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基于浴铜灵的比色法测定组织非血红素铁含量

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DOI：

10.3791/63469

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2022年1月31日

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1i3S - Instituto de Investigação e Inovação em Saúde, Universidade do Porto, 2Basic and Clinical Research on Iron Biology, IBMC - Instituto de Biologia Molecular e Celular, Universidade do Porto, 3Iron and Innate Immunity, IBMC - Instituto de Biologia Molecular e Celular, Universidade do Porto, 4ICBAS - Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文提供了一种利用简单且成熟的比色法测定动物组织中非血红素铁含量的实验方案，该方法可在大多数实验室中轻松实施。

摘要

铁是一种必需的微量营养素。铁过载和铁缺乏均对人体有严重危害，机体组织中的铁水平受到精密调控。利用铁过载或铁缺乏的实验动物模型，对于深入理解系统性和细胞水平铁稳态调控机制起到了关键作用。动物组织总铁含量的测定通常采用原子吸收光谱法，或基于非血红素铁与浴菲咯啉试剂反应的比色法。多年来，比色法已被广泛用于多种动物组织中非血红素铁含量的测定。与原子吸收光谱法不同，该方法可排除红细胞中血红蛋白所含血红素铁的干扰。此外，该方法无需复杂的分析技术或昂贵的仪器设备，因此可在大多数实验室中便捷实施。最后，比色法既可采用比色皿法，也可适配于微孔板格式，从而实现更高通量的样本检测。本文提供了一种成熟可靠的实验方案，适用于多种铁过载或铁缺乏实验动物模型中组织铁水平变化的检测。

引言

铁是一种必需的微量营养素，是参与氧气运输、能量生成和DNA合成等关键生物过程的蛋白质发挥功能所必需的。重要的是，铁过量和铁缺乏均对人体健康造成严重危害，机体组织中的铁水平受到精密调控。异常的膳食铁吸收、缺铁饮食、反复输血以及慢性炎症是全球数十亿人铁相关疾病常见的病因1,2,3。

铁过载或铁缺乏的实验动物模型在推动我们理解系统性和细胞水平铁稳态调控机制方面发挥了重要作用4。尽管过去二十年取得了显著进展，但仍有许多关键方面尚不明确。在未来几年中，准确测定动物组织中的总铁含量仍将是推进铁生物学领域研究的关键步骤。

大多数实验室采用原子吸收光谱法（AAS）、电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）或基于非血红素铁与邻二氮杂菲试剂显色反应的比色法来定量组织中的铁含量。后者基于Torrance和Bothwell在50多年前首次描述的方法5,6。尽管此后有研究开发了以菲啰嗪替代邻二氮杂菲的改进方法7，但邻二氮杂菲仍是文献中引用最广泛的显色试剂。

选择何种方法通常取决于现有的专业知识和基础设施。虽然原子吸收光谱法（AAS）和电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）具有更高的灵敏度，但比色法仍被广泛使用，因其具备以下重要优势：i）排除了红细胞中血红蛋白所含血红素铁的干扰；ii）无需复杂的分析技能或昂贵的仪器设备；iii）原始的比色皿法可改装为微孔板形式，从而提高样本通量。本文所介绍的比色法已被常规用于定量多种实验动物模型（从小鼠、鱼类到果蝇）在铁过载或铁缺乏状态下组织中非血红素铁水平的变化。本文提供了一种使用简单且成熟可靠的比色法测定动物组织中非血红素铁含量的实验方案，大多数实验室均可轻松实施。

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方案

C57BL/6 小鼠购自商业渠道，铁调素缺失（hepcidin-null）Hamp1−/−C57BL/6 背景小鼠8 由法国科钦研究所Sophie Vaulont惠赠。动物饲养于i3S动物实验设施中，环境温度与光照受控，符合特定病原体阴性条件，并可自由获取标准啮齿类饲料和饮水。欧洲海鲈（Dicentrarchus labrax从商业养鱼场购买，并饲养于ICBAS动物实验设施中，环境温度与光照条件受控，每日喂食 随意摄取 使用标准海鲈鱼饲料喂养。所有涉及脊椎动物的实验程序均经i3S动物伦理委员会及国家主管部门——葡萄牙食品与兽医局（Direção-Geral de Alimentação e Veterinária，DGAV）批准。有关商用试剂、仪器和动物的信息列于下文 材料表.

1. 溶液配制

注意：所有试剂和溶液的处理与配制均需使用无铁玻璃器皿或一次性塑料器皿。为避免铁污染，切勿让金属实验材料（例如不锈钢药匙）接触任何试剂或溶液。确保所有可重复使用的玻璃器皿均不含铁。使用适当的实验室洗涤剂清洗器皿30-60分钟，用去离子水冲洗，再用去离子水按1:3比例稀释的37%硝酸溶液浸泡过夜，然后再次用去离子水冲洗，并使其自然晾干。

  1. 酸混合液：在玻璃瓶中加入10 g三氯乙酸至82.2 mL 37%盐酸中，充分溶解后用去离子水定容至100 mL。使用前摇匀。也可仅使用37%盐酸进行组织消化。
    注意：该溶液在避光的棕色玻璃试剂瓶中保存时，至少可稳定存放2个月。
    警告：盐酸和三氯乙酸具有腐蚀性，其浓溶液会释放有毒酸性蒸气。操作酸类时必须始终穿戴防护服、耐化学腐蚀手套和防溅护目镜。避免吸入蒸气，并务必在通风橱内操作。
  2. 饱和乙酸钠溶液：在玻璃瓶中将228 g无水乙酸钠加入400 mL去离子水中，室温下振荡过夜。静置沉淀1天。若无沉淀析出，可继续少量添加乙酸钠。将溶液储存于玻璃瓶中。
  3. 显色剂试剂：配制1 mL显色剂试剂时，将1 mg 4,7-二苯基-1,10-菲咯啉二磺酸二钠盐溶于500 µL去离子水中，加入10 µL浓（100%）巯基乙酸，充分溶解后用去离子水定容至1 mL。
    注意：按需配制显色剂试剂。避光保存时，该溶液可稳定存放1个月。
  4. 工作用显色剂（WCR）：取1份体积的显色剂试剂，加入5份体积的饱和乙酸钠溶液和5份体积的去离子水。
    注意：该溶液应在使用当天新鲜配制。
  5. 铁标准储备液：配制20 mM铁标准储备液时，将111.5 mg羰基铁粉置于含有5,480 µL 37%盐酸的250 mL容量瓶中。室温下静置过夜使其溶解（或置于沸水浴中孵育）。然后用去离子水定容至100 mL。
    注意：该标准溶液在密封良好的容器中可长期保存。
  6. 工作用铁标准溶液（WISS）：在500 µL去离子水中加入13.5 µL 37%盐酸，再加入10 µL铁标准储备液，最后用去离子水定容至1 mL（含Fe 11.169 µg/mL，200 µM；经原子吸收光谱法测定）。
    注意：该工作溶液应在使用当天新鲜配制。

2. 样品干燥

  1. 用手术刀切取一块重 10–100 mg 的组织样品，并在分析/精密天平上使用一小片石蜡膜准确称重（鲜重）。
  2. 使用塑料镊子将组织样品放入 24 孔板中（不加盖，以允许水分蒸发），并在 65 °C 的标准培养箱中干燥 48 小时。
  3. 或者，可使用实验室微波消解炉干燥组织样品。使用塑料镊子将已称重的组织样品放入无铁的聚四氟乙烯（Teflon）杯中，并在微波炉中进行干燥。根据仪器使用说明书设置操作参数。
    注意：作为参考，使用特定消解炉（见材料表）干燥肝脏样品的操作参数见表 1。
  4. 使用塑料镊子将每份干燥后的组织样品置于分析/精密天平内一小片石蜡膜上，准确称重（干重）。

3. 样品酸消化

  1. 使用塑料镊子将每块干燥的组织转移至1.5 mL微量离心管中。
  2. 加入1 mL酸混合液并盖紧微量离心管。同时制备一份酸空白样，除不加组织外，其余操作相同。
    注意：酸混合液具有腐蚀性，并会释放有毒蒸气。操作时应穿戴防护服、耐化学腐蚀手套和防化学飞溅护目镜。避免吸入其蒸气，且务必在通风橱内操作。
  3. 将微量离心管置于65 °C培养箱中孵育20小时，以消化组织。
  4. 冷却至室温后，使用配有塑料吸头的微量移液器吸取500 µL澄清（呈黄色）的酸提取液（上清液），转移至新的1.5 mL微量离心管中。若无法获得澄清上清液，可进行短暂离心。
    注意：上清液酸性极强。操作时应穿戴防护服、耐化学腐蚀手套和防化学飞溅护目镜，并始终在通风橱内进行操作。
    ​注：此时酸提取液可立即用于比色测定，或于-20 °C冷冻保存以备后续使用。使用前需将冷冻样品完全解冻至室温，并涡旋混匀。

4. 显色反应

  1. 根据表2中的指示，在1.5 mL微量离心管中配制显色反应液；若需高通量操作，可直接在平底、96孔、透明、未处理的聚苯乙烯微孔板中进行。所有反应（酸空白、标准品和样品）均需至少设置两个重复。
  2. 室温孵育15分钟。

5. 吸光度读数

  1. 使用去离子水作为空白对照，在分光光度计或酶标仪中于535 nm波长处测定样品的吸光度。酶标板可在加盖或不加盖条件下检测。若加盖检测，需在测量前去除因酸蒸气释放而在盖内表面形成的冷凝液，以避免对吸光度读数造成干扰。
    注意：以去离子水为参比，酸空白样的光吸收值应低于0.015；标准品与样品的光吸收值应在0.100至1.000之间。对于铁含量极高或极低的样品，可调整酸提取液（上清液）和去离子水的体积2O 可能需要调整（表2）：若吸光度大于1.0，则使用较小的样品（上清液）体积；若吸光度低于0.1，则使用较大的上清液体积。样品体积（Vsmp在计算每个样本的组织铁含量时需考虑此因素（见步骤6）。

6. 组织铁含量的计算

  1. 使用以下公式计算非血红素组织铁含量：
    组织铁含量（µg/g 干组织）= 静态平衡公式示意图；用于科学计算中体积比和力的评估。
    AT = 测试样品的吸光度
    AB = 酸空白的吸光度
    AS = 标准品的吸光度
    Fes = WISS 中的铁浓度（µg Fe/mL）
    W = 干组织重量（g）
    Vsmp = 样品体积（表 2 中上清液的可变体积，换算为 mL）
    Vf = 65 °C 过夜孵育后酸混合物的最终体积（对应酸体积加上干组织体积，单位为 mL；若样品重量无显著差异，可假设为恒定体积 ≈ 1 mL）
    Vstd = 铁标准品体积（表 2 中 WISS 的体积，换算为 mL）
    Vrv = 最终反应体积（表 2 中的总体积，换算为 mL）

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结果

比色皿与96孔微孔板的比较
通过菲啰啉类试剂反应测定组织非血红素铁的方法最初由Torrance和Bothwell5,6描述，该方法依赖分光光度计进行吸光度读数，因此所使用的显色反应体积需适配常规分光光度计比色皿的尺寸。本研究介绍了一种方法学改进，即将显色反应直接在96孔微孔板中进行，并使用微孔板读数仪测定吸光度，从而减少试剂用量，并提高检测通量。

为了比较两种方法的灵敏度，首先对工作铁标准溶液（WISS）进行系列稀释，并按照表2所示，在1.5 mL离心管或96孔板中分别进行显色反应。吸光度分别使用分光光度计（带比色皿）或微孔板读板仪测定。两种方法生成的代表性标准曲线如图1A所示。在两种情况下，线性关系均非常高（微孔板法为r2 = 0.9996，比色皿法为r2 = 0.9997），覆盖所测试...

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讨论

本文提供了一种测定动物组织中非血红素铁含量的实验方案，该方法基于Torrance和Bothwell最初描述的邻菲罗啉比色法5,6，并进行了适当改进。该方法的关键步骤包括：组织样本的干燥；通过酸水解使蛋白质变性并释放无机铁；在还原剂巯基乙酸存在下，将三价铁（Fe3+）还原为二价亚铁状态（Fe2+），随后与邻菲罗啉试剂发生显色反应（生色反应）；测定生成的亚铁离子-邻菲罗啉粉红色复合物的吸光度；最后计算组织中的铁含量。

本研究展示了如何将原有的比色皿法方案改进为基于96孔板的高通量形式，同时不降低检测的灵敏度。值得注意的是，这种改进可显著节省时间，原因如下：1）利用多通道移液器可在96孔板中同时制备更多的显色反应；2）使用酶标仪读取吸光度的速度远快于分光光度计。基于微孔板的检测另一重要优势在于可调整显色反应的体积，从而显著降低试剂成本（尤其是邻菲罗啉试剂）。整个实验流程可在4天内完成。样品干燥（在65 °C烘箱中进行时最长可达4...

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致谢

本工作由葡萄牙科学技术基金会（FCT-Fundação para a Ciência e a Tecnologia, I.P.）通过项目编号 UIDB/04293/2020 的国家基金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96 孔紫外透明板Sarstedt82.1581.001
分析天平KernABJ 220-4M
无水乙酸钠Merck106268
邻菲罗啉二磺酸钠（4,7-二苯基-1,10-菲啰啉二磺酸）Sigma-AldrichB1375
C57BL/6 小鼠（Mus musculus）Charles River Laboratories
羰基铁粉，≥99.5%Sigma-Aldrich44890
聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）一次性比色皿VWR634-0678P
双蒸灭菌水B. Braun0082479E
荧光酶标仪BioTek InstrumentsFLx800
盐酸，37%Sigma-Aldrich258148
微波消解炉及白色聚四氟乙烯消解杯CEMMDS-2000
硝酸Fisher Scientific15687290
烘箱BinderED115
啮齿类动物饲料Harlan Laboratories2014S含铁量为 175 mg/kg 的 Teklad Global 14% 蛋白啮齿类维持饲料
海鲈鱼（Dicentrarchus labrax）Sonrionansa
海鲈鱼饲料SkrettingL-2 Alterna 1P
单光束紫外-可见分光光度计ShimadzuUV mini 1240
巯基乙酸Merck100700
三氯乙酸Merck100807

参考文献

  1. Muckenthaler, M. U., Rivella, S., Hentze, M. W., Galy, B. A red carpet for iron metabolism. Cell. 168, 344-361 (2017).
  2. Pagani, A., Nai, A., Silvestri, L., Camaschella, C. Hepcidin and anemia: A tight relationship. Frontiers in Physiology. 10, 1294(2019).
  3. Weiss, G., Ganz, T., Goodnough, L. T. Anemia of inflammation. Blood. 133 (1), 40-50 (2019).
  4. Altamura, S., et al. Regulation of iron homeostasis: Lessons from mouse models. Molecular Aspects of Medicine. 75, 100872(2020).
  5. Torrance, J. D., Bothwell, T. H. A simple technique for measuring storage iron concentrations in formalinised liver samples. South African Journal of Medical Sciences. 33 (1), 9-11 (1968).
  6. Torrence, J. D., Bothwell, T. H. Tissue iron stores. Methods in Haematology. Cook, J. D. , Churchill Livingston Press. New York. 104-109 (1980).
  7. Rebouche, C. J., Wilcox, C. L., Widness, J. A. Microanalysis of non-heme iron in animal tissues. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 58 (3), 239-251 (2004).
  8. Lesbordes-Brion, J. C., et al. Targeted disruption of the hepcidin 1 gene results in severe hemochromatosis. Blood. 108, 1402-1405 (2006).
  9. Jumbo-Lucioni, P., et al. Systems genetics analysis of body weight and energy metabolism traits in Drosophila melanogaster. BMC Genomics. 11, 297(2010).
  10. Mandilaras, K., Pathmanathan, T., Missirlis, F. Iron Absorption in Drosophila melanogaster. Nutrients. 5, 1622-1647 (2013).
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