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方法文章

丝状蓝细菌Phormidium lacuna的自然转化、蛋白表达与低温保存

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DOI：

10.3791/63470

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2022年2月1日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Botanical Institute, Karlsruhe Institute of Technology KIT, 2Institute for Biological Interfaces 5 (IBG 5), Karlsruhe Institute of Technology KIT, 3Institut für Technische Mikrobiologie, Hochschule Mannheim

本文内容

摘要

Phormidium lacuna 是一种从海洋潮池中分离得到的丝状蓝细菌。本文介绍了从自然环境中分离丝状体、DNA 提取、基因组测序、自然转化、sfGFP 表达、冷冻保存以及运动性检测方法。

摘要

蓝藻是基础研究和生物技术项目的重点，这些项目利用太阳能进行生物量生产。Phormidium lacuna 是一种新分离的丝状蓝藻。本文描述了如何从海洋潮池岩石中分离新的丝状蓝藻，以及如何从丝状体中提取DNA并进行基因组测序。尽管许多单细胞蓝藻物种的转化技术已建立，但丝状蓝藻的转化报道较少。本文介绍了一种简化的小 P. lacuna 天然转化方法。P. lacuna 是目前唯一已建立天然转化的颤藻目成员。本文还展示了如何利用天然转化表达超级折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）。内源的 cpcB 启动子诱导的表达强度比来自集胞藻 Synechocystis sp. PCC6803 的 cpc560、A2813 或 psbA2 启动子强约5倍。此外，本文建立了 P. lacuna 和集胞藻 Synechocystis sp. CPP 6803 的低温保存方法，并描述了在液体培养基以及琼脂和塑料表面评估其运动能力的方法。

引言

蓝细菌是利用光合作用作为能量来源的原核生物1,2。目前，越来越多的研究聚焦于蓝细菌物种。多种蓝细菌可通过DNA进行转化3，在这些物种中可实现基因敲除或过表达。然而，转化技术仅限于少数物种4,5,6,7,8,9,10,11，且在来自培养保藏或野外分离的菌株中建立转化体系可能较为困难8。丝状物种Phormidium lacuna的菌株（图1）分离自海洋潮池，在这些环境中，盐浓度或温度等条件会随时间波动。这类丝状蓝细菌可作为其所属的颤藻目（Oscillatoriales）的模式生物12。

在测试电穿孔法进行基因转移的实验中13,14 ，发现P. lacuna可通过自然转化实现转化15。在此过程中，某些细胞能够自然摄取外源DNA。与其他转化方法16,17相比，自然转化的优势在于无需额外工具，从而避免了操作流程的复杂化。例如，电穿孔需要使用合适的比色杯、完好的导线以及精确的电压选择。P. lacuna目前是唯一可进行自然转化的颤藻目成员。由于原始方案基于电穿孔流程，仍包含若干可能不必要的洗涤步骤。本研究测试了多种简化策略，最终形成了本文所呈现的转化方案。

基因组序列对于基于基因敲除或过表达的进一步分子研究至关重要。尽管利用下一代测序仪可在较短时间内获得基因组序列，但DNA的提取可能较为困难，且依赖于物种特性。针对P. lacuna，测试了多种提取方案，最终建立了一种改良的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法，该方法可获得纯度良好、产量稳定的DNA，满足实验室后续工作的需要。利用该方案已成功完成五个菌株的基因组测序。下一步的自然转化目标是建立P. lacuna中的蛋白表达体系。

本方案中用作标记蛋白的 sfGFP 可通过任何荧光显微镜进行检测。P. lacuna 中测试的所有启动子均可用于驱动 sfGFP 表达。随着转化获得的菌株数量不断增加，亟需建立一种菌种保藏方法。目前，该方法已广泛应用于大肠杆菌（Escherichia coli）及多种其他细菌18。标准方案通常制备甘油菌液，经液氮处理后于 -80 °C 保存。该方法步骤较少，对于已确立该方法的物种而言可靠性高。然而，标准方案不适用于 P. lacuna，因为在部分情况下无法复苏活细胞。但在解冻后去除甘油，所有试验中的细胞均得以存活。本文还提供了对 P. lacuna 运动性进行分析的简便方法，这些方法可与基因敲除诱变相结合，用于研究 IV 型菌毛或光感受蛋白的功能。这些检测方法不同于单细胞蓝细菌的检测方法19,20,21，也可为其他颤藻类群的研究提供参考。

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方案

1. 从自然环境中分离

注意：可分离绿藻、硅藻、丝状蓝藻及其他微藻。该方案可用于在实验室条件下培养的岩池中任何微藻物种的分离。属于颤藻目（Oscillatoriales）的丝状蓝藻可通过其运动性和丝状形态轻松识别。该物种可通过基因组测序或16S rRNA测序在半纯状态下进行鉴定。

  1. 将来自海洋潮池（即岩质海岸上的凹坑）的液态海水样品转移至50 mL三角瓶中。对每个三角瓶，记录自然来源的准确位置或坐标。若有可能，通过50 µm滤网过滤样品内容物，以减少浮游动物的量。将样品在4 °C下保存，直至可进行继代培养。
  2. 将1 mL培养物转移至含有f/2培养基中3%细菌琼脂的10 cm培养皿中22,23（参见材料表）。准备最多20个平板。在50 µmol m-2 s-1的白光下培养。
    注意：可采用更高的光照强度进行培养。P. lacuna可耐受高达400 µmol m-2 s-1的光照强度，但其他物种可能对光更敏感。
  3. 一周后，在无菌条件下使用双目显微镜和无菌镊子将目标细胞转移至新鲜的琼脂平板上。将旧的琼脂平板在4 °C下保存，直至新平板上的细胞出现并生长。
  4. 每周重复此转移步骤，以消除污染。用肉眼检测严重污染，并使用400倍放大倍率的显微镜进行额外的污染检查。
  5. 若样品似乎无污染，则在琼脂平板上检测细菌或真菌污染。用接种环取部分培养物转移至LB24琼脂平板（直径10 cm），将平板置于室温下，并在1–3天内观察污染物的生长情况。
  6. 若获得无菌的丝状蓝藻物种，则可用于进一步的培养工作。将P. lacuna在液体培养基或细菌琼脂平板上培养。液体培养时使用250 mL三角瓶，内含50 mL f/2培养基或f/2+培养基。

2. DNA 提取

注意：本方法改编自 25 26

  1. 准备两个含有50 mL f/2培养基的锥形瓶，每个锥形瓶接种约1 mL P. lacuna 来自其他培养物的丝状体。将培养物置于白光（50）下，以50 rpm转速振荡（水平旋转）培养7天或更长时间 µmol m-2 s-1) 在 25 °C.
  2. 用超声波处理培养物（参见 材料清单) 全能量处理 2 分钟。在 750 nm 处测量 OD 值，确保其约为 0.5。若 OD 值过低，则继续培养菌液。
  3. 以 5,000 × g 离心收集丝状体 × g，20 分钟离心。移除上清液。将带有残留液体的丝状体转移至法国压滤器的加压室中27将法国压滤器的压力设定为 20,000 psi 并进行细胞提取。
    注意：法国压榨机将裂解所有细胞并释放DNA；强烈的剪切力会产生1,500 bp的DNA片段。
  4. 将样品在 10,000 × g 条件下离心 10 分钟 × g 并移除上清液。
  5. 加入400 µL 裂解缓冲液（4 M 尿素，0.1 M Tris/Cl，pH 7.4）和 50 µ加入 10 mg/mL 蛋白酶 K 溶液至沉淀中。将样品加热至 55 ℃ °在 550 rpm 条件下振荡孵育 60 分钟。
  6. 加入1 mL DNA提取缓冲液（3% CTAB，1.4 M NaCl，10 mM EDTA，0.1 M Tris/Cl，1% Sarkosyl，0.1 M DTT，pH 8），在55°C下孵育60分钟 °C 和 550 rpm。将溶液转移至离心管中，加入两倍体积的氯仿/异戊醇（24/1）。
  7. 振荡后，在9,000 × g条件下离心样品5分钟 × g. 将上层水相转移至反应小管中，加入1 mL预冷的乙醇和50 µ3 M 醋酸钠溶液，体积为 L
  8. 涡旋样品并置于 -20 °C，1 小时或更长时间。
  9. 离心5分钟，10,000 × g × g (4 °C）并弃去上清液。用70%乙醇洗涤沉淀。
  10. 再次离心样品。移去上清液，并将沉淀物过夜干燥。用无核酸酶的水溶解DNA。测定DNA的光谱，以检查OD 260 nm/OD 280 nm比值是否 介于 1.6 和 1.9 之间。
  11. 在琼脂糖凝胶电泳中分析DNA片段的大小28.
  12. 通过下一代测序对基因组DNA进行300个循环的测序，采用双端测序模式，读长为150个碱基（参见 材料清单).
  13. 使用合适的计算机程序进行组装；参见所提供的示例 材料表.
  14. 将草图基因组提交至RAST服务器进行注释。
    ​注意：上传DNA序列可在几分钟内获得完整注释。

3. 天然转化与GFP表达

注意：转化基于在 E. coli 中扩增的质粒载体；可使用 pGEM-T 或 pUC19 作为骨架载体。许多实验室已建立克隆技术；另请参见标准方案28 以及关于 P. lacuna 转化载体的文章15,29。sfGFP 表达所用载体的示例见结果代表部分。四种尚未发表载体的详细信息见补充文件1。

  1. 所有步骤均需在无菌实验室条件（超净台、无菌玻璃器皿）下使用无菌材料进行。
  2. 在两个250 mL的锥形瓶中，各接种1 mL的f/2液体培养基，共两份，每份50 mL P. lacuna 来自正在培养的丝状体。在白光（50 µmol m-2 s-1）在25℃、振荡（水平旋转，50 rpm）条件下培养约5天 °C.
  3. 准备约200 µ使用中量提取试剂盒（midi prep kit）提取转化载体 DNA 的 g 材料表按照制造商说明书操作。
  4. 将100 mL样品均质化 P. lacuna 细胞悬液（参见 材料清单) 在10,000 rpm下离心3分钟。测定750 nm处的OD值（目标值 = 0.35）。
  5. 将细胞悬液在6,000 × g下离心15分钟 × g. 去除上清液，将沉淀重悬于 800 µL（包括残留液体和丝状体的总体积）剩余液体及额外f/2+ 培养基
  6. 取八份 f/2+ 含 120 的 Bacto-琼脂平板（直径 10 cm） µg/mL 卡那霉素。用移液器加入 10 µ将 DNA 的 g 加入每个琼脂平板的中央。立即用移液器加入 100 µ将细胞悬液各1 L加入每个琼脂平板中央（置于DNA上方）。
  7. 将无盖的琼脂平板置于超净工作台中，使多余液体挥发。随后盖上平板，在25℃白光条件下培养。 °C下培养2天。
  8. 用接种环将每个f/2琼脂平板上的丝状体分散到多个新鲜的f/2琼脂平板上+ 含 120 的 Bacto-琼脂平板 µg/mL 卡那霉素。在25℃白光条件下培养平板 °C，并定期在显微镜下检查培养物。
  9. 在显微镜下观察7-28天后，鉴定存活的转化菌丝。寻找健康、呈绿色的菌丝（图2）与其他丝状体不同。如果能够识别出这些绿色丝状体，则继续下一步；否则，将培养皿再保留7天。
  10. 使用镊子将这些已鉴定的活体丝状体转移至50 mL液体f/2培养基中+ 含250的培养基 µg/mL 卡那霉素。在25℃白光下培养 °在摇床（水平旋转，50 rpm）上培养，观察生长情况长达四周。
  11. 将丝状体转移回含有250的琼脂培养基中 µg/mL 卡那霉素，并等待丝状体生长。数天后，将单根丝状体转移至含有更高浓度卡那霉素的新鲜琼脂平板上，例如 500 µg/mL。保留原始平板。
  12. 确保在液体培养或琼脂培养基中，以高浓度卡那霉素维持丝状体的增殖。再次提高卡那霉素浓度以加速分离。
    注意：转化后 P. lacuna 可在高达 10,000 的条件下生长 µg/mL 卡那霉素。其他物种可能无法耐受如此高的浓度。
  13. 如果抗性细胞在平板上生长并广泛分布，可检测插入片段在基因组中的整合情况 P. lacuna 通过使用外侧引物和内侧引物进行PCR扩增。
    1. 使用为插入片段克隆设计的引物作为内侧引物。
    2. 在设计外侧引物时，选择位于基因组上拟插入位点的5'端和3'端的序列 P. lacuna 但在插入片段之外。 
    3. PCR 反应中使用内侧引物和外侧引物。使用抗性菌株和野生型菌株。 
      注：内侧引物表明插入片段存在；外侧引物表明插入片段位于正确位点。
  14. 每个PCR反应中，直接取约10 mg的丝状体放入PCR管中，按照标准操作程序进行PCR反应。24若未获得产物，可调整退火温度，并用水清洗菌丝。
    注意：PCR 可使用多种不同的聚合酶。标准聚合酶（如 Taq 聚合酶）的错误率高于具有校对功能的聚合酶，但后者价格更高。本分析型 PCR 无需使用具有校对功能的聚合酶。然而，若使用标准聚合酶未能获得 PCR 产物，则应尝试使用具有校对功能的聚合酶。
  15. 在琼脂糖凝胶电泳中分析抗性菌株的PCR产物24.
    1. 将条带位置与标记物进行比较，并比较野生型和转化子。使用内部 和 外侧引物，观察转化子是否比野生型出现更大的条带（由于抗性盒的插入），或转化子出现两条条带：一条与野生型条带大小相同，另一条更大。后一种情况表明分离不完全，需继续在高浓度卡那霉素条件下培养。
      注：有关PCR和电泳的更多细节，请参见15,24 或其他标准文献。
  16. 用于GFP表达：使用荧光显微镜观察单根丝状体（参见 材料表在物镜放大倍数为40x或63x的条件下，采集明场透射图像和荧光图像。GFP检测使用以下设置：激发光波长为470 nm带通滤光片，发射光波长为525 nm带通滤光片，分光镜波长为495 nm，初始曝光时间为500 ms。
  17. 调整曝光时间以获得清晰的荧光信号，避免信号饱和。尽量对所有样品使用相同的设置。
  18. 由于野生型丝状体也会发出荧光，因此需使用与上述相同的设置拍摄背景荧光图像。
    ​注意：表达GFP的菌株必须具有更高的信号；否则，即表示未表达GFP。
  19. 根据荧光图像的曝光时间和像素强度，计算并比较不同丝状体的GFP含量。

4. 冷冻保存

注意：P. lacuna 和单细胞蓝细菌 Synechocystis sp. PCC 6803 被使用。本方法对 P. lacuna 的效果更佳。

  1. 培养 P. lacuna 或 集胞藻属sp PCC 6803 在 10 mL f/2 培养基中培养至少 10 天+ 或 BG-11 培养基，在白光（50 µmol m-2 s-1) 在 25 °C，振荡培养（水平旋转，50 rpm）。
  2. 匀浆处理 P. lacuna 培养（参见 材料表) 在10,000 rpm下离心3分钟，或使用超声波设备（参见 材料表) 2分钟，全能量处理。测定任一培养物在750 nm处的OD值，以确认其数值在1至7之间。
  3. 通过离心在 6,000 × g 条件下收集细胞 × g 15 分钟后，去除上清液。
  4. 将细胞沉淀重悬于800 µf/2 升+ 或 BG-11 培养基（终体积），转移至 2 mL 冻存管中。加入 800 µ加入1体积50%甘油溶液至细胞悬液中。盖紧小瓶，通过反复倒置混匀。
  5. 将冻存管转移至液氮中，并存放在-80℃超低温冰箱的冻存盒内 °C 冷冻箱。记录盒子在冷冻箱中的位置以及样品在盒子内的坐标。
  6. 为回收细胞，取出冻存管并在室温下解冻内容物。将内容物转移至2 mL离心管中。
  7. 将样品洗涤两次。对于1st 洗涤，6,000离心 × g 5 分钟。移除上清液，将沉淀重悬于 2 mL f/2 培养基中+ 或 BG-11 培养基。对于 2nd 洗涤，于6,000离心后重新离心 × g 5 分钟后，去除上清液，将沉淀重悬于 2 mL f/2 培养基中+ 或 BG-11 培养基。
  8. 为检验这些准备用于培养的细胞的完整性，将菌体沉淀转移至9 mL培养基中，并在白光（50 µmol m-2 s-1在振荡（55 rpm）条件下培养，比较培养物在第一天和一周后的OD 750 nm值。

5. Phormidium lacuna 的运动性

注意：将描述三种不同的检测方法。所有情况下均使用同一种培养物。

  1. 在f/2培养基中，于白光（50 µmol m-2 s-1）条件下以水平振荡（50 rpm）培养P. lacuna约5天，直至估计OD 750 nm达到0.35。将样品储存于4 °C，待用。
  2. 以10,000 rpm均质化丝状体（见材料表）3分钟，或以超声（见材料表）在最大功率和1个循环下处理1分钟。测定OD 750 nm。若OD值高于0.35，则用f/2培养基稀释该组分。将此溶液用于步骤5.3、5.4和5.5中的运动性检测。
  3. 液体培养基中的运动性检测
    1. 为直接观察运动性，将8 mL含有P. lacuna的培养基（来自步骤5.2）转移至6 cm培养皿中。静置数分钟，使样品达到室温。用玻璃纸膜覆盖培养皿。
    2. 将显微镜载玻片置于配备相机的标准显微镜的x-y载物台上。打开显微镜光源。理想情况下，始终使用相同的电学和光学照明设置。将4倍或10倍物镜移入光路中。
    3. 将培养皿置于载玻片上方。通过载物台的x、y和z方向移动，调整单根丝状体或丝状体束的位置。
      注：由于三维排列，仅部分相关区域可处于焦平面内。玻璃纸膜可实现无限制的焦距调节。
    4. 观察单根丝状体或束的运动。确保物镜不接触液体。使用标准显微镜相机记录丝状体的运动（见补充视频S1）。
  4. 表面运动性检测
    1. 为观察丝状体在琼脂表面的运动性，准备含f/2细菌琼脂的6 cm培养皿。确保琼脂高度足够，使物镜可接近琼脂表面。或者，制备约3 mm厚的琼脂层，并透过琼脂记录丝状体（将培养皿倒置或使用倒置显微镜）。
    2. 用移液器将0.5 mL含有P. lacuna的溶液（来自步骤5.2）滴加至6 cm培养皿的细菌琼脂表面。让液体渗入表面。盖上培养皿，使用4倍或10倍物镜观察丝状体在表面的运动。
    3. 确保在整个记录过程及后续记录中使用相同的显微镜电学和光学设置。
    4. 使用目镜相机和微型计算机系统采集延时图像。确保连续图像之间的时间间隔为5秒至1分钟。编程微型计算机的Linux脚本以控制延时记录。示例脚本见补充文件2，示例视频见补充视频S2。
  5. 趋光性检测
    1. 进行趋光性实验时，制备发光二极管（LED）支架（此处使用3D打印机打印），将选定的5 mm LED安装于其中，以便从下方至上方照射20 mm2的区域（图3）。如需，可并行使用多个LED支架，每个LED通过电阻和电位器连接至可调电源。根据实验需要测量并调节LED光强。确保整个装置处于暗室或封闭的暗容器中。
    2. 将8 mL含有P. lacuna的培养基（来自步骤5.2）加入6 cm培养皿中。调节LED光强。盖上培养皿盖，将其置于LED支架上，使LED位于培养皿中心。
    3. 经过所需时间（通常为2天）后，使用智能手机相机直接对准光照处理位置拍摄培养皿图像。使用白色LED面板照射样品。使用相机的手动设置；避免光线反射；始终调整以确保相机镜头与样品之间的距离一致。确保曝光设置可获得适合后续使用ImageJ分析的图像。
    4. 使用ImageJ软件量化丝状体中央圆圈的直径。
      1. 打开ImageJ，点击文件 | 打开，选择目标文件，点击回车。
      2. 选择直线按钮（带直线图标）。按住鼠标左键，从培养皿一端画线至对侧，确保直线穿过丝状体圆圈的中心。
      3. 按键盘上的Ctrl-K，或点击ImageJ菜单中的分析 | 绘制剖面图。查看显示像素强度随距离变化的x-y窗口——即培养皿的一维剖面图。确保最低像素强度略高于0，最高值低于255。
      4. 估算圆圈外像素强度的平均值和圆圈内像素强度的平均值。在y轴上这两个值之间的位置，通过鼠标指向估算圆圈两侧的x值。记录这两个值并计算其差值。
      5. 将鼠标指向右侧y轴位置，获取最大x值。记录该值e，其代表培养皿的直径。若该直径为5 cm，则计算中央丝状体圆圈的直径为d/e × 5 cm。

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结果

按照上述方法，5 种不同菌株的 P. lacuna 从潮池中分离并进行测序（图1 和 表1）。除个别外，所有培养物在约1年传代培养后均保持无菌 P. lacuna HE10JO。该菌株仍被污染有 Marivirga atlantica，一种海洋细菌。在随后的赫尔戈兰岛考察中，从岩池中分离出其他丝状蓝细菌，这些蓝细菌不同于 P. lacuna 并且需要进行表征.

测试了多种DNA提取与纯化方法 P. lacuna最佳结果采用上述优化的CTAB方法获得，DNA得率为310 ± 50 µg/mL，OD260 nm/OD280 nm为1.7 ± 0.03，OD260 nm/OD230 nm为0.78 ± 0.04（n = 17）。基因组测序结果显示，所有菌株的DNA均存在轻微差异，符合预期（表1). 核心蛋白序列的最大差异为0.04%（表 2...

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讨论

尽管许多蓝藻菌株可从培养保藏中心获得32,33,34,35,36，由于这些物种适应了特定的环境特性，因此对从野外分离新的蓝细菌仍存在需求。 P. lacuna 从岩池中采集，适应盐浓度和温度的变化30该物种的菌株于2008年、2009年和2010年的野外考察中被发现。通过本文所述方法，已分离出5株 P. lacuna 被分离出来，其中4株为无菌株。该菌株 P. lacuna HE10JO 被细菌永久污染 大西洋海杆菌，一种通过rRNA和基因组测序鉴定的海洋细菌。尽管采用了机械分离、不同温度下培养、抗生素处理或化学处理等多种方法，该细菌仍无法与蓝藻分离。尽管存在污染， P. lacuna

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披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

本工作由卡尔斯鲁厄理工学院资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Autoclave 3870 ELVTuttnauer3870 ELV
Bacto 琼脂OttoNorwald214010
BG-11 淡水培养基溶液Sigma AldrichC3061
BG-11 培养基默克73816-250ML
硼酸默克10043-35-3H3BO3
二水合氯化钙Carl Roth10035-04-8CaCl₂2 · 2 H2O
细胞培养瓶 Cellstar，带滤膜螺旋盖，无菌，250 mL格赖纳658190
细胞培养瓶 Cellstar，带滤膜螺旋盖，无菌，50 mLGreiner601975
Centrifuge LYNX 4000赛默飞世尔科技75006580和转子
Centrifuge microstar 17VWR InternationalN/A最高可达 13,000 rpm
十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）PanReac AppliChem57-09-0C19H42BrN
氯仿 : 异戊醇 24 : 1PanReac AppliChem
A1935
六水合氯化钴(II)默克7791-13-1CoCl2 · 6 H2O
五水合硫酸铜(II)默克7758-99-8 CuSO₄4 · 5 H2O
D(+)-生物素卡尔·罗斯58-85-5 蓝细菌是基础研究和生物技术项目中的研究重点，这些项目利用太阳能进行生物质生产。Phormidium lacuna 是一种新近分离的丝状蓝细菌。本文描述了如何从海洋潮池中分离新的丝状蓝细菌，以及如何从丝状体中提取 DNA 并进行基因组测序。尽管许多单细胞蓝细菌已建立遗传转化方法，但丝状蓝细菌的转化报道较少。本文介绍了一种简化的方法，用于实现 P. lacuna 的自然转化。P. lacuna 是目前唯一建立自然转化体系的颤藻目（Oscillatoriales）成员。本文还展示了如何利用自然转化表达超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）。内源性 cpcB 启动子的表达强度约为 Synechocystis sp. PCC6803 中 cpc560、A2813 或 psbA2 启动子的 5 倍。此外，本文建立了 P. lacuna 和 Synechocystis sp. PCC6803 的冷冻保存方法，并描述了在液体培养基以及琼脂和塑料表面评估其运动能力的方法。10H16N2O3S
DNA标准分子量1 kbNew England BiolabsN3232
DNA分子量标准 100 bpNew England BiolabsN3231
电动移液器助力 AccuJet®-Pro SBrand GmbH26360用于移取 1–25 mL 液体
乙醇VWR64-17-5C2H6O
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物Carl Roth6381-92-6EDTA-Na2 · 2 H2O
荧光显微镜 ApoTome蔡司
荧光显微镜 Axio Imager 2蔡司
French压力细胞破碎仪American Instrument CompanyN/A
凝胶成像系统 Safe ImageInvitrogen
Mupid-One/-exu 电泳系统高级
玻璃器皿，不同类型
甘油卡尔·罗斯56-81-5C3H8O3
六水合三氯化铁默克10025-77-1 FeCl3 · 6 H2O
卡那霉素Sigma-Aldrich25389-94-0
硫酸卡那霉素卡尔·罗斯25389-94-0C18H36N4O11 · H2SO4
月桂酰肌氨酸钠（Sarcosyl）Sigma Aldrich137-16-6聚球藻15H28无3 · Na
LB肉汤（Lennox）卡尔·罗斯特X964.4
光源，荧光灯管 L18W/954 日光OSRAM蓝藻培养
光源，LED 面板 XL 6500K 140 W绽放之星N/A蓝细菌的培养，最高可达 1,000 µmol m-2 s-1
六水合氯化镁Carl Roth7791-18-6MgCl2 · 6 H2O
四水合氯化锰(II)塞尔瓦13446-34-9MnCl2 · 4 H2O
显微镜 DM750Zeiss
Midi prep 质粒提取试剂盒 NucleoBond Xtra Midi 试剂盒Macherey-NAGEL GmbH & Co. KGREF740410.50
微型计算机 Raspberry Pi 4 +Conrad Electronics2138863-YD用于延时记录
EC3 眼科相机Leica用于长达 30 秒的连续记录
Ocular camera MikrOkular 全高清Bresser用于延时记录，连接至树莓派微型计算机
培养皿 聚苯乙烯，100 mm × 20 mm默克P5606-400EA
培养皿 聚苯乙烯，60 mm × 15 mm默克P5481-500EA
Nanodrop ND-1000 分光光度计Peqlab Biotechnologie
光度计 Uvikon XSGoebel Instrumentelle Analytik GmbH
Pipetman 100-1,000 µLGilsonSKU: FA10006M
Pipetman 10-100 µLGilsonSKU: FA10004M
10 mL 无菌塑料移液管Greiner607107
塑料管，无菌，15 mL格赖纳188271
无菌塑料管，50 mL格赖纳227261
溴化钾Carl Roth7758-02-3KBr
氯化钾卡尔·罗斯7447-40-7KCl
电源供应器 Statron 3252-1Statron Gerätetechnik GmbH
电源供应器 Voltcraft PPS 16005Conrad Electronics用于LED
蛋白酶KPromegaMC500C来自 Maxwell 16 miRNA 组织试剂盒 AS1470
Q5聚合酶New England BiolabsM0491S
测序试剂盒 NextSeq 500/550 v2.5Illumina
测序系统 NextSeq 550 SY-415-1002Illumina
Shaker Unimax 2010Heidolph Instruments用于培养
乙酸钠卡尔·罗斯127-09-3NaCH3COO
氯化钠卡尔·罗斯7647-14-5NaCl
一水合二氢磷酸钠Carl Roth10049-21-5NaH2PO4 · H2O
氟化钠Carl Roth7681-49-4NaF
碳酸氢钠卡尔·罗斯144-55-8NaHCO₃3
二水合钼酸钠塞尔瓦10102-40-6Na2MoO4 · 2 H2O
硝酸钠默克7631-99-4NaNO3
硫酸钠卡尔·罗特7757-82-6Na2SO4
六水合氯化锶卡尔·罗特10025-70-4SrCl2 · 6 H2O
盐酸硫胺默克67-03-8聚球藻12H17ClN4OS · HCl
TRISCarl Roth77-86-1蓝细菌是基础研究和生物技术项目中的研究重点，这些项目利用太阳能进行生物质生产。Phormidium lacuna 是一种新分离的丝状蓝细菌。本文描述了如何从海洋潮池中分离新的丝状蓝细菌，以及如何从丝状体中提取DNA并进行基因组测序。尽管转化技术已在许多单细胞蓝细菌中建立，但在丝状蓝细菌中报道较少。本文介绍了一种简化的方法，用于实现 P. lacuna 的自然转化。P. lacuna 是目前唯一建立自然转化体系的颤藻目（Oscillatoriales）成员。本文还展示了如何利用自然转化表达超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）。实验表明，内源性 cpcB 启动子的表达强度约为 Synechocystis sp. PCC6803 中 cpc560、A2813 或 psbA2 启动子的5倍。此外，本文建立了 P. lacuna 和 Synechocystis sp. PCC6803 的冷冻保存方法，并描述了在液体培养基以及琼脂和塑料表面评估其运动能力的方法。4H11无3
超声波设备UP100H配MS3探头Hielscher 超声波技术UP100H
Ultraturrax Silent Crusher MHeidolph Instruments匀浆器
尿素卡尔·罗斯57-13-6CH4N2O
维生素B12Sigma68-19-9C63H88CoN14O14P
维生素溶液0.3 µM 盐酸硫胺素，2.1 nM 生物素，0.37 nM 氰钴胺
蒸馏水器，水处理威立雅水处理技术ELGA_21001
七水合硫酸锌Sigma7446-20-0ZnSO4 · 7 H2O
软件，URL
用于DNA组装的gatb-minia程序https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline基于 Linux，利用短 DNA 读长构建大型 scaffold
ImageJ图像处理软件（像素强度、圆圈直径）
RAST 注释服务器https://rast.nmpdr.org输入：基因组DNA序列，检测开放阅读框，列出蛋白质序列及其功能
培养基
人工海水0.41 M NaCl，53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4，10 mM CaCl2 ，9 mM  KCl，2.4 mM NaHCO₃3 ，0.84 mM KBr，0.49 mM H3BO3, 90 µM SrCl2, 72 µM NaF
f/2 液体培养基人工海水，0.1 %（v/v）微量元素溶液，0.05 %（v/v）维生素溶液，0.88 mM NaNO₃3, 36 µM NaH2PO4 
f/2+ 液体培养基f/2培养基，其中NaNO₃浓度提高10倍3 和 NaH2PO4 （0.88 mM NaNO₃）3, 36 µM NaH2PO4
f/2+-琼脂3 %（w/v）细菌琼脂，人工海水，0.1 %（v/v）微量元素溶液，0.05 %（v/v）维生素溶液，8.8 mM NaNO₃3，0.36 mM NaH2PO4
f/2-琼脂3 %（w/v）细菌琼脂，人工海水，0.1 %（v/v）微量元素溶液，0.05 %（v/v）维生素溶液，0.88 mM NaNO₃3, 36 µM NaH2PO4
微量元素溶液0.36 mM NaH2PO4, 12 µM Na2EDTA，39 nM CuSO₄4，26 nM Na2MoO4 ，77 nM ZnSO₄4，42 nM CoCl2, 0.91 µM MnCl2
维生素溶液0.3 µM 硫胺素盐酸盐，2.1 nM 生物素，0.37 nM 氰钴胺

参考文献

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