A	任何能够在实验台高度固定相机以录制MCA影像的三脚架均可使用。