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基于半导体的下一代测序平台上进行非整倍体植入前遗传学检测

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DOI：

10.3791/63493

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2022年8月17日

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1Centre for Women, Children, and Reproduction, Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research, 2Department of Biopharmaceutics, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Chinese PLA General Hospital, 4Clinical Laboratory, Northern Theater Air Force Hospital, 5Guangzhou Darui Reproduction Technology Co., Ltd.

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案介绍了在基于半导体的下一代测序平台上进行胚胎植入前非整倍体遗传学检测所需的全部实验室操作流程。本文详细阐述了全基因组扩增、DNA片段筛选、文库构建、模板制备及测序工作流程的各个步骤，并展示了代表性结果。

摘要

下一代测序技术在临床应用中对遗传变异的检测日益重要。在胚胎植入前遗传学检测中，该技术在可扩展性、通量和成本方面具有独特优势。对于胚胎植入前非整倍体分析的遗传学检测，本文所介绍的基于半导体的下一代测序（NGS）系统可提供一种全面的方法，以最低8 Mb的分辨率检测结构遗传变异。从样本采集到最终报告，整个工作流程包含多个步骤，需严格遵循操作规范。由于多个关键步骤可能影响扩增结果、文库质量、测序读长的覆盖度以及数据输出，因此除文字描述外，辅以可视化操作演示可更详细地呈现实验操作细节，从而对所有关键步骤的结果产生重要影响。本文所述方法将展示活检获得的滋养层（TE）细胞全基因组扩增（WGA）、基因组文库构建、测序仪管理，以及最终生成拷贝数变异报告的完整流程。

引言

非整倍体是指染色体数目异常，表现为多出一条或数条染色体，或缺失一条或数条染色体。携带某种类型非整倍体的胚胎可能存活至出生并伴有出生缺陷，例如缺失一条X染色体（特纳综合征）、常染色体额外拷贝，如21号常染色体三体（唐氏综合征）、13号常染色体三体（帕陶综合征）和18号常染色体三体（爱德华氏综合征），或性染色体额外拷贝，如47, XXY（克兰费尔特综合征）和47, XXX（三X综合征）。1非整倍体是导致孕早期流产的主要原因 体外 体外受精（IVF）失败2据报道，在试管婴儿技术中，自然周期和药物控制组的不同年龄层中，非整倍体率可能在25.4%至84.5%之间。3.

下一代测序技术正被广泛应用于临床遗传信息的检测；该技术高效、高通量，为基因组序列的获取提供了切实可行的途径。特别是，下一代测序技术还彻底改变了具有遗传因素疾病的诊断方式，并实现了对基因组异常的检测4采用半导体测序技术，将测序生物反应中的化学信号直接转化为数字数据，基于半导体的测序系统可在3–7小时内实现对序列数据的直接、实时检测5,6.

在体外....

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方案

本研究中使用的所有方案及滋养外胚层（TE）活检（1.1.1.1 节）均于2017年9月18日经第924医院人类研究伦理委员会审查并批准（编号：PLA924-2017-59）。患者/参与者已签署书面知情同意书，同意参加本研究。

1. 人类胚胎活检样本的DNA提取与全基因组扩增

  1. 全基因组扩增方案9,10
    注意：使用 Pico PLEX WGA 试剂盒进行全基因组扩增。
    1. 样本采集与保存
      1. 滋养层活检：在对第5至第6天胚胎进行辅助孵化后，从突出的滋养外胚层（TE）中平均抽取六至九个细胞，以获得足量DNA用于后续扩增。
      2. 将样本细胞转移至含有5 µL PBS的PCR管中。
      3. 如果该实验方案未直接进入DNA提取步骤，则需将样品立即在-80 °C下冷冻。
    2. 细胞裂解
      注意： 补充文件 1 列出了在进行1、8、16和32个样本批次的细胞裂解及全基因组扩增时，配制主混合液所需各组分的推荐体积，并作为参考（包含额外余量以容纳移液误差）。在配制本方案中的其他主混合液时，还需额外增加各组分的体积，以补偿因重复移液造成的消....

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结果

当测序程序在仪器运行结束后完成时，测序服务器系统会报告生成数据的摘要信息，包括数据的描述性信息、芯片状态、ISP加载率以及文库质量，如图2所示。在本结果示例中，总共获得了17.6 G的碱基数据，芯片所有孔中的ISP总体加载率为88%；热图显示样本在芯片的整个区域上分布均匀（图2A）。在一次代表性运行中，共获得99,761,079条总读长，其中77%为可用读长；在所有加载了ISP的孔中，100%含有富集的模板，其中78%为克隆性模板。在所有克隆性模板中，97%被认定为合格的最终文库（图2B）。读长的平均长度分别为117 bp（均值）、176 bp（中位数）和174 bp（众数）（图2C）。模板适配子区域中T、C和A的峰值计数约为76，超过50的合格阈值线（图2D）。在所有含有活性ISP的可寻址孔中，99.5%被认定为构建合格的文库，而20%的多.......

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讨论

胚胎染色体非整倍性是自然受孕或辅助生殖技术受孕中导致大量妊娠丢失的原因 体外 受精（IVF）。在IVF的临床实践中，建议通过筛查胚胎非整倍体并移植整倍体胚胎以提高IVF的结局。荧光 原位 杂交是最早用于性别选择和胚胎植入前遗传学检测-非整倍体（PGT-A）的技术；然而，该技术对实验室人员的技术水平要求较高，且相对费时费力。近年来，采用荧光检测的PGT-A研究日益增多 原位 杂交技术显示对活产率无改善17,18.

然而，随着技术的快速发展，植入前遗传学检测中的拷贝数分析已取得显著进展；不同方法各有优缺点。新开发的综合性分子技术，如定量荧光PCR、单核苷酸多态性（SNP）芯片、微阵列比较基因组杂交（aCGH）以及下一代测序，在改善体外受精（IVF）结局方面展现出良好前景7。在这些技术中，尽管下一代测序（NGS）具有可扩展性强、通量更高、更易于自动化以及进一步降低成本的潜.......

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢张勇明博士和侯荣基先生对实验室信息管理系统（LIMS）扩展应用提出的建议。本研究由中国人民解放军计划生育专项研究项目（17JS008，20JSZ08）、广西代谢性疾病研究重点实验室基金（编号：20-065-76）以及广州市市民健康科技研究项目（201803010034）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.45 μm 注射器滤器单元MerkmilliporeMillex-HV
1.5 mL DNA LoBind 管Eppendorf30108051
15 mL 管Greiner Bio-One188261
2.0 mL DNA LoBind 管Eppendorf30108078
50 mL 管Greiner Bio-One227261
5x Anstart Taq 缓冲液（含 Mg2+）FAPON
 Anstart Tap DNA 聚合酶FAPON
AMPure XP 试剂（用于 DNA 结合的磁珠）BeckmanA63881https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881
细胞裂解缓冲液南方医科大学含有 40 mM Tris（pH 8）、100 mM NaCl、2 mM EDTA、1 mM 乙二醇四乙酸（EGTA）、1%（v/v）Triton X-100、5 mM 焦磷酸钠、2 mM β-甘油磷酸钠、0.1% SDS 的细胞裂解缓冲液
ClinVarNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
DNA 洗脱缓冲液NEBT1016L
dNTPVazymeP031-AA
DynaMag-2 磁力架Life Technologies12321D
乙醇广州化学试剂厂 Thermo Fisher Scientifichttp://www.chemicalreagent.com/
自主开发的全基因组扩增试剂南方医科大学试剂包含以下组分：
1. 细胞裂解
2. 扩增预混液
    1) 引物 WGA-P2（10 μM）
    2) dNTP（10 mM）
    3) 5x Anstart Taq 缓冲液（含 Mg2+）
3. 扩增酶
    1) Anstart Tap DNA 聚合酶（5 U/μL）
Ion PI Hi-Q OT2 200 试剂盒Thermo Fisher ScientificA26434步骤 4.2.8 中提到的试剂盒
Ion PI Hi-Q 测序 200 试剂盒  Thermo Fisher ScientificA26433
Ion Proton 系统Life Technologies4476610
Ion Reporter 服务器系统Life Technologies4487118
异丙醇广州化学试剂厂http://www.chemicalreagent.com/
文库制备试剂盒达安基因有限公司114https://www.daangene.com/pt/certificate.html
NaOHSigma-AldrichS5881-1KG
无核酸酶水Life TechnologiesAM9932
引物 Oligo WGA-P2生工生物5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN
NNNNATGTGG-3'
OneTouch 2 系统Life Technologies4474779 模板扩增与富集系统
PCR 管AxygenPCR-02D-C
PicoPLEX WGA 试剂盒Takara Bio USAR300671
移液器吸头Quality Scientific Productshttps://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
便携式迷你离心机 LX-300麒麟比尔E0122
Qubit 3.0 荧光计Life TechnologiesQ33216荧光计
Qubit 检测管Life TechnologiesQ32856
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒Life TechnologiesQ32851
测序仪服务器系统Thermo Fisher ScientificTorrent Suite 软件
通用测序反应试剂盒达安基因有限公司113https://www.daangene.com/pt/certificate.html
本试剂盒包含以下组分：
1. 模板制备试剂盒套装

1.1 模板制备试剂盒：
乳液 PCR 缓冲液
乳液 PCR 酶混合液
模板载体溶液

1.2 模板制备溶液：
模板制备反应油 I
破乳液 II
模板制备反应油 II
无核酸酶水
Tween 溶液
脱乳化溶液 I
模板洗涤液
C1 磁珠洗涤液
C1 磁珠重悬液
模板重悬液

1.3 模板制备材料：
试剂管 I
连接器
收集管
试剂管移液器 I
扩增板
8 孔条
专用吸头
模板制备洗涤适配器
模板制备滤器

2. 测序试剂盒套装

2.1 测序试剂盒：
dGTP
dCTP
dATP
dTTP
测序酶溶液
测序引物
质控模板

2.2 测序溶液： 
测序溶液 II
测序溶液 IIII
退火缓冲液
上样缓冲液
起泡剂
氯片
C1 磁珠

2.3 测序材料：
试剂管 II
试剂管盖
试剂管吸液管 II 
试剂瓶吸液管
试剂瓶

3. 芯片
氢氧化钠溶液Sigma72068-100ML
热循环仪Life Technologies4375786

参考文献

  1. Driscoll, D. A., Gross, S. Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).
  2. Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics....

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DNA

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