Phormidium lacuna 是一种从海洋潮池中分离得到的丝状蓝细菌。本文介绍了从自然环境中分离丝状体、DNA 提取、基因组测序、自然转化、sfGFP 表达、冷冻保存以及运动性检测方法。
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本文内容
摘要
摘要
蓝藻是基础研究和生物技术项目的重点，这些项目利用太阳能进行生物量生产。Phormidium lacuna 是一种新分离的丝状蓝藻。本文描述了如何从海洋潮池岩石中分离新的丝状蓝藻，以及如何从丝状体中提取DNA并进行基因组测序。尽管许多单细胞蓝藻物种的转化技术已建立，但丝状蓝藻的转化报道较少。本文介绍了一种简化的小 P. lacuna 天然转化方法。P. lacuna 是目前唯一已建立天然转化的颤藻目成员。本文还展示了如何利用天然转化表达超级折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）。内源的 cpcB 启动子诱导的表达强度比来自集胞藻 Synechocystis sp. PCC6803 的 cpc560、A2813 或 psbA2 启动子强约5倍。此外，本文建立了 P. lacuna 和集胞藻 Synechocystis sp. CPP 6803 的低温保存方法，并描述了在液体培养基以及琼脂和塑料表面评估其运动能力的方法。
引言
蓝细菌是利用光合作用作为能量来源的原核生物1,2。目前，越来越多的研究聚焦于蓝细菌物种。多种蓝细菌可通过DNA进行转化3，在这些物种中可实现基因敲除或过表达。然而，转化技术仅限于少数物种4,5,6,7,8,9,10,11，且在来自培养保藏或野外分离的菌株中建立转化体系可能较为困难8。丝状物种Phormidium lacuna的菌株（图1）分离自海洋潮池，在这些环境中，盐浓度或温度等条件会随时间波动。这类丝状蓝细菌可作为其所属的颤藻目（Oscillatoriales）的模式生物12<....
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方案
1. 从自然环境中分离
注意：可分离绿藻、硅藻、丝状蓝藻及其他微藻。该方案可用于在实验室条件下培养的岩池中任何微藻物种的分离。属于颤藻目（Oscillatoriales）的丝状蓝藻可通过其运动性和丝状形态轻松识别。该物种可通过基因组测序或16S rRNA测序在半纯状态下进行鉴定。
- 将来自海洋潮池（即岩质海岸上的凹坑）的液态海水样品转移至50 mL三角瓶中。对每个三角瓶，记录自然来源的准确位置或坐标。若有可能，通过50 µm滤网过滤样品内容物，以减少浮游动物的量。将样品在4 °C下保存，直至可进行继代培养。
- 将1 mL培养物转移至含有f/2培养基中3%细菌琼脂的10 cm培养皿中22,23（参见材料表）。准备最多20个平板。在50 µmol m-2 s-1的白光下培养。
注意：可采用更高的光照强度进行培养。P. lacuna可耐受高达400 µmol m-2 s-1的光照强度，但其他物种可能对光更敏感。 - 一周后，在无菌条件下使用双目显微镜和无菌镊子将目标细胞转移至新鲜的琼脂平板上。将旧的琼脂平板在4 °C下保存，直....
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结果
按照上述方法，5 种不同菌株的 P. lacuna 从潮池中分离并进行测序（图1 和 表1）。除个别外，所有培养物在约1年传代培养后均保持无菌 P. lacuna HE10JO。该菌株仍被污染有 Marivirga atlantica，一种海洋细菌。在随后的赫尔戈兰岛考察中，从岩池中分离出其他丝状蓝细菌，这些蓝细菌不同于 P. lacuna 并且需要进行表征.
测试了多种DNA提取与纯化方法 P. lacuna最佳结果采用上述优化的CTAB方法获得，DNA得率为310 ± 50 µg/mL，OD260 nm/OD280 nm为1.7 ± 0.03，OD260 nm/OD230 nm为0.78 ± 0.04（n = 17）。基因组测序结果显示，所有菌株的DNA均存在轻微差异，符合预期（表1). 核心蛋白序列的最大差异为0.04%（表 2.......
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讨论
尽管许多蓝藻菌株可从培养保藏中心获得32,33,34,35,36，由于这些物种适应了特定的环境特性，因此对从野外分离新的蓝细菌仍存在需求。 P. lacuna 从岩池中采集，适应盐浓度和温度的变化30该物种的菌株于2008年、2009年和2010年的野外考察中被发现。通过本文所述方法，已分离出5株 P. lacuna 被分离出来，其中4株为无菌株。该菌株 P. lacuna HE10JO 被细菌永久污染 大西洋海杆菌，一种通过rRNA和基因组测序鉴定的海洋细菌。尽管采用了机械分离、不同温度下培养、抗生素处理或化学处理等多种方法，该细菌仍无法与蓝藻分离。尽管存在污染， P. lacuna
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披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
本工作由卡尔斯鲁厄理工学院资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Autoclave 3870 ELV | Tuttnauer | 3870 ELV | |
| Bacto 琼脂 | OttoNorwald | 214010 | |
| BG-11 淡水培养基溶液 | Sigma Aldrich | C3061 | |
| BG-11 培养基 | 默克 | 73816-250ML | |
| 硼酸 | 默克 | 10043-35-3 | H3BO3 |
| 二水合氯化钙 | Carl Roth | 10035-04-8 | CaCl₂2 · 2 H2O |
| 细胞培养瓶 Cellstar，带滤膜螺旋盖，无菌，250 mL | 格赖纳 | 658190 | |
| 细胞培养瓶 Cellstar，带滤膜螺旋盖，无菌，50 mL | Greiner | 601975 | |
| Centrifuge LYNX 4000 | 赛默飞世尔科技 | 75006580 | 和转子 |
| Centrifuge microstar 17 | VWR International | N/A | 最高可达 13,000 rpm |
| 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB） | PanReac AppliChem | 57-09-0 | C19H42BrN |
| 氯仿 : 异戊醇 24 : 1 | PanReac AppliChem | A1935 | |
| 六水合氯化钴(II) | 默克 | 7791-13-1 | CoCl2 · 6 H2O |
| 五水合硫酸铜(II) | 默克 | 7758-99-8 | CuSO₄4 · 5 H2O |
| D(+)-生物素 | 卡尔·罗斯 | 58-85-5 | 蓝细菌是基础研究和生物技术项目中的研究重点，这些项目利用太阳能进行生物质生产。Phormidium lacuna 是一种新近分离的丝状蓝细菌。本文描述了如何从海洋潮池中分离新的丝状蓝细菌，以及如何从丝状体中提取 DNA 并进行基因组测序。尽管许多单细胞蓝细菌已建立遗传转化方法，但丝状蓝细菌的转化报道较少。本文介绍了一种简化的方法，用于实现 P. lacuna 的自然转化。P. lacuna 是目前唯一建立自然转化体系的颤藻目（Oscillatoriales）成员。本文还展示了如何利用自然转化表达超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）。内源性 cpcB 启动子的表达强度约为 Synechocystis sp. PCC6803 中 cpc560、A2813 或 psbA2 启动子的 5 倍。此外，本文建立了 P. lacuna 和 Synechocystis sp. PCC6803 的冷冻保存方法，并描述了在液体培养基以及琼脂和塑料表面评估其运动能力的方法。10H16N2O3S |
| DNA标准分子量1 kb | New England Biolabs | N3232 | |
| DNA分子量标准 100 bp | New England Biolabs | N3231 | |
| 电动移液器助力 AccuJet®-Pro S | Brand GmbH | 26360 | 用于移取 1–25 mL 液体 |
| 乙醇 | VWR | 64-17-5 | C2H6O |
| 乙二胺四乙酸二钠盐二水合物 | Carl Roth | 6381-92-6 | EDTA-Na2 · 2 H2O |
| 荧光显微镜 ApoTome | 蔡司 | ||
| 荧光显微镜 Axio Imager 2 | 蔡司 | ||
| French压力细胞破碎仪 | American Instrument Company | N/A | |
| 凝胶成像系统 Safe Image | Invitrogen | ||
| Mupid-One/-exu 电泳系统 | 高级 | ||
| 玻璃器皿，不同类型 | |||
| 甘油 | 卡尔·罗斯 | 56-81-5 | C3H8O3 |
| 六水合三氯化铁 | 默克 | 10025-77-1 | FeCl3 · 6 H2O |
| 卡那霉素 | Sigma-Aldrich | 25389-94-0 | |
| 硫酸卡那霉素 | 卡尔·罗斯 | 25389-94-0 | C18H36N4O11 · H2SO4 |
| 月桂酰肌氨酸钠（Sarcosyl） | Sigma Aldrich | 137-16-6 | 聚球藻15H28无3 · Na |
| LB肉汤（Lennox） | 卡尔·罗斯特 | X964.4 | |
| 光源，荧光灯管 L18W/954 日光 | OSRAM | 蓝藻培养 | |
| 光源，LED 面板 XL 6500K 140 W | 绽放之星 | N/A | 蓝细菌的培养，最高可达 1,000 µmol m-2 s-1 |
| 六水合氯化镁 | Carl Roth | 7791-18-6 | MgCl2 · 6 H2O |
| 四水合氯化锰(II) | 塞尔瓦 | 13446-34-9 | MnCl2 · 4 H2O |
| 显微镜 DM750 | Zeiss | ||
| Midi prep 质粒提取试剂盒 NucleoBond Xtra Midi 试剂盒 | Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG | REF740410.50 | |
| 微型计算机 Raspberry Pi 4 + | Conrad Electronics | 2138863-YD | 用于延时记录 |
| EC3 眼科相机 | Leica | 用于长达 30 秒的连续记录 | |
| Ocular camera MikrOkular 全高清 | Bresser | 用于延时记录，连接至树莓派微型计算机 | |
| 培养皿 聚苯乙烯，100 mm × 20 mm | 默克 | P5606-400EA | |
| 培养皿 聚苯乙烯，60 mm × 15 mm | 默克 | P5481-500EA | |
| Nanodrop ND-1000 分光光度计 | Peqlab Biotechnologie | ||
| 光度计 Uvikon XS | Goebel Instrumentelle Analytik GmbH | ||
| Pipetman 100-1,000 µL | Gilson | SKU: FA10006M | |
| Pipetman 10-100 µL | Gilson | SKU: FA10004M | |
| 10 mL 无菌塑料移液管 | Greiner | 607107 | |
| 塑料管，无菌，15 mL | 格赖纳 | 188271 | |
| 无菌塑料管，50 mL | 格赖纳 | 227261 | |
| 溴化钾 | Carl Roth | 7758-02-3 | KBr |
| 氯化钾 | 卡尔·罗斯 | 7447-40-7 | KCl |
| 电源供应器 Statron 3252-1 | Statron Gerätetechnik GmbH | ||
| 电源供应器 Voltcraft PPS 16005 | Conrad Electronics | 用于LED | |
| 蛋白酶K | Promega | MC500C | 来自 Maxwell 16 miRNA 组织试剂盒 AS1470 |
| Q5聚合酶 | New England Biolabs | M0491S | |
| 测序试剂盒 NextSeq 500/550 v2.5 | Illumina | ||
| 测序系统 NextSeq 550 SY-415-1002 | Illumina | ||
| Shaker Unimax 2010 | Heidolph Instruments | 用于培养 | |
| 乙酸钠 | 卡尔·罗斯 | 127-09-3 | NaCH3COO |
| 氯化钠 | 卡尔·罗斯 | 7647-14-5 | NaCl |
| 一水合二氢磷酸钠 | Carl Roth | 10049-21-5 | NaH2PO4 · H2O |
| 氟化钠 | Carl Roth | 7681-49-4 | NaF |
| 碳酸氢钠 | 卡尔·罗斯 | 144-55-8 | NaHCO₃3 |
| 二水合钼酸钠 | 塞尔瓦 | 10102-40-6 | Na2MoO4 · 2 H2O |
| 硝酸钠 | 默克 | 7631-99-4 | NaNO3 |
| 硫酸钠 | 卡尔·罗特 | 7757-82-6 | Na2SO4 |
| 六水合氯化锶 | 卡尔·罗特 | 10025-70-4 | SrCl2 · 6 H2O |
| 盐酸硫胺 | 默克 | 67-03-8 | 聚球藻12H17ClN4OS · HCl |
| TRIS | Carl Roth | 77-86-1 | 蓝细菌是基础研究和生物技术项目中的研究重点，这些项目利用太阳能进行生物质生产。Phormidium lacuna 是一种新分离的丝状蓝细菌。本文描述了如何从海洋潮池中分离新的丝状蓝细菌，以及如何从丝状体中提取DNA并进行基因组测序。尽管转化技术已在许多单细胞蓝细菌中建立，但在丝状蓝细菌中报道较少。本文介绍了一种简化的方法，用于实现 P. lacuna 的自然转化。P. lacuna 是目前唯一建立自然转化体系的颤藻目（Oscillatoriales）成员。本文还展示了如何利用自然转化表达超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）。实验表明，内源性 cpcB 启动子的表达强度约为 Synechocystis sp. PCC6803 中 cpc560、A2813 或 psbA2 启动子的5倍。此外，本文建立了 P. lacuna 和 Synechocystis sp. PCC6803 的冷冻保存方法，并描述了在液体培养基以及琼脂和塑料表面评估其运动能力的方法。4H11无3 |
| 超声波设备UP100H配MS3探头 | Hielscher 超声波技术 | UP100H | |
| Ultraturrax Silent Crusher M | Heidolph Instruments | 匀浆器 | |
| 尿素 | 卡尔·罗斯 | 57-13-6 | CH4N2O |
| 维生素B12 | Sigma | 68-19-9 | C63H88CoN14O14P |
| 维生素溶液 | 0.3 µM 盐酸硫胺素，2.1 nM 生物素，0.37 nM 氰钴胺 | ||
| 蒸馏水器，水处理 | 威立雅水处理技术 | ELGA_21001 | |
| 七水合硫酸锌 | Sigma | 7446-20-0 | ZnSO4 · 7 H2O |
| 软件，URL | |||
| 用于DNA组装的gatb-minia程序 | https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline | 基于 Linux，利用短 DNA 读长构建大型 scaffold | |
| ImageJ | 图像处理软件（像素强度、圆圈直径） | ||
| RAST 注释服务器 | https://rast.nmpdr.org | 输入：基因组DNA序列，检测开放阅读框，列出蛋白质序列及其功能 | |
| 培养基 | |||
| 人工海水 | 0.41 M NaCl，53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4，10 mM CaCl2 ，9 mM KCl，2.4 mM NaHCO₃3 ，0.84 mM KBr，0.49 mM H3BO3, 90 µM SrCl2, 72 µM NaF | ||
| f/2 液体培养基 | 人工海水，0.1 %（v/v）微量元素溶液，0.05 %（v/v）维生素溶液，0.88 mM NaNO₃3, 36 µM NaH2PO4 | ||
| f/2+ 液体培养基 | f/2培养基，其中NaNO₃浓度提高10倍3 和 NaH2PO4 （0.88 mM NaNO₃）3, 36 µM NaH2PO4 | ||
| f/2+-琼脂 | 3 %（w/v）细菌琼脂，人工海水，0.1 %（v/v）微量元素溶液，0.05 %（v/v）维生素溶液，8.8 mM NaNO₃3，0.36 mM NaH2PO4 | ||
| f/2-琼脂 | 3 %（w/v）细菌琼脂，人工海水，0.1 %（v/v）微量元素溶液，0.05 %（v/v）维生素溶液，0.88 mM NaNO₃3, 36 µM NaH2PO4 | ||
| 微量元素溶液 | 0.36 mM NaH2PO4, 12 µM Na2EDTA，39 nM CuSO₄4，26 nM Na2MoO4 ，77 nM ZnSO₄4，42 nM CoCl2, 0.91 µM MnCl2 | ||
| 维生素溶液 | 0.3 µM 硫胺素盐酸盐，2.1 nM 生物素，0.37 nM 氰钴胺 |
参考文献
- Brasil, B., de Siqueira, F. G., Salum, T. F. C., Zanette, C. M., Spier, M. R. Microalgae and cyanobacteria as enzyme biofactories. Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts. 25, 76-89 (2017).
- Gundolf, R., Oberleitner, S., Richter, J. Evalua....
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