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雏鸡听觉脑干反应的评估

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DOI：

10.3791/63477

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2022年4月1日

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1Roxelyn and Richard Pepper Department of Communication Sciences and Disorders, Northwestern University, 2Knowles Hearing Research Center, Northwestern University, 3Department of Neurobiology, Northwestern University

本文内容

摘要

我们采用了标准的听觉脑干反应（ABR）技术，并将其应用于雏鸡，这是一种听觉功能的早熟鸟类模型。该方案详细阐述了动物准备和ABR信号采集的技术步骤，这些步骤可推广至其他鸟类或啮齿类动物模型。

摘要

听觉脑干反应（ABR）是临床听力学、非人类动物研究以及人类研究中一种极为重要的检测手段。尽管ABR广泛用于测量听觉神经同步性并评估其他脊椎动物模型系统中的听力敏感度，但近四十年来尚未见有关鸡ABR记录方法的报道。鸡是一种可靠的动物研究模型，因其听觉系统在胚胎晚期和出壳早期已接近功能成熟。我们展示了在鸡雏中使用皮下针电极阵列诱发单通道或双通道ABR记录的方法。无论电极记录构型（即导联方式）如何，ABR记录均在阈上强度的短声刺激后6毫秒内呈现出3至4个正向波峰波形。在高强度刺激下，峰-谷波形振幅范围为2–11 µV，正向波峰表现出预期的潜伏期-强度函数关系（即强度降低时潜伏期延长）。标准化的耳机位置对获得最佳记录至关重要，因为松弛的皮肤可能堵塞外耳道，而动物移动可能导致刺激换能器移位。随着动物体温下降，波峰振幅减小，潜伏期延长，这进一步支持了维持生理体温的必要性。对于年幼雏鸡（<孵化后3小时（1日龄），与较年长的幼体相比，听觉脑干反应（ABR）阈值升高约5 dB，波峰潜伏期延长约1-2 ms，峰-谷振幅降低约1 µV。这提示可能存在传导性相关问题（例如中耳腔内积液），在评估年轻幼体时应予以考虑。总体而言，本文所述的ABR方法可实现准确且可重复的记录 体内 小鸡雏鸟的听觉功能研究可应用于发育的不同阶段。这些发现可轻松与人类及哺乳动物的听力损失、衰老或其他听觉相关干预模型进行比较。

引言

对声音刺激诱发的神经反应的研究已有半个多世纪的历史1。听觉脑干反应（ABR）是一种诱发电位，数十年来一直被用于评估非人类动物和人类的听觉功能。人类的ABR通常表现为五个到七个波形峰，按惯例用罗马数字（I-VII）标记2。这些波峰根据其潜伏期（以毫秒为单位的发生时间）和振幅（以微伏为单位的峰-谷幅度）进行分析。ABR在评估听觉神经、脑干功能完整性以及听力阈值敏感性方面具有重要作用。听觉系统的功能缺陷会导致ABR潜伏期和振幅的缺失、减小、延长或异常。值得注意的是，这些参数在人类和其他动物中几乎相同，使其成为跨脊椎动物模型评估听觉功能的一种一致且客观的检测方法3。

其中一个模型系统是鸡，由于多种原因，它尤其具有研究价值。鸟类可分为晚成鸟和早成鸟4。晚成鸟孵化时感官仍在发育过程中；例如，仓鸮直到孵化后第四天才表现出稳定的听觉脑干反应（ABR）5。而像鸡这样的早成动物在孵化时已具备接近成熟的感官功能。听觉的启动发生在胚胎发育阶段，因此在孵化前数天（胚胎第21天），听觉系统已接近功能成熟6,7,8。晚成鸟类及大多数哺乳动物模型易受外界因素影响其发育过程，且需要在听力成熟前进行饲养管理。鸡的听觉脑干反应（ABR）可在孵化当天即进行检测，无需喂养或提供富集环境。

鸡胚胎是生理学和发育研究中一个被广泛研究的模型，尤其在听觉脑干领域。具体结构包括鸡的耳蜗核，该核分为巨细胞核（NM）和角状核（NA），以及相当于哺乳动物内侧上橄榄核的鸟类结构——层状核（NL）6,7。听性脑干反应（ABR）非常适合用于研究前脑和皮层水平之前的中枢听觉功能。体内 ABR 测量与体外神经元在发育8、生理学9、频率拓扑组织10和遗传学11,12方面的研究之间的相互印证，为整体听觉功能的研究提供了理想的研究机会。

尽管听性脑干反应（ABR）已在哺乳动物模型中得到广泛研究，但在鸟类中的研究相对较少。既往关于鸟类ABR的研究包括对虎皮鹦鹉13、啄木鸟14、海鸥15、潜水鸟类16、斑胸草雀17、昼行性猛禽18、金丝雀19、三种猫头鹰5,20,21,22以及鸡23的特征描述。鉴于距上一次对鸡ABR进行全面表征已有近四十年，许多先前使用的设备和技术均已更新。来自其他鸟类模型研究的见解有助于建立现代鸡ABR研究方法，同时可作为与鸡ABR进行比较的依据。本文将详细介绍实验装置与设计，以实现雏鸡ABR的记录，该方法也可应用于发育的胚胎阶段以及其他小型啮齿类和鸟类模型。此外，由于鸡具有早成性发育特点，可在无需复杂动物饲养条件的情况下进行发育干预。在胚胎发育过程中实施的干预措施，可在动物孵化后数小时内即进行评估，此时其听觉功能已接近成熟水平。

方案

本研究所描述的实验已获得西北大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，并依照美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》进行。

1. 鸡的饲养管理

  1. 获取受精的白来航鸡鸡蛋。
    注意：科学研究中使用多种鸡种，但此处展示的结果来自白来航鸡（Gallus gallus domesticus）。尽管不同鸡种之间的听觉脑干反应（ABR）变异性尚不明确，但在成年蛋鸡与肉用型肉鸡之间进行比较时已发现某些差异24,25。
  2. 将鸡蛋置于38 °C、湿度50%的条件下孵化，孵化期为所需测试日期前21天。
    注意：若鸡蛋无法立即在38 °C下孵化，可暂时储存在14 °C、湿度40%的环境中。然而，鸡蛋在14 °C储存时间越长，成功发育为可孵化雏鸡的可能性越低。储存超过7天后，鸡蛋的存活率可能降至50%左右，具体取决于在14 °C下存放的时间长短。冬季期间，鸡蛋的存活率也会下降。
  3. 每天定期翻蛋2-3次。大多数孵化器具备自动执行此操作的装置。
  4. 若使用泡沫聚苯乙烯孵化器或容纳超过6枚鸡蛋的孵化器，应在孵化前一天（即胚胎发育第20天，E20）将鸡蛋转移至小型38 °C孵化器中。鸡蛋通常在入孵后第21天（E21）孵化。
    注意：在孵化过程中，雏鸡会开始从蛋内“啄壳”（"pipping"），在蛋壳上啄出一个小孔，并最终沿蛋壳周围完全裂开。若环境过于干燥，蛋内水分会蒸发，导致雏鸡无法成功破壳。根据以往关于鸡蛋孵化存活率的研究，湿度应维持在约50%26,27,28,29。
  5. 确定雏鸡的年龄。若未亲自观察到孵化过程，则判断年龄的唯一依据是羊水干燥所需的大约2-3小时。
    ​注意：应根据处理的雏鸡数量，每天使用70%异丙醇对雏鸡孵化箱进行彻底清洁。雏鸡常在孵化器内留下排泄物、羽毛和羊水，可能造成环境和空气质量污染。

2. 药物制备

  1. 将动物放入一个较大的称量皿中进行称重。若放置动作足够轻柔，动物应不会移动。
    注意：质量范围通常为 30–45 g。较年轻的动物往往更重，这是由于存在卵黄储备且尚未排泄废物；而接近 24 小时龄及 P2 阶段的较年长动物体重通常较轻。
  2. 根据动物体重，配制包含氯胺酮（100 mg/mL）和赛拉嗪（20 mg/mL）的麻醉混合液，剂量分别为 50 mg/kg 氯胺酮和 16.68 mg/kg 赛拉嗪。
    ​注意：该麻醉混合液可由 1 mL 氯胺酮（100 mg/mL）、1.5 mL 赛拉嗪（20 mg/mL）和 2.5 mL H2O 配制而成。根据动物体重在 30–45 g 范围内，麻醉混合液的注射体积为 0.05–0.1 mL。

3. 药物注射与动物准备

  1. 用一只手握住动物，确保将其腿部按住。
  2. 触摸动物的胸骨，即龙骨突；在龙骨突两侧即为胸肌。
  3. 使用29号针头和注射器，刺入皮肤约5 mm，将氯胺酮/赛拉嗪混合物注射至胸肌内。根据动物体重，注射0.05–0.1 mL。
  4. 注射后将动物放回培养箱中。在麻醉起效期间，维持动物体温数分钟。
    1. 使用镊子轻夹动物脚趾，检查其颈部是否松弛。若无反射且颈部松弛，则表明动物已失去意识。
  5. 通过观察鸡的翼羽来判断其性别。若羽毛长度一致，则为雄性；若羽毛长短不一，则为雌性30。
    注：另一种性别鉴定方法是翻肛法，可通过泄殖腔观察雄性生殖器官31。该方法难度较高，若操作不当可能对动物造成伤害，因此推荐使用翼羽鉴定法。
  6. 使用棉签蘸取脱毛膏，涂抹于头部和颈部区域，尤其是鸟类耳道开口附近。
  7. 用70%异丙醇擦拭巾清除羽毛、残留的脱毛膏以及头部和颈部的皮肤。
  8. 使用70%异丙醇擦拭巾对皮下电极和直肠探头进行消毒。
  9. 将动物置于声学隔离且电磁屏蔽的实验室内，确保环境中的电噪声和声学噪声最小，以获得最佳记录效果。
    注：本实验在定制的声学隔离箱中进行，尺寸为24 × 24 × 25英寸。任何能够有效消除声学噪声以及交流电（美国为60 Hz）引起的电噪声的密闭空间或房间均可满足要求。
  10. 使用加热垫或温度控制系统维持动物体温。
  11. 插入润滑后的直肠探头，确保动物体温维持在37–41 °C（98.6–105 °F）之间32,33。
    注：若探头尺寸不合适，可让动物直接趴在温度探头上。
  12. 固定动物头部，或将喙部靠在某一物体上，以避免不必要的移动。若不影响呼吸，可使用油灰进行固定。
  13. 若动物在测试过程中开始恢复意识，应追加注射原剂量一半的麻醉混合剂。
    ​注：任何身体运动或发声均提示需追加麻醉剂量。轻微的喙部运动属于呼吸表现，可接受。

4. 电极放置

  1. 使用三个不锈钢氯化银针状电极，分别标记为：参考电极、活动电极和公共接地电极。
    注：参考电极也称为反相电极或"-"，活动电极也称为非反相电极或"+"。
  2. 将每个电极皮下插入头部2–3 mm，但深度不应穿透颅骨。使用长度为7 mm、直径为0.4 mm的电极。
  3. 将电极从皮肤穿出，暴露其尖端。这有助于最小化与皮肤的接触，并确保在不同动物间插入深度的一致性34。
    注：电极导线应留有足够松弛度，使得电极放置后不会产生拉力，避免将电极拉出或牵拉皮肤使其绷紧。
  4. 进行单通道记录时，将活动电极置于颅骨中线位置，尽可能靠后至外耳道水平。
    1. 将参考电极置于将要施加刺激的耳后位置，接地电极置于对侧外耳道后方的颈部 。
      注：若在动物颅骨或外耳道处进行手术操作，应将参考电极置于动物颈部中线位置。此方法与步骤4.4.1均被视为水平电极记录布局。
  5. 进行双通道记录时，使用两个负极和一个共用正极，后者需配合适配电缆使用。将接地电极皮下植入颈部，每个外耳道后方各放置一个参考电极。
  6. 检测电极阻抗。确保总体电极阻抗不超过5.0 kΩ，电极间阻抗应保持在3.0 kΩ以下。

5. ABR 记录

  1. 根据采集硬件和软件的不同，务必对所用刺激频率范围内的声级进行校准，以确保声音水平准确。
    注意：校准技术会因设备而异（参见讨论部分）。对于某些程序，可以在软件内编辑声音衰减。此处执行的校准程序包括使用1/8英寸B&K 4138电容式麦克风，在近似雏鸡耳道（约5 mm）的封闭耦合系统中记录频率刺激。随文提供了一份雏鸡幼体校准表作为补充表格。
  2. 将声音换能器装置移向动物的活动耳侧。将声音换能器置于耳道内约2 mm的浅深度位置。
    注意：根据所用声音换能器的不同，可连接一个塑料窥耳器并插入耳道。窥耳器的位置至关重要。如果声音被耳道壁阻挡或耳道受压闭合，听性脑干反应（ABR）将无法引出或表现为阈值出现约40 dB的偏移。
  3. 在测试过程中，若结果异常或未引出反应，应检查动物状态。如确有问题，需重新调整声音换能器在耳道内的位置。
    ​注意：由于皮肤较为松弛且动物可能发生移动，记录过程中窥耳器的位置可能会发生偏移。然而，在正确注射麻醉剂并确保动物完全无意识的情况下，可实现持续30–45分钟的无中断记录。

6. 数据采集

  1. 使用足够的设备/软件来生成声音刺激并记录/采集听性脑干反应（ABR）信号。
    注意：目前有多种 commercially available 或定制的 ABR 采集系统。在本实验中，采用的是 commercially available 的 Intelligent Hearing Systems (IHS) SmartEP USB 平台。能够调节记录参数至关重要；这些参数包括但不限于刺激强度、刺激时长、刺激频率、刺激呈现速率、高通和低通滤波器、伪迹剔除、扫描次数、采样率、包络形状以及刺激极性。
  2. 将伪迹剔除（AR）的上下限设为 ±25 µV，以便在扫描过程中因动物运动或噪声导致的信号被排除在分析之外。在所测试的群体中，因伪迹被剔除的扫描次数少于总扫描次数的 1%。
  3. 采集至少 1024 次扫描以获得总体平均反应。这可以通过两次各 512 次扫描的记录实现。此方法还可确保反应是由刺激诱发且具有可重复性。
  4. 将增益设为 100,000，低通滤波器设为 100 Hz，高通滤波器设为 3000 Hz。
    注意：上述低通和高通滤波器设置适用于使用 IHS 系统的记录，因此仅为推荐参数。使用 BIOSIG 软件对其他鸟类物种进行 ABR 记录时，信号滤波范围为 30 至 3000 Hz 5,13,14,16,22。
  5. 将刺激呈现速率设置为每秒 10 至 20 次刺激。较高的呈现速率会改变 ABR 峰潜伏期，尤其是后期峰的潜伏期13。较低的呈现速率将增加采集 ABR 所需的时间。
  6. 将点击刺激（click stimulus）的持续时间设为 100 µs。
    1. 若使用短音刺激（tone burst stimulus），应根据所需效果调整刺激的频率和持续时间。本研究中使用的短音刺激频率范围为 100–4000 Hz，尽管成年鸡的行为听觉范围为 2–9000 Hz35。
      注意：在 IHS 系统中，仅当短音刺激的频谱包络形状为梯形时，才能修改其上升和下降时间。然而，余弦平方和 Blackman 包络提供了常用于动物 ABR 实验的预设上升和下降时间。IHS 系统可显示短音刺激的频谱包络，以确保上升和下降时间适当。在 IHS 系统中无法编辑点击刺激的上升和下降时间。
  7. 将采样率设为允许的最高值（通常为 40 kHz），以获得最佳分辨率的数据。
    注意：某些系统（包括 IHS）使用的采样点数有限，会改变记录窗口的长度。例如，40 kHz（周期为 25 µs）的采样率可能仅允许 12 ms 的记录窗口，因此为了捕获短音 ABR，采用 20 kHz 采样率（周期为 50 µs）以实现 24 ms 的记录窗口。若直接比较点击和短音 ABR，应保持采样率一致，以维持相同的分辨率。
  8. 将刺激极性设为交替极性。此设置旨在消除耳蜗微音电位在 ABR 记录中的可视化干扰。若需观察耳蜗微音电位，则应使用疏波或密波作为刺激极性。
    注意：在选择刺激时，许多设置均可更改。所提供的增益和滤波器设置可能不适用于其他设备配置。大多数 ABR 设备的出厂默认设置并非针对雏鸡记录进行优化。
  9. 若每次记录 512 次扫描，需合并两次独立测试以生成 1024 次扫描的平均结果。
  10. 对于点击或短音刺激，在高于阈值的强度下采集 ABR 信号。
  11. 继续以逐步降低的强度进行记录，直至无法识别出诱发反应为止。
  12. 将 ABR 阈值定义为能够引发可检测诱发反应的最低刺激强度。以 5 dBSPL 为步长逐步降低刺激强度，以确定能够引发可检测峰的最低刺激强度。

7. 安乐死与实验终止

  1. 获取听觉脑干反应（ABR）数据后，准备过量剂量（0.1 mL）的安乐死溶液（戊巴比妥钠 390 mg/mL，苯妥英钠 50 mg/mL）。
  2. 通过夹趾法确认无反射反应后，使用29号针头在胸部肌肉注射安乐死溶液，进针深度为5 mm。注射技术与麻醉注射相同。
    注意：动物将在数分钟后死亡。在未观察到任何活动之前，不得进行操作或断头处理。 另一种安乐死方法是在翅膀下方的臂静脉进行静脉内注射。 
  3. 一旦动物失去反射反应且呼吸与心跳停止，立即使用锋利的剪刀或剪钳快速断头。
  4. 使用70%异丙醇擦拭布清洁加热垫、直肠探头和氯化银电极。
  5. 确保所有采集到的信号轨迹均已保存。如需进一步分析，可将文件导出为.txt格式，该格式可在记事本中查看或导入电子表格程序。

结果

雏鸡的代表性ABR记录
以下代表性结果和群体数据来自对43只动物进行的ABR记录。在给予超阈值点击刺激（75 dBSPL）后，所有雏鸡均一致地观察到三个正向波峰，这些波峰均出现在刺激开始后的6毫秒内。偶尔可在约6毫秒处观察到第四个波峰。尽管鸟类ABR波峰的识别在个体间存在差异（见讨论部分），但波峰仍以罗马数字标记为I–IV波。代表性ABR波形及其标注的波峰见图1A（上部迹线）。图1B展示了代表性迹线中标记的I波和III波的潜伏期-强度函数关系。刺激强度每降低20 dB，I波波峰潜伏期延长约0.3 ms。在75 dBSPL强度下，I–III波的平均出现时间分别为1.50 ms（±0.02 ms）、3.00 ms（±0.06 ms）和4.13 ms（±0.09 ms）（图1C）。I波和III波 始终表现为单一波峰。II波偶尔在2.5–3.2 ms之间出现多个较小的波峰。每个波峰均有对应的波谷，其中I波的峰-谷振幅为所有波峰中最大，平均为7 µV，在75 dB SPL时接近11 µV的最大振幅。

除了波幅最大外，雏鸡ABR的波I在不同个体间的峰潜伏期变异性最小。因此，选择该峰用于评估听力阈值敏感性。ABR阈值定义为能够引出可识别且可重复的波形峰的最低刺激强度。该判断由实验者主观确定，并由第二位实验者进行交叉核对以确认阈值的一致性。使用短声刺激时，波峰更清晰、更容易识别，但短音刺激也能产生清晰且可识别的波峰，其形态随刺激频率及其参数的不同而变化 （图1D，n = 4只雏鸡）。除1000 Hz外，短声诱发的ABR阈值均低于短音诱发的阈值。短声刺激的阈值范围为10–30 dBSPL。当短声诱发的ABR在>30 dBSPL时仍未能显示可识别的波峰，通常是因为动物活动导致耳道中的耳镜脱落所致。

体温降低会延长听觉脑干反应（ABR）的潜伏期
神经活动的速度——通过波形振幅峰值出现的时间（即潜伏期）来衡量——已知在较低体温下会减慢36,37。该现象在雏鸡的听觉脑干反应（ABR）中通过75 dBSPL的短声刺激得到观察。代表性记录轨迹如图2A所示。尽管刺激强度保持不变，随着体温从39 °C下降，ABR各波峰值的出现时间逐渐延迟。图2B展示了该代表性记录中波I和波III潜伏期随体温降低的变化情况。较低体温与波I峰值潜伏期之间存在显著相关性（R2 = 0.89，图2C，n = 5只雏鸡）。这些结果表明，在进行ABR记录时，维持接近正常体温至关重要。若无法维持接近正常体温，则ABR的潜伏期-强度函数及振幅测量结果将表现出高度变异性，且常不准确。

早期孵化个体的潜伏期与振幅差异
研究表明，与小鸡听觉 onset 相关的神经活动在胚胎发育晚期已接近成熟8。然而，对于一小部分非常早期的孵化个体（<孵化后3小时，我们观察到对75 dB SPL短声刺激的听性脑干反应（ABR）波形出现潜伏期峰值偏移（n = 4），或无法识别诱发电位（n = 2只雏鸡）。在2只年幼雏鸡中，无法引出短音刺激的ABR，且短声反应阈值升高50 dB SPL。这可能归因于传导性问题，即动物耳道或中耳腔内仍存在液体，或神经成分发育不成熟。哺乳动物研究曾报道新生儿的听阈偏移可达50 dB。38,39代表性实验动物如下 >3小时，这也恰好与羽毛干燥所需的时间一致。 图3A 显示从幼年（P1， <3小时龄）以及较年长的幼雏（P2）。在分析中，仅有3只年轻的幼雏呈现出全部三个ABR波峰。与较年长的幼雏相比，其波形潜伏期显著延长，波形振幅略有降低图3B-C，分别）。

参考电极放置与双通道听觉脑干反应记录
在 图4 中，参考电极在两个不同位置之间进行了调整，但仍获得了可比的听觉脑干反应（ABR）记录。在同一动物上，使用两种参考电极位置记录的75 dBSPL短声刺激波形对比显示，波峰到波谷的波形幅度以及波形峰值潜伏期差异极小（图4A）。乳突位置的放置方法学上类似于哺乳动物ABR实验中将参考电极置于乳突或耳廓的做法。如果需要对任一侧耳进行操作或手术，将参考电极置于颈部位置则更具优势。有趣的是，乳突放置（红色波形）的II波峰值幅度出现时间比颈部放置（黑色波形）晚1 ms。这一时间差异可能反映了ABR神经发生部位相对于电极放置位置的空间关系。

采用双通道设置，使用一个有源记录电极（头顶位置）和两个参考电极（乳突位置），分别记录左耳和右耳的听觉脑干反应（ABR）（图4B）。两耳之间的反应相似，仅在波峰振幅上存在微小差异，这可能是由于耳机放置位置所致。左右耳反应潜伏期相等，表明雏鸡双耳及脑干半球功能均正常健康。该双通道记录布局也可用于双耳ABR记录，但此类记录需考虑更多额外因素。

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图1：雏鸡对点击和音调诱发刺激的代表性记录。 (A) 不同刺激强度下孵出后2天（P2）雏鸡的代表性听觉脑干反应（ABR）记录。以微伏为单位的3至4个正向波峰（µV刺激开始后6毫秒内（时间 = 0毫秒）即可识别出波形。波形采用罗马数字进行标识。随着刺激强度降低，峰-谷振幅减小。B) 代表性波形图中所示的I波和III波的潜伏期-强度函数A）。仅分析了这些峰，因为Wave II通常在这些强度下无法观察到 <45 dBSPL。C) 啼声诱发的ABR峰潜伏期（n = 43只雏鸡）。误差线表示均值的标准误（SEM）。(D) 四只雏鸡在三种不同频率下的平均声调诱发听性脑干反应（ABR）（黑色迹线）。红色迹线 = 平均值的标准误（SEM）。刺激强度 = 75 dBSPL。本图及后续图中，误差棒表示标准误，右耳为刺激耳。（例外情况除外 图4B 双耳均受到刺激的情况下）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图2体温对听性脑干反应记录的影响 (A) 孵化后雏鸡（P2）在不同体温条件下的代表性听觉脑干反应（ABR）记录。在较低体温下，波形峰值潜伏期延长，而峰-谷振幅相对保持不变。B) 代表性波形中显示的波I和波III的潜伏期-温度函数A). (C5只雏鸡的群体数据，显示潜伏期与温度变化之间的关系（p < 0.01, R2 = 0.89）。Waves II 和 III 也呈现出类似的趋势（数据未显示）。 请点击此处以查看此图的放大版本。

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图3：听性脑干反应（ABR）记录中的年龄相关差异。（A）代表性雏鸡在P2期（黑色迹线）和P1期（孵化后<3小时，红色迹线）的代表性听性脑干反应（ABR）记录（重叠显示）。（B）波I、II和III的波峰潜伏期随年龄的变化。波I-III的潜伏期在不同年龄间差异显著（P < 0.05，n = 6只雏鸡）。（C）波I、II和III的峰-谷波形振幅随年龄的变化。请点击此处查看该图的放大版本。

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图4：电极放置位置及双通道听性脑干反应（ABR）记录：（A）来自同一只孵化后雏鸡（P2）的代表性ABR记录（重叠显示），参考电极分别置于颈部（黑色轨迹）或乳突部位（红色轨迹）。两种电极记录方式下，引导电极均置于颅骨中线位置。两种条件下的I波和III波潜伏期及波幅几乎相同；而II波在参考电极置于颈部组织时潜伏期更短，且波幅更大。（B）在依次刺激右耳和左耳时进行双通道记录。来自同一只孵化后雏鸡（P2）的代表性ABR记录（重叠显示），参考电极分别置于左耳乳突（蓝色轨迹）和右耳乳突（红色轨迹），在三个不同刺激强度水平下的记录结果。请点击此处查看该图的放大版本。

补充表格： 雏鸡校准表。 请点击此处下载该表格。

讨论

鸟类的听觉脑干已被广泛研究，许多结构与哺乳动物的听觉通路相似。听觉神经向两个一级中枢核团——巨细胞耳蜗核（NM）和角状耳蜗核（NA）提供兴奋性输入。NM将其兴奋性投射双侧传递至其听觉靶区——层状核（NL）7。NL继而投射至中脑外侧丘系核背侧部（MLd）40,41。NL还投射至上橄榄核（SON），后者向NM、NA和NL提供反馈性抑制42。这一下部听觉脑干微环路在功能上高度保守，主要负责声音定位和双耳听觉33。鸟类听觉脑干的上部区域也包含与哺乳动物脑干中的外侧丘系和下丘相对应的核团。鉴于这些相似性，所有脊椎动物的听觉脑干反应（ABR）在到达中脑听觉区之前的组成具有可比性。

尽管多种鸟类在刺激开始后的6毫秒内均表现出三个正向波峰，但听觉脑干反应（ABR）波峰与中枢听觉结构之间的对应关系仍存在一定的变异性。波I可合理地被认为是来自外周基底乳头和听神经的首个神经反应，在个体间表现出较小的变异性（图1C）。后续波峰的识别则不确定性较高，且可能因物种而异。Kuokkanen等人17最近确定，仓鸮ABR的波III由核外侧丘系（NL）产生；因此，可以合理推断波II起源于耳蜗核的核耳蜗腹侧核（NM）和核角状体（NA）20。然而，仓鸮的波III被定义为刺激开始后3毫秒时产生的正向波峰，这与雏鸡ABR中所定义的波II相对应。在仓鸮的ABR中，波I和波II合并出现。

虽然雏鸡通常在6毫秒内表现出三个波峰，但偶尔也能观察到第四个波峰（例如参见图1A）。要支持存在第四个波峰，甚至在某些情况下的五波雏鸡听觉脑干反应（ABR），还需更多群体数据、更大的样本量以及额外的实验范式。最一致的发现是此处所示的三个波峰表现。

由于听性脑干反应（ABR）被定义为神经同步性的测量指标，听觉通路中的主要核团可能分别对应ABR中的各个正向波峰。信号从听神经传递至核耳蜗神经核（NM/NA），再传至核外侧丘系（NL），这一过程可能分别定义了雏鸡ABR中的I波、II波和III波。此外，稍后出现的鸡ABR第四个波峰可能代表上脑干或中脑的听觉结构。对鸟类ABR的表征还应考虑早成鸟与晚成鸟之间的差异。听觉反应的成熟过程在不同物种间存在差异，并受到其他关键特征的影响，例如捕食行为和/或发声学习4。尽管如此，所描述的方法和技术可轻松应用于多种鸟类及脊椎动物物种。

动物体温维持的重要性如图2所示。随着体内温度降低，相同刺激强度下听觉脑干反应（ABR）的潜伏期延长。当体温降至32 °C以下时，这一现象更为显著36,37。此处观察到的ABR潜伏期大约延长1 ms，小于此前在鸡中报道的结果23。然而，Katayama23使用的是12日龄雏鸡，并在4小时内对其进行降温后再复温处理。图2中的数据则是在20分钟的降温过程中采集的。为了获得最佳质量和最稳定的记录，必须维持动物的体温，并确保所有动物均在相同的生理温度下进行记录。

年龄对听性脑干反应（ABR）的影响虽轻微但需予以重视。尽管仅有ABR的I波和II波潜伏期存在显著差异，但这部分是由于图3中仅使用了三只年幼的雏鸡；其余三只雏鸡未能记录到三个可识别的ABR波峰。若采用较大的样本量或比较频率特异性的ABR，也可能观察到ABR振幅和阈值的变化。这种与年龄相关的影响可能是由于鸡中耳内存在液体所致。此类传导性改变可导致人及其他哺乳动物模型的ABR阈值显著升高38,39。

采用两种不同的记录导联，观察到相似的反应（图4A）。尽管最常用的导联方式是将参考电极置于接收刺激耳后方，但在伴随听觉脑干反应（ABR）进行外科干预时，将参考电极置于颈部组织可能更为实用。然而，若采用双通道ABR记录，则参考电极应分别对称放置，而将参考电极置于颈部时难以实现这一点。因此，建议将参考电极置于乳突位置，以尽可能标准化记录的各个方面。双通道ABR记录是一种有效的工具，所需额外准备较少，且可获得两耳之间相似的反应。微小的波幅差异可能源于耳机的位置。双通道记录便于实验操作耳或脑半球与对照侧之间的直接比较。该设置也适用于双耳ABR的检测。未来使用鸡ABR的研究可参考既往文献中关于记录配置和导联方式的描述34。

该方法学确实存在若干局限性。如步骤5.1中所述，窥耳器放置不当可能导致反应出现40 dBSPL的偏移，这可能造成对经处理或基因修饰动物的错误判断。建议采取以下预防措施：在获取经处理或突变动物的听觉脑干反应（ABR）之前，先采集大量对照组数据；两次记录之间的刺激强度递减不应超过20 dBSPL；若发现波幅或潜伏期的变化超出预期，应检查动物状态及窥耳器位置，并重复该ABR刺激以观察变化。若发现窥耳器发生移位，需重新获取此前的测试结果。另一局限性在于ABR的校准。若未进行适当的校准以记录声压级，则施加给动物的实际刺激强度将不明确。在测量声输出时，应使用与实验记录相同的窥耳器，并将小型麦克风置于一个长度近似动物耳道（约5 mm）的空腔内。应测量实验中所用的相同纯音频率，因为校准具有频率特异性。硬件和软件系统的使用手册通常会提供校准操作指南。此外，还可使用其他滤波器，例如线性相位滤波器和最小相位滤波器，这些滤波器可改善点击声和短音脉冲ABR43 ，但本研究中未使用此类滤波器。另外，诸如短音脉冲频谱包络的上升和下降时间随频率变化，或改变点击刺激的上升和下降时间等因素也未在本研究中考察。这些均可作为未来研究方向，前提是已能够稳定、可靠地获取ABR信号。

将刚孵化的雏鸡与其他鸟类模型进行比较具有前景。虎皮鹦鹉和东部鸣角鸮在听性脑干反应（ABR）的前6毫秒内也表现出三个正向微伏峰13,22。在不同种类的啄木鸟中同样可观察到三个波峰，但其潜伏期较晚。此外，啄木鸟最敏感频率范围在1500至4000 Hz之间，略高于鸡在1000 Hz时的最佳阈值。成年鸡的最佳敏感频率为2000 Hz35，因此随着雏鸡发育为成体，其对高频声音的听觉能力可能有所提升。这种听觉发育在不同鸟类物种之间会有所差异，需考虑动物属于晚成性或早成性发育类型4。

本文所述的实验方法有助于确定导致听觉反应和听觉阈值受损或改变的因素，并可用于研究胚胎发育不同阶段的相关问题。基因操作、衰老和噪声暴露均为动物及其他鸟类模型中已知的干预手段24,25,44,45。随着in-ovo电穿孔等技术的发展，现已能够在听觉脑干的一侧实现特定时空控制下的蛋白表达12,46，因此应将这些方法拓展至鸡模型。这使得可通过双通道记录范式，直接比较经基因操作耳与对侧对照耳的听性脑干反应（ABR）。

总体而言，雏鸡听性脑干反应（ABR）是一种有用的研究方法，其测量方式与人类及其他哺乳动物模型的听力功能检测几乎完全相同。此外，它还是一种非侵入性的活体（in-vivo）检测方法。除了麻醉注射和皮下电极植入几毫米外，无需其他物理操作。理论上，只要饲养在适宜环境中，同一雏鸡可在数天或数周的发育过程中接受多次测试。本实验方案不仅详细阐述了雏鸡ABR检测所必需的操作步骤和记录参数，还提出了鸟类ABR的一些特征，可为听觉脑干功能的进一步研究提供参考依据。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院/国家耳聋与其他沟通障碍研究所 R01 DC017167 项目支持

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1/8 英寸 B&K 传声器Brüel & Kjær4138型号 4138-A-015 同样适用
听觉诱发电位通用智能盒Intelligent Hearing SystemsM011110
定制隔音室GK Soundbooth IncN/A定制构建
直流电源CSI/SpecoPSV-5
ER3 插入式耳机Intelligent Hearing SystemsM015302用作声音换能器
戊巴比妥钠溶液（Euthasol）Virbac710101管制药品；用于安乐死的溶液
胰岛素注射器（29 G）Comfort Point26028
氯胺酮（Ketamine）Covetrus11695-0703-1管制药品
电源装置Powervar93051-55R
直肠探头YSI401 (10-09010)任何 400 系列探头均可与 YSI 温度监测仪配合使用
皮下针电极RhythmlinkRLSND107-1.5
温度监测仪YSI73ATA 7651可与任何 400 系列直肠探头配合使用
赛拉嗪（Xylazine）Anased59399-110-20与氯胺酮和水合用作为麻醉剂

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雏鸡听觉脑干反应的评估
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