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方法文章

在卵内 鸡胚血管内注射

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DOI：

10.3791/63458

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2022年6月3日

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1Joint International Research Laboratory of Agriculture and Agri-Product Safety of Ministry of Education of China, Yangzhou University, 2Key Laboratory of Animal Breeding Reproduction and Molecular Design for Jiangsu Province, College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, 3Animal & Avian Sciences, University of Maryland, College Park, 4College of Biotechnology, Jiangsu University of Science and Technology

本文内容

摘要

本文的总体目标是描述如何对鸡胚进行in ovo细胞内注射外源物质。该方法在研究鸡胚发育生物学方面非常有用。

摘要

作为一种经典的胚胎生物学模型系统，鸡胚已被广泛用于研究胚胎发育与分化过程。将外源物质导入鸡胚在研究基因功能、转基因育种以及嵌合体制备等方面具有显著优势。本文展示了 在卵内 通过背主动脉和头部进行血管内注射，可将质粒载体或经修饰的原始生殖细胞（PGCs）等外源物质导入早期发育阶段的供体鸡胚。结果表明，通过背主动脉和头部的血管内注射可使注入物质经由血液循环系统扩散至整个胚胎。在本方案中，通过观察胚胎中的荧光信号，评估了外源质粒和慢病毒载体的导入效率，以及注入的外源PGCs在受体性腺中的定植情况。本文详细描述了该方法的操作步骤，为研究基因功能、胚胎与发育生物学以及性腺嵌合鸡的制备提供了优良的技术途径。综上所述，本文将使研究人员能够顺利开展 在卵内 外源性物质对鸡胚的血管内注射具有高度成功性和可重复性。

引言

鸡胚数百年来被广泛应用于发育学、免疫学、病理学及其他生物学研究领域1,2,3与其他动物模型相比，它们在毒理学和细胞生物学研究中具有诸多内在优势4鸡胚易于获取且可进行操作 体外 并且可在任何发育阶段进行直接观察，这提供了一个便捷的胚胎研究模型系统。

通常，目前鸡胚递送方法（如电转染和卵黄下腔注射）存在一些局限性，例如需要专用设备和特定程序，且由于卵黄和蛋清的存在而导致效率低下5,6,7在此，我们展示了一种简单高效的鸡胚外源物质递送操作方法。该方法可作为发育生物学研究中的有力工具。注射的物质可扩散至整个胚胎 通过 血液循环。在鸡胚早期发育过程中，原始生殖细胞（PGCs）可通过血液迁移，定植于生殖嵴，并进一步发育为配子，从而为外源物质的递送提供了一条有价值的潜在途径8目前，该方法已广泛应用于基因功能、胚胎与发育生物学以及嵌合体和转基因鸡制备的研究中9,10,11.

鸡胚的 in ovo 血管内注射是一种成熟且常用的方法12,13,14。本文详细描述了该实验方案，包括注射材料、注射位点、剂量以及典型实验结果。

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方案

所有涉及动物护理和使用的操作均符合美国国立卫生研究院指南（NIH出版物第85-23号，1996年修订版），鸡胚实验方案已获中国扬州大学实验动物管理与实验动物伦理委员会批准（编号：201803124）。

1. 受精卵的收集与制备

注意：与哺乳动物不同，鸡的单侧卵巢中含有数百万个卵泡，但其中仅有少数卵泡发育成熟到足以排卵。每个卵泡包含一个卵母细胞或生殖细胞。一旦卵泡成熟并释放出卵黄，便会进入输卵管的漏斗部。当卵泡进入输卵管的腹腔口时，精子在母鸡体内与卵子结合，母鸡体内的钙质开始形成包裹受精卵的壳，从而在体内形成软壳蛋。钙质蛋壳逐渐增厚，直至鸡蛋最终产出。

  1. 从当地供应商或机构收集受精卵，可在16°C下保存1周。
    注意：较高的储存温度有助于胚胎发育，而较低的温度会降低胚胎活力。若储存时间过长，胚胎将无法正常发育。
  2. 将鸡蛋转移至孵化箱前，用75%乙醇轻轻缓慢擦拭蛋壳。
  3. 将鸡蛋水平放置于孵化箱内的蛋架上，孵化条件为37.8 °C、60%湿度。孵化60小时后（HH 17期），胚胎将发育出可见的血管，心脏开始跳动15。
    ​注意：孵化2天后，会出现微小的原始斑点，即心脏的早期阶段，该过程称为“樱桃珠”（cherrybeading）。约2.5天时，心脏及其他体节形成，并可见血管。

2. 注射前准备

  1. 准备将用作针头的玻璃毛细管。在注射前，使用拉针仪将长度为90 mm、外径为1 mm、内径为0.6 mm的玻璃毛细管拉制成针。用镊子折断针尖（玻璃毛细管通常呈45°角），并在紫外线下灭菌2小时。
  2. 准备外源性材料，如质粒、包装好的慢病毒和原始生殖细胞（PGCs）。
    1. 将质粒pEGFP-N1（一种表达增强型绿色荧光蛋白的质粒，1 µg/µL）与脂质体按1:3（质量/体积）的比例轻轻混合。加入水，使DNA终浓度为10 ng/µL。将DNA混合物在37 °C下静置20分钟后再进行注射。
    2. 注射前将病毒置于冰上解冻。用于注射的慢病毒滴度应高于5 × 106 Tu/mL。
    3. 将亲本或经修饰的性腺原始生殖细胞（PGCs，E4.5，HH 24期）稀释至2,000–5,000 个细胞/µL。
      ​注意：此处我们以台盼蓝为例展示注射操作过程。

3. 开窗

  1. 在暴露胚胎之前，使用棉球蘸取75%酒精轻轻擦拭蛋壳表面，对蛋壳进行消毒，确保彻底消毒鸡蛋的钝端。
  2. 消毒后，用镊子轻轻敲击蛋的钝端，在蛋壳表面开一个约0.5 cm × 0.5 cm的小窗口，以暴露胚胎。去除胚胎膜后，将鸡蛋置于解剖显微镜下的蛋托中。

4. 注射

  1. 在显微镜下寻找血管，调节解剖显微镜的焦距以定位胚胎，然后找到准备注射的血管。
  2. 使用移液器缓慢将外源溶液（质粒、慢病毒或原始生殖细胞）注入玻璃针头中，避免针头内产生气泡。
  3. 将含有外源溶液的针头对准血管，使针头与待注射的血管平行。
  4. 轻柔地将充满溶液的针头插入血管，并在显微镜下启动泵以推出溶液（通常注射体积约为1–5 µL）。气泵压力应足够低，以防止血管破裂，过高的气压会导致血管损伤并引起高速流动。
    1. 当外源溶液注入血管后，应观察到血管颜色变为溶液的颜色，并在2–5秒内恢复为红色，表明外源溶液已成功递送至血管。此时溶液进入动脉，随着心脏搏动经动脉循环回胚胎，再进入静脉。
      注意：血管注射有两个注射位点（图1B）：其一是头部，将外源溶液从胚胎头部的静脉注入，随血流进入心脏，再随着心脏搏动循环至整个胚胎（图1B，箭头1）；另一个是通过胚胎的背主动脉进行注射，外源溶液注入后随胚胎心脏搏动扩散至整个胚胎（图1B，箭头2）。
  5. 注射完成后，将鸡蛋从体视显微镜下取出，在蛋壳内滴加200 µL青霉素溶液。剪取一段3 cm长的医用胶带封闭窗口，用剪刀轻轻刮压胶带以挤出任何气泡，再剪另一段胶带横向密封开口。
  6. 标记已注射的鸡蛋，并将其放回孵育箱中，继续孵育至所需发育阶段或出壳。

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结果

本文展示了鸡胚的 in ovo 血管内注射技术。图1 展示了血管内注射的示意图；在本研究中，我们使用了多种外源性溶液进行注射测试与验证。

为了更清晰地观察注射的物质，将0.4%的台盼蓝作为示踪剂注入胚胎。观察到示踪剂（蓝色）扩散至整个胚胎。 通过 通过背主动脉或头部注射实现血液循环（图2）。在两个不同位点注射的材料能够扩散至整个胚胎，表明其通过血液循环扩散。蓝色的可视化证实了注射成功。

将 pEGFP-N1 载体用 PEI 包裹，使其浓度达到 1 µg/µL；而慢病毒载体 pLVX-EGFP 则用 PEI 包裹后，经滴定稀释，使病毒浓度达到 5 x 106 Tu/µL。将包裹后的 pEGFP-N1 或 pLVX-EGFP 注射至 2.5 天胚胎（HH 14-15 期）中。在 4.5 天（HH 24 期）时，通过体视荧光显微镜观察胚胎。观察到胚胎中出现绿...

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讨论

鸡胚 in ovo 血管内注射方法已优化，可用于将外源性物质（载体、病毒或原始生殖细胞）导入胚胎。基于该方法，我们构建了稳定基因过表达或干扰的鸡胚模型（SpinZ、JUN、UBE2I 等）17,18,19。这些成熟的模型证实了该技术的可行性。此外，我们不仅将分离的原始生殖细胞转移至受体胚胎的生殖腺，还成功获得了移植诱导型原始生殖细胞至胚胎生殖腺后发育而成的可存活后代，表明该方法在未来具有广阔的应用前景20。

该方法的关键步骤是注射。外源物质必须直接注入血管内，不能过深或过浅。因此，该操作需要具备鸡胚操作经验以及较高的注射技术，但通过练习可较容易地掌握。与气室注射相比，该方法更容易实现较高的注射效率和准确性。除了成本较高和步骤较复杂等局限性外，当制作较大的窗口时，不宜采用电转染技术，因其可能导致胚胎存活率降低。

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本工作由国家自然科学基金（31972547）资助。我们感谢美国华盛顿州立大学王静的编辑工作以及Malik Donlic的配音工作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
荧光宏观-显微镜OLYMPUSMVX10
玻璃毛细管NarishigeG1
Lipofectamine 2000Invitrogen12566014脂质体
pEGFP-N1 载体Clontech#6085-1
PKH26 红色荧光细胞连接试剂盒 SigmaPKH26GL
pLVX-EGFP 慢病毒载体Addgene128652
气动显微注射仪NarishigeIM-11-2
拉制仪NarishigePC-100
台盼蓝染色液Gibco15250061

参考文献

  1. Bednarczyk, M., Dunislawska, A., Stadnicka, K., Grochowska, E. Chicken embryo as a model in epigenetic research. Poultry Science. 100 (7), 101164(2021).
  2. Darnell, D. K., Schoenwolf, G. C. The chick embryo as a model system for analyzing mechanisms of development. Developmental Biology Protocols. , Humana Press. New York, NY. 25-29 (2000).
  3. Fauzia, E., et al. Chick embryo: a preclinical model for understanding ischemia-reperfusion mechanism. Frontiers in Pharmacology. 9, 1034(2018).
  4. Fonseca, B. B., da Silva, M. V., de Morais Ribeiro, L. N. The chicken embryo as an in vivo experimental model for drug testing: Advantages and limitations. Lab Animal. 50 (6), 138-139 (2021).
  5. Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. Journal of Visualized Experiments. (9), e408(2007).
  6. Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In ovo electroporation in embryonic chick retina. Journal of Visualized Experiments. (60), e3792(2012).
  7. Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e55628(2017).
  8. van de Lavoir, M. -C., et al. Germline transmission of genetically modified primordial germ cells. Nature. 441 (7094), 766-769 (2006).
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  10. Park, T. S., Han, J. Y. piggyBac transposition into primordial germ cells is an efficient tool for transgenesis in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (24), 9337-9341 (2012).
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  14. Yu, F., et al. Isolation, characterization and germline chimera preparation of primordial germ cells from the Chinese Meiling chicken. Poultry Science. 98 (2), 566-572 (2019).
  15. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
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  17. Jin, K., et al. UBE2I stimulates female gonadal differentiation in chicken (Gallus gallus) embryos. Journal of Integrative Agriculture. 20 (11), 2986-2994 (2021).
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  19. Jiang, J., et al. Spin1z induces the male pathway in the chicken by down-regulating Tcf4. Gene. 780, 145521(2021).
  20. Zhao, R., et al. Production of viable chicken by allogeneic transplantation of primordial germ cells induced from somatic cells. Nature Communications. 12 (1), 2989(2021).

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