本文的总体目标是描述如何对鸡胚进行in ovo细胞内注射外源物质。该方法在研究鸡胚发育生物学方面非常有用。
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本文内容
摘要
摘要
作为一种经典的胚胎生物学模型系统，鸡胚已被广泛用于研究胚胎发育与分化过程。将外源物质导入鸡胚在研究基因功能、转基因育种以及嵌合体制备等方面具有显著优势。本文展示了 在卵内 通过背主动脉和头部进行血管内注射，可将质粒载体或经修饰的原始生殖细胞（PGCs）等外源物质导入早期发育阶段的供体鸡胚。结果表明，通过背主动脉和头部的血管内注射可使注入物质经由血液循环系统扩散至整个胚胎。在本方案中，通过观察胚胎中的荧光信号，评估了外源质粒和慢病毒载体的导入效率，以及注入的外源PGCs在受体性腺中的定植情况。本文详细描述了该方法的操作步骤，为研究基因功能、胚胎与发育生物学以及性腺嵌合鸡的制备提供了优良的技术途径。综上所述，本文将使研究人员能够顺利开展 在卵内 外源性物质对鸡胚的血管内注射具有高度成功性和可重复性。
引言
鸡胚数百年来被广泛应用于发育学、免疫学、病理学及其他生物学研究领域1,2,3与其他动物模型相比，它们在毒理学和细胞生物学研究中具有诸多内在优势4鸡胚易于获取且可进行操作 体外 并且可在任何发育阶段进行直接观察，这提供了一个便捷的胚胎研究模型系统。
通常，目前鸡胚递送方法（如电转染和卵黄下腔注射）存在一些局限性，例如需要专用设备和特定程序，且由于卵黄和蛋清的存在而导致效率低下5,6,7在此，我们展示了一种简单高效的鸡胚外源物质递送操作方法。该方法可作为发育生物学研究中的有力工具。注射的物质可扩散至整个胚胎 通过 血液循环。在鸡胚早期发育过程中，原始生殖细胞（PGCs）可通过血液迁移，定植于生殖嵴，并进一步发育为配子，从而为外源物质的递送提供了一条有价值的潜在途径8目前，该方法已广泛应用于基因功能、胚胎与发育生物学以及嵌合体和转基因鸡制备的研究中....
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方案
所有涉及动物护理和使用的操作均符合美国国立卫生研究院指南（NIH出版物第85-23号，1996年修订版），鸡胚实验方案已获中国扬州大学实验动物管理与实验动物伦理委员会批准（编号：201803124）。
1. 受精卵的收集与制备
注意：与哺乳动物不同，鸡的单侧卵巢中含有数百万个卵泡，但其中仅有少数卵泡发育成熟到足以排卵。每个卵泡包含一个卵母细胞或生殖细胞。一旦卵泡成熟并释放出卵黄，便会进入输卵管的漏斗部。当卵泡进入输卵管的腹腔口时，精子在母鸡体内与卵子结合，母鸡体内的钙质开始形成包裹受精卵的壳，从而在体内形成软壳蛋。钙质蛋壳逐渐增厚，直至鸡蛋最终产出。
- 从当地供应商或机构收集受精卵，可在16°C下保存1周。
注意：较高的储存温度有助于胚胎发育，而较低的温度会降低胚胎活力。若储存时间过长，胚胎将无法正常发育。 - 将鸡蛋转移至孵化箱前，用75%乙醇轻轻缓慢擦拭蛋壳。
- 将鸡蛋水平放置于孵化箱内的蛋架上，孵化条件为37.8 °C、60%湿度。孵化60小时后（HH 17期），胚胎将发育出可见的血管，心脏开始跳动15。
注意：孵化2天后，会出现微小的原始斑点，即心脏的早期阶段，该过程称为“樱桃珠”（cherrybeading）。约2.5天时，心脏及其他....
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结果
本文展示了鸡胚的 in ovo 血管内注射技术。图1 展示了血管内注射的示意图；在本研究中，我们使用了多种外源性溶液进行注射测试与验证。
为了更清晰地观察注射的物质，将0.4%的台盼蓝作为示踪剂注入胚胎。观察到示踪剂（蓝色）扩散至整个胚胎。 通过 通过背主动脉或头部注射实现血液循环（图2）。在两个不同位点注射的材料能够扩散至整个胚胎，表明其通过血液循环扩散。蓝色的可视化证实了注射成功。
将 pEGFP-N1 载体用 PEI 包裹，使其浓度达到 1 µg/µL；而慢病毒载体 pLVX-EGFP 则用 PEI 包裹后，经滴定稀释，使病毒浓度达到 5 x 106 Tu/µL。将包裹后的 pEGFP-N1 或 pLVX-EGFP 注射至 2.5 天胚胎（HH 14-15 期）中。在 4.5 天（HH 24 期）时，通过体视荧光显微镜观察胚胎。观察到胚胎中出现绿.......
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讨论
鸡胚 in ovo 血管内注射方法已优化，可用于将外源性物质（载体、病毒或原始生殖细胞）导入胚胎。基于该方法，我们构建了稳定基因过表达或干扰的鸡胚模型（SpinZ、JUN、UBE2I 等）17,18,19。这些成熟的模型证实了该技术的可行性。此外，我们不仅将分离的原始生殖细胞转移至受体胚胎的生殖腺，还成功获得了移植诱导型原始生殖细胞至胚胎生殖腺后发育而成的可存活后代，表明该方法在未来具有广阔的应用前景20。
该方法的关键步骤是注射。外源物质必须直接注入血管内，不能过深或过浅。因此，该操作需要具备鸡胚操作经验以及较高的注射技术，但通过练习可较容易地掌握。与气室注射相比，该方法更容易实现较高的注射效率和准确性。除了成本较高和步骤较复杂等局限性外，当制作较大的窗口时，不宜采用电转染技术，因其可能导致胚胎存活率降低。
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由国家自然科学基金（31972547）资助。我们感谢美国华盛顿州立大学王静的编辑工作以及Malik Donlic的配音工作。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 荧光宏观-显微镜 | OLYMPUS | MVX10 | |
| 玻璃毛细管 | Narishige | G1 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 12566014 | 脂质体 |
| pEGFP-N1 载体 | Clontech | #6085-1 | |
| PKH26 红色荧光细胞连接试剂盒 | Sigma | PKH26GL | |
| pLVX-EGFP 慢病毒载体 | Addgene | 128652 | |
| 气动显微注射仪 | Narishige | IM-11-2 | |
| 拉制仪 | Narishige | PC-100 | |
| 台盼蓝染色液 | Gibco | 15250061 |
参考文献
- Bednarczyk, M., Dunislawska, A., Stadnicka, K., Grochowska, E. Chicken embryo as a model in epigenetic research. Poultry Science. 100 (7), 101164(2021).
- Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. The chick embryo as a model system for analyzing mechanisms of development. Developmental Biology Protocols. , Humana Press. New York, NY. 25-29 (....
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