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基于半导体的下一代测序平台上进行非整倍体植入前遗传学检测

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DOI：

10.3791/63493

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2022年8月17日

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1Centre for Women, Children, and Reproduction, Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research, 2Department of Biopharmaceutics, School of Laboratory Medicine and Biotechnology, Southern Medical University, 3Department of Obstetrics and Gynecology, Chinese PLA General Hospital, 4Clinical Laboratory, Northern Theater Air Force Hospital, 5Guangzhou Darui Reproduction Technology Co., Ltd.

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案介绍了在基于半导体的下一代测序平台上进行胚胎植入前非整倍体遗传学检测所需的全部实验室操作流程。本文详细阐述了全基因组扩增、DNA片段筛选、文库构建、模板制备及测序工作流程的各个步骤，并展示了代表性结果。

摘要

下一代测序技术在临床应用中对遗传变异的检测日益重要。在胚胎植入前遗传学检测中，该技术在可扩展性、通量和成本方面具有独特优势。对于胚胎植入前非整倍体分析的遗传学检测，本文所介绍的基于半导体的下一代测序（NGS）系统可提供一种全面的方法，以最低8 Mb的分辨率检测结构遗传变异。从样本采集到最终报告，整个工作流程包含多个步骤，需严格遵循操作规范。由于多个关键步骤可能影响扩增结果、文库质量、测序读长的覆盖度以及数据输出，因此除文字描述外，辅以可视化操作演示可更详细地呈现实验操作细节，从而对所有关键步骤的结果产生重要影响。本文所述方法将展示活检获得的滋养层（TE）细胞全基因组扩增（WGA）、基因组文库构建、测序仪管理，以及最终生成拷贝数变异报告的完整流程。

引言

非整倍体是指染色体数目异常，表现为多出一条或数条染色体，或缺失一条或数条染色体。携带某种类型非整倍体的胚胎可能存活至出生并伴有出生缺陷，例如缺失一条X染色体（特纳综合征）、常染色体额外拷贝，如21号常染色体三体（唐氏综合征）、13号常染色体三体（帕陶综合征）和18号常染色体三体（爱德华氏综合征），或性染色体额外拷贝，如47, XXY（克兰费尔特综合征）和47, XXX（三X综合征）。1非整倍体是导致孕早期流产的主要原因 体外 体外受精（IVF）失败2据报道，在试管婴儿技术中，自然周期和药物控制组的不同年龄层中，非整倍体率可能在25.4%至84.5%之间。3.

下一代测序技术正被广泛应用于临床遗传信息的检测；该技术高效、高通量，为基因组序列的获取提供了切实可行的途径。特别是，下一代测序技术还彻底改变了具有遗传因素疾病的诊断方式，并实现了对基因组异常的检测4采用半导体测序技术，将测序生物反应中的化学信号直接转化为数字数据，基于半导体的测序系统可在3–7小时内实现对序列数据的直接、实时检测5,6.

在体外受精（IVF）过程中，胚胎植入前遗传学检测（PGT）可在胚胎移植入子宫前分析其遗传特征，以提高IVF成功率并降低新生儿遗传性疾病的风险1,7。在结合高通量测序（NGS）技术的PGT中，从少于10个细胞中提取的遗传物质使用全基因组扩增试剂盒或自行研发的全基因组扩增试剂进行扩增。该过程在扩增阶段仅需一步反应，无需预扩增，即可获得全基因组扩增产物。随后在构建的文库中设计并应用针对拷贝数变异及特定基因位点测序的引物或探针 panel。

在下一代测序（NGS）中，胚胎植入前遗传学检测-非整倍体（PGT-A）的典型工作流程涉及一系列连续步骤，需要实验室人员投入大量工作量8。某些操作失误导致的流程回退可能会造成实验室时间和资源的不必要损失。制定简洁明了的标准操作程序（SOP）对PGS-NGS工作流程具有帮助作用；然而，纯文字格式的方案无法充分展示样本处理、设备操作及仪器设置等方面的详细信息，而这些内容可通过视频方案直观呈现。本文所述经验证的工作流程结合操作细节的可视化演示，可为基于半导体测序平台的PGT实践提供更直接、更直观的参考方案。

本方案描述了一种可同时批量处理多达16个胚胎活检样本的方法。对于更大规模的批次，建议使用基于商用试剂盒的半导体测序方案，例如 Reproes-PGS。

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方案

本研究中使用的所有方案及滋养外胚层（TE）活检（1.1.1.1 节）均于2017年9月18日经第924医院人类研究伦理委员会审查并批准（编号：PLA924-2017-59）。患者/参与者已签署书面知情同意书，同意参加本研究。

1. 人类胚胎活检样本的DNA提取与全基因组扩增

  1. 全基因组扩增方案9,10
    注意：使用 Pico PLEX WGA 试剂盒进行全基因组扩增。
    1. 样本采集与保存
      1. 滋养层活检：在对第5至第6天胚胎进行辅助孵化后，从突出的滋养外胚层（TE）中平均抽取六至九个细胞，以获得足量DNA用于后续扩增。
      2. 将样本细胞转移至含有5 µL PBS的PCR管中。
      3. 如果该实验方案未直接进入DNA提取步骤，则需将样品立即在-80 °C下冷冻。
    2. 细胞裂解
      注意： 补充文件 1 列出了在进行1、8、16和32个样本批次的细胞裂解及全基因组扩增时，配制主混合液所需各组分的推荐体积，并作为参考（包含额外余量以容纳移液误差）。在配制本方案中的其他主混合液时，还需额外增加各组分的体积，以补偿因重复移液造成的消耗。所有短暂离心操作均在台式小型离心机上于室温（RT）进行，转速固定为10,000 RPM，离心力为5,300 × g，持续2–10秒。 g. 离心力必须在 2,000 x g 和 12,000 x g.
      1. 每份样品使用4.8 µL提取酶稀释缓冲液和0.2 µL细胞提取酶配制细胞裂解混合液。
      2. 将5 µL新配制的细胞裂解液加入PCR管中每个5 µL的细胞样品中，室温下短暂离心5秒。切勿涡旋振荡。
      3. 将样品放入热循环仪中孵育，程序如下：75 °C孵育10分钟；95 °C孵育4分钟；25 °C孵育14分钟。孵育结束后，短暂离心（5秒）反应管。
    3. 全基因组DNA预扩增
      1. 每份样品使用4.8 µL预扩增缓冲液和0.2 µL预扩增酶配制预扩增混合液。
      2. 用移液器将5 µL预扩增混合液沿管壁加入样本管中，短暂离心3秒。移液枪头避免触及管底，且不要涡旋振荡管子。
      3. 根据热循环仪程序中提到的条件孵育样品 表1.
    4. 全基因组DNA扩增
      1. 短暂离心样品5秒，将预扩增孵育产物置于冰上。
      2. 每份样本使用25 µL扩增缓冲液、0.8 µL扩增酶和34.2 µL无核酸酶水配制全基因组扩增混合液。
      3. 将60 µL新配制的全基因组扩增混合液与15 µL预扩增孵育产物混合，总体积需为75 µL。短暂离心5秒。移液时避免枪头触及管底，且不要涡旋振荡管子。
      4. 将PCR管置于热循环仪中，并运行前述的热循环仪程序 表 2.
      5. 短暂离心管子5秒，然后将产物转移至新的1.5 mL离心管中。
      6. 使用荧光计定量WGA产物浓度11样品若不立即进行下一步操作，可在 -20°C 下临时保存不超过 2 个月。
  2. 独立开发的WGA试剂方案
    1. 样本采集与保存
      1. 从经过辅助孵化的D5/6胚胎中抽取细胞用于后续扩增。
      2. 将样本细胞与1.5 µL PBS转移至含有2 µL PBS的PCR管中。
        注意：PBS 不含 Mg2+ 和 Ca2+.
      3. 若不立即进行DNA提取实验，应将样品立即在-80 °C下冷冻保存。
    2. 细胞裂解
      1. 将细胞裂解缓冲液（40 mM Tris (pH 8)、100 mM NaCl、2 mM EDTA、1 mM 乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸（EGTA）、1% (v/v) Triton X-100、5 mM 焦磷酸钠、2 mM β-甘油磷酸钠、0.1% SDS）在室温下融化后置于冰上。向每个样本中加入 2 µL 细胞裂解缓冲液，短暂离心（5 s）。
        注意：不要涡旋振荡离心管，避免移液器吸头接触管内液面，以防将细胞或DNA带出反应体系。
      2. 将样品放入热循环仪中孵育，程序如下：55 °C孵育20 min；95 °C孵育10 min；4 °C保存。孵育结束后，在室温下短暂离心试管10 s。
    3. 全基因组DNA扩增
      1. 短暂离心细胞裂解产物5秒，然后置于冰上。
      2. 为每个样本配制全基因组扩增混合液：加入16 µL扩增预混液、1 µL扩增酶和28 µL无核酸酶水。轻轻混匀，短暂离心（5 s），并将混合液置于冰上。切勿涡旋振荡离心管。
      3. 将45 µL新配制的全基因组扩增混合液加入1.2.2.2步骤制备的细胞裂解产物中；轻轻混匀，短暂离心5秒。
        注意：不要涡旋振荡试管，避免移液器吸头接触管内的液体。
      4. 将PCR管置于热循环仪上，并按照所述程序运行 表3.
      5. 短暂离心管子5秒，然后将产物转移至新的1.5 mL离心管中。
      6. 使用荧光计定量WGA产物浓度11 并在质量分析（QA）表上记录结果。若未立即进行下一步操作，浓度合格的产品可在 -20 °C 临时保存，保存时间不超过 2 个月。

2. 扩增片段选择

注意：本节使用的材料见文库制备试剂盒（材料表）。

  1. 开始前的准备工作
    1. 将用于纯化的磁珠（n × 100 µL）在室温下平衡 30 分钟。
    2. 将之前的全基因组扩增（WGA）产物恢复至室温。在室温下涡旋震荡 30 秒，然后短暂离心。
    3. 配制新鲜的 70% 乙醇。
  2. 片段筛选步骤
    1. 用移液器吸取 25 µL WGA 产物，转移至预装有 25 µL 无核酸酶水的 1.5 mL 离心管中。
    2. 充分涡旋混匀 DNA 纯化磁珠。每份样品管中加入 50 µL 磁珠（原始样品体积∶磁珠体积 = 1∶1），涡旋混匀后短暂离心（5 秒）。将离心管置于室温下静置 5 分钟，以完成 DNA 结合过程。
    3. 将 1.5 mL 离心管插入磁力架中，等待 直至所有磁珠被吸附至管壁一侧。小心地将上清液转移至新的 1.5 mL 离心管中，避免吸出磁珠。
    4. 根据原始样品体积，加入 30 µL 磁珠（原始样品体积∶磁珠体积 = 1∶0.6），涡旋混匀后短暂离心（5 秒）。将离心管置于室温下静置 5 分钟，以完成 DNA 结合过程。
    5. 将 1.5 mL 离心管重新插入磁力架中，静置 5 分钟，直至所有磁珠被吸附至管壁一侧。小心吸除并弃去上清液，避免吸出磁珠。
    6. 向 1.5 mL 离心管中加入 300 µL 70% 乙醇，轻轻旋转管体 180° 角度两次，使磁珠沿管壁移动以实现充分洗涤。随后吸出并弃去上清液，避免吸出磁珠。
    7. 重复洗涤步骤一次。
    8. 将 1.5 mL 离心管从磁力架中取出，短暂离心（5 秒）。再将离心管放回磁力架中，等待直至所有磁珠被吸附至管壁一侧。
    9. 小心吸出管底残留液体。保持管盖打开，在室温下干燥磁珠 3–5 分钟，避免磁珠受潮。
      注意：若磁珠沉淀出现裂纹，应立即盖上管盖。
    10. 将离心管从磁力架中取出，向管中加入 25–30 µL DNA 洗脱缓冲液，盖紧管盖并涡旋混匀。短暂离心（5 秒）使浑浊液体沉至管底，室温静置 5 分钟。
    11. 将离心管重新插入磁力架中，等待直至所有磁珠被吸附至管壁一侧，且上清液变为透明。小心地将 DNA 溶液转移至新的 1.5 mL 离心管中，避免吸出磁珠。
    12. 使用荧光计11,测定片段筛选后 DNA 的浓度，并于 -20°C 保存。通常，筛选后的 DNA 片段浓度范围为 1.5–2.4 ng/µL。

3. DNA文库的制备12

注意：本节所用材料见文库制备试剂盒（材料表）。

  1. 末端修复
    1. 将磁珠在室温下平衡 30 分钟。
    2. 将步骤 2.2.12 中片段筛选得到的 DNA 产物平衡至室温。检查并记录每个含有 DNA 的小管上的标签。
    3. 在 1.5 mL 离心管中，用 30 µL DNA 产物、10 µL 末端修复缓冲液、0.5 µL 末端修复酶和 9.5 µL 无核酸酶水配制 DNA 末端修复体系。涡旋混匀 30 秒，短暂离心（5 秒）使所有液体沉至管底。
    4. 在 25 °C 下孵育 30 分钟，孵育后短暂离心（5 秒）。
    5. 涡旋或颠倒混匀磁珠，取 75 µL 磁珠加入含有末端修复后 DNA 样品的离心管中（原始样品体积:磁珠体积 = 1:1.5）。用移液器吹打或轻微涡旋充分混匀磁珠，短暂离心（5 秒）使悬浮液全部沉至管底。室温静置 5 分钟以完成 DNA 结合过程。轻柔翻转离心管以保持磁珠均匀分散。
    6. 将离心管插入磁力架中，静置 5 分钟，直至所有磁珠被吸附至管壁一侧，上清液变得透明。小心吸除上清液，避免吸出磁珠，吸液过程中保持离心管始终置于磁力架上。
    7. 向离心管中加入 300 µL 新配制的 70% 乙醇，轻轻旋转离心管 180° 角两次，使磁珠沿管壁移动以充分洗涤。用移液器吸出并弃去上清液，避免吸出磁珠。
    8. 重复洗涤步骤一次。
    9. 将 1.5 mL 离心管从磁力架中取出，短暂离心（5 秒）。再将离心管放回磁力架中，静置 5 分钟，直至所有磁珠被吸附至管壁一侧。
    10. 小心吸出底部残留液体。打开 1.5 mL 离心管盖，在室温下干燥磁珠 3–5 分钟。避免水分接触磁珠。
      注意：若磁珠沉淀表面出现裂纹，应立即盖上管盖。
    11. 向离心管中加入 33 µL DNA 洗脱缓冲液，盖紧管盖并涡旋混匀。短暂离心（5 秒）使浑浊悬液沉至管底，室温静置 5 分钟。
    12. 将离心管重新插入磁力架中，静置至所有磁珠被吸附至管壁一侧，溶液变为透明。小心将 DNA 溶液转移至带有正确标签的新 1.5 mL 离心管中，避免吸出磁珠。
  2. 接头连接（加标签）
    1. 将步骤 3.2.2 中的接头连接试剂置于冰上，使其完全融化。
    2. 在 1.5 mL 离心管中，加入 32 µL 末端修复后的 DNA 产物、10 µL 无核酸酶水、5 µL 连接酶缓冲液、1 µL 连接酶和 1 µL P1 接头，配制连接反应体系。为每个样品向该混合液中加入 1 µL 对应的标签试剂，涡旋 5 秒，短暂离心（5 秒）使所有液体沉至管底。
      注意：添加标签时，需确认标签数量与样品数量一致；每次仅打开一个标签试剂管，避免标签交叉污染；每添加 5–6 个标签后更换手套。
    3. 将离心管在 25 °C 下孵育 30 分钟。
    4. 向离心管中加入 75 µL 磁珠（原始样品体积:磁珠体积 = 1:1.5），用移液器吹打或轻微涡旋充分混匀。短暂离心（5 秒）使所有悬液沉至管底，避免磁珠聚集。室温静置 5 分钟以完成 DNA 结合过程。轻柔翻转离心管以保持磁珠均匀分散。
    5. 将离心管插入磁力架中，静置 5 分钟，直至所有磁珠被吸附至管壁一侧，上清液变得透明。小心吸除上清液，避免吸出磁珠，吸液过程中保持离心管始终置于磁力架上。
    6. 向离心管中加入 300 µL 新配制的 70% 乙醇，轻轻旋转离心管 180° 角两次，使磁珠沿管壁移动以充分洗涤。用移液器吸出并弃去上清液，避免吸出磁珠。
    7. 重复洗涤步骤一次。
    8. 将 1.5 mL 离心管从磁力架中取出，短暂离心（5 秒）。再将离心管放回磁力架中，静置 5 分钟，直至所有磁珠被吸附至管壁一侧。小心吸出底部残留的上清液。
    9. 保持管盖打开，在室温下干燥磁珠 3–5 分钟。避免水分接触磁珠。
      注意：若磁珠沉淀表面出现裂纹，应立即盖上管盖。
    10. 向离心管中加入 15 µL DNA 洗脱缓冲液。冲洗磁珠沉淀至管底，盖紧管盖并涡旋混匀。短暂离心（5 秒）使浑浊悬液沉至管底，室温静置 5 分钟。
  3. 片段扩增
    1. 当冷冻试剂完全融化后，将文库构建试剂置于冰上备用。
    2. 向含有洗脱后 DNA 和磁珠的离心管中加入 47.5 µL 酶混合液和 2.5 µL 引物混合液，涡旋 5 秒，短暂离心（5 秒）使所有液体沉至管底。
    3. 室温静置 5 分钟。将离心管重新插入磁力架中，静置至所有磁珠被吸附至管壁一侧，上清液变为透明。小心将 DNA 溶液转移至已明确标记标签的 0.2 mL PCR 管中，避免吸出磁珠。
    4. 将样品放入预设以下程序的 PCR 仪中进行扩增：72°C 20 分钟；98 °C 2 分钟；98 °C 15 秒；62 °C 15 秒；70 °C 1 分钟（6 个循环）；70 °C 5 分钟。反应结束后短暂离心（5 秒），并将产物保存于 4 °C。
    5. 将 PCR 产物转移至 1.5 mL 低吸附离心管中。反应结束后，加入 97.5 µL 磁珠（原始样品体积:磁珠体积 = 1:1.5），用移液器吹打或轻微涡旋充分混匀，短暂离心（5 秒）使所有液体沉至管底。避免磁珠聚集。室温静置 5 分钟。轻柔翻转离心管以保持磁珠均匀分散。
    6. 将离心管插入磁力架中，静置 5 分钟，直至所有磁珠被吸附至管壁一侧，上清液变得透明。小心吸除上清液，避免吸出磁珠，保持离心管稳定置于磁力架上。
    7. 向离心管中加入 300 µL 新配制的 70% 乙醇，轻轻旋转离心管 180° 角两次，使磁珠沿管壁移动以充分洗涤。用移液器吸出并弃去上清液，避免吸出磁珠。
    8. 重复洗涤步骤一次。
    9. 将 1.5 mL 离心管从磁力架中取出，短暂离心（5 秒）。再将离心管放回磁力架中，静置 5 分钟，直至所有磁珠被吸附至管壁一侧。小心吸出底部残留液体。
    10. 保持管盖打开，在室温下干燥磁珠 3–5 分钟。避免水分接触磁珠。
      注意：若磁珠沉淀表面出现裂纹，应立即盖上管盖。
    11. 向离心管中加入 22 µL DNA 洗脱缓冲液，冲洗磁珠沉淀，盖紧管盖并涡旋混匀。短暂离心（5 秒）使浑浊液体沉至管底，室温静置 5 分钟。
    12. 使用荧光计11测定所构建 DNA 文库的浓度，并将文库储存于 -20 °C；所选 DNA 片段的浓度范围为 0.6–10 ng/µL。在文库数据库中重新编码文库信息，并按要求储存样品。

4. 测序模板的制备13,14

注意：本节所用材料包含在测序反应通用试剂盒的模板制备试剂套装（试剂/溶液/材料）中（材料表）。

  1. 文库混合
    1. 在服务器系统中填写预运行记录表，并在样本管上标记文库浓度和条形码编号。一次运行中避免在不同样本上使用相同的条形码。
    2. 涡旋混匀文库样本，短暂离心（5 秒）。用无核酸酶水将所有样本稀释至 100 pM，涡旋 30 秒，然后短暂离心样本。
      注意：假设 DNA 平均长度为 260 bp，且 1 bp 为 660 g/mol，可使用以下公式计算 ng/µL 转换为 pM：1 ng/µL = 5,827.5 pM/L。
    3. 用移液器吸取 10 µL 100 pM 稀释后的文库至 1.5 mL 离心管中，涡旋 30 秒，短暂离心 2 秒。将混合文库置于冰上保存。
  2. 模板制备
    1. 启动模板扩增系统并选择清洗程序。向管中加入反应油至 1/2 体积，加入破乳液至 1/3 体积。
    2. 确认扩增板和清洗适配器处于 ON 位置。清空废液瓶，并将针头插入新的 50 mL 离心管以收集废液。在模板扩增系统屏幕上确认已处理的步骤。按下 NEXT 启动清洗程序，该程序约需 15 分钟。
    3. 清洗程序结束后，更换新的扩增板，将含有 150 µL 破乳液 II 的收集管插入转子中，并在收集管上放置桥接装置。向管中加入反应油至 1/2 体积，加入破乳液至 1/3 体积。
    4. 乳液 PCR 试剂制备：将乳液 PCR 缓冲液在室温下平衡至完全溶解，短暂离心（5 秒）所有试剂，使用前置于冰上。
    5. 向含有 2,000 µL 乳液 PCR 缓冲液的管中加入 120 µL 乳液 PCR 酶混合液、100 µL 模板 Ion Sphere Particle (ISPs) 缓冲液、170.5 µL 无核酸酶水和 9.5 µL 混合文库（100 pM）。通过反复移液充分混匀溶液。
      注意：混合溶液必须在 15 分钟内加载至模板扩增系统；所有操作均在室温下进行。
    6. 将用于模板制备的新滤膜平稳放置于试管架上，样品入口朝上。涡旋溶液 5 秒，短暂离心（5 秒），然后通过反复移液 800 µL 三次，将溶液转移至滤膜的样品入口。在最后一次注入前离心试管以减少气泡。避免将空气注入滤膜。在混合溶液后注入 200 µL 反应油 II。
    7. 将滤膜的样品入口朝下，用滤膜替换清洗适配器。将样品针插入转子盖的中心孔，然后将针压到底部。
    8. 在屏幕上按下 RUN 按钮，根据相应的试剂盒选择程序，按下 ASSISTED 检查所有步骤。持续按下 NEXT 直至运行开始；整个过程约需 4.5 小时完成。
    9. 程序结束后按下 NEXT ，系统将启动 10 分钟离心。离心停止后，按下 Open Lid 按钮，将收集管移至试管架。如果 15 分钟内未进入下一步，请点击 Final Spin 重新离心。
    10. 去除收集管中的上清液，保留管内 100 µL 溶液。通过移液混匀剩余样本，并将样本转移至标记为 OT（One touch 2 系统）的新 1.5 mL 离心管中。
      注意：移取上清液时，避免沿管壁触碰管底。
    11. 向每个收集管中加入 100 µL 无核酸酶水，并通过反复移液将溶液转移至已清洗的 OT 管中。向 OT 管中加入 600 µL 无核酸酶水，使总体积达到 1 mL，涡旋 30 秒，并在 15,500 x g 下离心 8 分钟。
    12. 轻轻去除 OT 管中的上清液，保留 100 µL，用枪头彻底去除油层。加入 900 µL 无核酸酶水，涡旋 30 秒，并在 15,500 x g 下离心 8 分钟。
    13. 去除上清液至剩余 20 µL，加入模板重悬液使体积达到 100 µL，涡旋 30 秒，短暂离心 2 秒。
      注意：此步骤获得的溶液必须在 12 小时内进入下一步。
    14. 关闭电源前，在模板扩增系统上运行清洗程序。
  3. 模板富集
    1. 用 280 µL Tween-80 和 40 µL 1 M NaOH 配制熔解混合液。
    2. 清洗 C1 磁珠。涡旋 C1 磁珠溶液 30 秒。将 100 µL 磁珠转移至 1.5 mL 离心管中，将管置于磁力架上 2 分钟，弃去上清液。
    3. 向管中加入 1 mL C1 磁珠洗涤液，涡旋 30 秒。短暂离心（5 秒），将管插入磁力架 2 分钟，弃去上清液。向管中加入 130 µL C1 磁珠重悬液，通过反复移液混匀磁珠。避免产生气泡。
    4. 向八联管中加入 100 µL 稀释文库、130 µL C1 磁珠、300 µL × 3 模板洗涤液和 300 µL 熔解液，如 图 1 所示。
    5. 将八联管安装至富集模块，装载移液吸头，并将 200 µL 离心管置于收集位置。按下 START 运行程序；约需 35 分钟。
    6. 样本将自动收集至 200 µL 离心管中；盖紧管盖并在 15,500 x g 下离心 5 分钟。检查管底以确认是否残留 C1 磁珠。
    7. 若残留 C1 磁珠，反复移液模板溶液 10 次，并将管置于磁力架上 4 分钟。将所有上清液转移至新的 0.2 mL 离心管中，并在 15,500 x g 下离心 5 分钟。
    8. 若无可见 C1 磁珠残留，弃去上清液至剩余 10 µL，加入 200 µL 无核酸酶水，通过 10 次移液混匀。在 15,500 x g 下离心 5 分钟。
    9. 弃去上清液，保留 10 µL，加入 90 µL 无核酸酶水使总体积达到 100 µL。上下移液 10 次混匀溶液，涡旋 5 秒，短暂离心（5 秒）。该溶液可在 2–8 °C 下保存不超过 3 天。

5. 下一代测序9,15

注意：本节所有操作均在 DA8600 测序平台中进行。本节所用材料见测序反应通用试剂盒中的测序试剂套装（试剂/溶液/材料）（材料表）。

  1. 检查运行测序平台所需的所有试剂和材料。
    1. 测序试剂：检查测序酶溶液（6 µL）、测序引物（20 µL）、质控模板（5 µL）以及 dGTP/dCTP/dATP/dTTP（70 µL）是否齐备，储存温度为 -30 至 10 °C。
    2. 测序溶液：检查测序溶液 II（100 mL）、测序溶液 III（50 mL）、退火缓冲液（1,015 µL）、上样缓冲液（10 µL）、消泡剂（2 µL）、氯片（1 片）和链霉亲和素磁珠（100 µL）是否齐备，储存温度为 4 °C。
    3. 材料：检查 250 mL 试剂管（8 个）、250 试剂管盖（8 个）、sipper II（8 个）、sipper（1 个）、2 L 试剂瓶（1 个）和测序芯片（1 个）是否齐备，室温储存。
  2. 使用前清洗芯片。
    1. 将一个芯片稳定放置于工作板上，向样品孔中注入 100 µL 无核酸酶水，从出口端移除溶液，并重复该操作。
    2. 向芯片中注入 100 µL 0.1 M NaOH 溶液，在室温下孵育 1 分钟。
    3. 向样品孔中注入 100 µL 异丙醇，从出口端移除多余溶液，再次重复该操作。
    4. 用滤纸覆盖出口端，通入氮气以干燥芯片流路中的残留异丙醇，并将准备好的芯片置于室温保存备用。
  3. 测序仪启动
    1. 打开氮气阀并将压力调节至 30 psi。启动测序仪，在主屏幕上点击 清洁（CLEAN），根据情况选择水或氯溶液进行仪器清洗。
      注：每次运行前用清水清洗，每周或仪器携带试剂待机超过 48 小时时使用氯溶液清洗。
    2. 氯溶液清洗：选择一个专用于氯溶液清洗的试剂瓶，用 18 MΩ 水清洗该瓶两次，然后加入 1 L 18 MΩ 水。向瓶中放入一片氯片，溶解 10 分钟后加入 1 mL 1 M NaOH，倒置瓶子混合溶液。配制后 3 小时内使用该氯溶液。
    3. 用 0.45 µm 滤膜过滤 100 mL 氯溶液，并用两个试管收集滤液。将两个氯溶液试管分别安装至 C1 和 C2 位置。在主屏幕上点击 清洁（CLEAN），并安装用于氯溶液清洗的芯片。
    4. 点击 下一步（NEXT），确认屏幕上所有步骤以启动清洗程序；程序将在 30 分钟内结束。氯溶液清洗完成后，开始进行清水清洗。
    5. 清水清洗：将两个专用于清水清洗的试管标记为 C1 和 C2，用 18 MΩ 水各清洗两次。向每个清水清洗试管中加入 100 mL 18 MΩ 水，并分别放置于 C1 和 C2 位置。
    6. 选择 清洁（CLEAN） 程序，安装用于清水清洗的芯片，点击 下一步（NEXT），然后确认屏幕上所有步骤以启动清洗程序。
  4. 初始化
    1. 用清洗溶液 II 清洗清洗瓶，标记为 W2，并用 18 MΩ 水清洗三次。
    2. 用吸水纸清洁氮气管，将其插入管底，调节气流至 0.5 L/min。排出瓶内氧气后，加入 1,920 mL 18 MΩ 水。向瓶中加入测序溶液 II 和 10 µL 1 M NaOH，盖紧瓶盖后多次倒置混匀溶液。
    3. 将两个新试管分别标记为 W1 和 W3。向 W1 中加入 32 µL 1 M NaOH，向 W3 中加入 40–50 mL 1× 测序溶液 III，并盖紧管盖。
      注：首次使用时，1× 测序溶液 III 需在 37 °C 水浴中预热 30 分钟。测序溶液 II 需避光保存于室温。清洗瓶使用 20 次后必须更换为新瓶。
    4. 在主屏幕上点击 初始化（INITIALIZE），更换 W1、W2 和 W3 位置的吸液头，将各试管正确放置于对应位置，并通过旋转拧紧密封。安装用于初始化的芯片，并检查仪器状态参数。
    5. 点击 下一步（NEXT） 以启动初始化程序；第一阶段耗时约 40 分钟。
      注：更换新的吸液头前必须更换手套，以防污染吸液头本体。用于清水清洗和初始化的芯片可再次用于初始化，但不得将用于氯溶液清洗的芯片用于初始化。
    6. 将 dGTP、dCTP、dATP 和 dTTP 置于冰上溶解，并涡旋混匀。标记四个新试管为 G、C、A 和 T，根据标签用移液器分别加入 70 µL 溶液。
  5. 准备文库用于测序运行。
    1. 将质控模板、引物和酶溶液置于冰上。
    2. 当初始化程序剩余约 20 分钟时开始准备 DNA 文库。将质控模板涡旋 30 秒混匀，短暂离心 2 秒。将 5 µL 质控模板转移至模板溶液中，涡旋 5 秒，然后以 15,500 x g 离心 5 分钟。小心移除上清液，避免触碰沉淀，管中保留约 10 µL 液体。
    3. 向管中加入 15 µL 退火缓冲液，溶液总体积为 25 µL。
    4. 当引物在冰上完全溶解后涡旋混匀，并短暂离心 2 秒。将 20 µL 测序引物加入上一步的管中，涡旋 5 秒，短暂离心 2 秒，之后于室温保存待用。
  6. 上样与测序
    1. 吸取上一步制备的样品溶液 55 µL，注入芯片的样品孔中。
    2. 将芯片置于离心机中；缺口朝外，样品入口朝内，用另一个已使用过的芯片配平，离心 10 分钟。
    3. 准备上样溶液。
      1. 在 1.5 mL 离心管中混合 0.5 mL 退火缓冲液和 0.5 mL 无核酸酶水。标记为 50% 退火缓冲液，7 天内使用。
      2. 混合 0.5 mL 异丙醇溶液和 0.5 mL 退火缓冲液。标记为 50% 清洗缓冲液，24 小时内使用。
      3. 混合 6 µL 测序酶和 60 µL 50% 退火缓冲液。标记为酶反应缓冲液，配制后置于冰上。
      4. 混合 49 µL 50% 退火缓冲液和 1 µL 消泡剂，标记为消泡溶液。
    4. 向消泡溶液中吹入 100 µL 空气，反复移液直至气泡呈密集泡沫状，保持泡沫体积约为 250 µL。
    5. 离心后将芯片置于实验台，向样品孔中注入 100 µL 泡沫，从出口端移除挤出的液体。将芯片重新放回离心机，短暂离心 30 秒。
    6. 重复步骤 5.6.4–5.6.5。
    7. 注入 100 µL 50% 清洗缓冲液两次，每次注入后从出口端移除挤出的液体。
    8. 注入 100 µL 50% 退火缓冲液三次，每次注入后从出口端移除挤出的液体。
    9. 注入 65 µL 50% 酶反应缓冲液，避免产生气泡，并从出口端移除挤出的液体。
    10. 将上样完成的芯片在室温下稳定 5 分钟，然后安装至测序仪芯片接口。选择第 6 步中设定的运行方案，核对信息后启动运行；运行时间约为 1.5 小时。
    11. 运行结束后 72 小时内执行清水清洗程序。若超过 72 小时，则在清水清洗前先执行氯溶液清洗。关闭测序仪，并关闭氮气阀门。

6. 在报告服务器系统中规划指定的测序运行16

注意：本节所有操作均在配备报告服务器系统的 Ion Proton 测序仪上进行。

  1. 登录服务器系统，选择 计划 选项卡，然后点击 计划模板运行。选择 全基因组 作为运行类型，并从已计划的运行模板列表中选择适当的模板。
  2. 在 计划 选项卡中，输入或进行以下选择：
    1. 根据样本批次输入新的运行计划名称，从 参考文库 下拉列表中选择 hg19 (Homo sapiens)，并在 目标区域 和 热点区域 下拉列表中均选择 无 。
    2. 输入样本集中使用的条形码数量，为每个样本从下拉列表中选择一个条形码，并输入唯一且具有描述性的名称，以便于对样本进行分组和追踪。避免使用默认的 样本 1 等名称。
    3. 在 Ion Reporter 选项卡中选择 无 ，点击 下一步，并在应用类型中选择 DNA ，目标技术选择 全基因组。
    4. 在 试剂盒 选项卡中，核对所选项目，或根据运行需求进行适当修改：
      1. 从 文库试剂盒类型 下拉列表中选择 Ion Plus 片段文库试剂盒 ；在 模板试剂盒 下拉列表中选择 Ion PI HI-Q OT2 200 试剂盒，并选择 OneTouch 作为默认选项；从 测序试剂盒 下拉列表中选择 Ion PI HI-Q 测序 200 试剂盒。
      2. 输入 300 个循环数，从 芯片类型 下拉列表中选择 Ion PITM 芯片 ，并从 条形码集 下拉列表中选择 IonXpress 。
      3. 取消勾选 标记 重复读段以及 启用重新比对 选项。
    5. 在 插件 选项卡中选择适当的插件，用于第 7 步的数据分析。完成项目步骤中的选择后，点击 下一步，然后点击右下角的 计划运行，以列出 已计划的运行。
    6. 在 已计划的运行 选项卡中，选择新创建的运行任务，并在审查窗口中核对所有设置。

7. 数据分析

  1. 使用生物信息学流程分析拷贝数变异（CNVs）。
    注意：拷贝数变异通过生物信息学流程进行分析，该流程采用基于隐马尔可夫模型（HMM）的算法17；该模型利用全基因组的测序读段覆盖度来预测拷贝数或整倍性状态（即 0、1、2、3 等）。整体生物信息学分析流程构建于序列服务器系统的插件中，如图2所示。生物信息学分析步骤平均耗时 4 小时完成。

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结果

当测序程序在仪器运行结束后完成时，测序服务器系统会报告生成数据的摘要信息，包括数据的描述性信息、芯片状态、ISP加载率以及文库质量，如图2所示。在此结果示例中，总共获得了17.6 G的碱基数据，芯片所有孔中的ISP总体加载率为88%；热图显示样本在芯片的整个区域上分布均匀（图2A）。在一次代表性运行中，共获得99,761,079条总读长，其中77%为可用读长；在所有加载了ISP的孔中，100%含有富集的模板，其中78%为克隆性模板。在所有克隆性模板中，97%被认定为合格的最终文库（图2B）。读长的平均长度分别为117 bp（均值）、176 bp（中位数）和174 bp（众数）（图2C）。模板适配子区域中T、C和A的峰值计数约为76，超过50的合格阈值线（图2D）。在所有含有活性ISP的可寻址孔中，99.5%被认定为构建合格的文库，而20%的多...

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讨论

胚胎染色体非整倍性是自然受孕或辅助生殖技术受孕中导致大量妊娠丢失的原因 体外 受精（IVF）。在IVF的临床实践中，建议通过筛查胚胎非整倍体并移植整倍体胚胎以提高IVF的结局。荧光 原位 杂交是最早用于性别选择和胚胎植入前遗传学检测-非整倍体（PGT-A）的技术；然而，该技术对实验室人员的技术水平要求较高，且相对费时费力。近年来，采用荧光检测的PGT-A研究日益增多 原位 杂交技术显示对活产率无改善17,18.

然而，随着技术的快速发展，植入前遗传学检测中的拷贝数分析已取得显著进展；不同方法各有优缺点。新开发的综合性分子技术，如定量荧光PCR、单核苷酸多态性（SNP）芯片、微阵列比较基因组杂交（aCGH）以及下一代测序，在改善体外受精（IVF）结局方面展现出良好前景7。在这些技术中，尽管下一代测序（NGS）具有可扩展性强、通量更高、更易于自动化以及进一步降低成本的潜...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢张勇明博士和侯荣基先生对实验室信息管理系统（LIMS）扩展应用提出的建议。本研究由中国人民解放军计划生育专项研究项目（17JS008，20JSZ08）、广西代谢性疾病研究重点实验室基金（编号：20-065-76）以及广州市市民健康科技研究项目（201803010034）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.45 μm 注射器滤器单元MerkmilliporeMillex-HV
1.5 mL DNA LoBind 管Eppendorf30108051
15 mL 管Greiner Bio-One188261
2.0 mL DNA LoBind 管Eppendorf30108078
50 mL 管Greiner Bio-One227261
5x Anstart Taq 缓冲液（含 Mg2+）FAPON
 Anstart Tap DNA 聚合酶FAPON
AMPure XP 试剂（用于 DNA 结合的磁珠）BeckmanA63881https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881
细胞裂解缓冲液南方医科大学含有 40 mM Tris（pH 8）、100 mM NaCl、2 mM EDTA、1 mM 乙二醇四乙酸（EGTA）、1%（v/v）Triton X-100、5 mM 焦磷酸钠、2 mM β-甘油磷酸钠、0.1% SDS 的细胞裂解缓冲液
ClinVarNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/
DNA 洗脱缓冲液NEBT1016L
dNTPVazymeP031-AA
DynaMag-2 磁力架Life Technologies12321D
乙醇广州化学试剂厂 Thermo Fisher Scientifichttp://www.chemicalreagent.com/
自主开发的全基因组扩增试剂南方医科大学试剂包含以下组分：
1. 细胞裂解
2. 扩增预混液
    1) 引物 WGA-P2（10 μM）
    2) dNTP（10 mM）
    3) 5x Anstart Taq 缓冲液（含 Mg2+）
3. 扩增酶
    1) Anstart Tap DNA 聚合酶（5 U/μL）
Ion PI Hi-Q OT2 200 试剂盒Thermo Fisher ScientificA26434步骤 4.2.8 中提到的试剂盒
Ion PI Hi-Q 测序 200 试剂盒  Thermo Fisher ScientificA26433
Ion Proton 系统Life Technologies4476610
Ion Reporter 服务器系统Life Technologies4487118
异丙醇广州化学试剂厂http://www.chemicalreagent.com/
文库制备试剂盒达安基因有限公司114https://www.daangene.com/pt/certificate.html
NaOHSigma-AldrichS5881-1KG
无核酸酶水Life TechnologiesAM9932
引物 Oligo WGA-P2生工生物5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN
NNNNATGTGG-3'
OneTouch 2 系统Life Technologies4474779 模板扩增与富集系统
PCR 管AxygenPCR-02D-C
PicoPLEX WGA 试剂盒Takara Bio USAR300671
移液器吸头Quality Scientific Productshttps://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
便携式迷你离心机 LX-300麒麟比尔E0122
Qubit 3.0 荧光计Life TechnologiesQ33216荧光计
Qubit 检测管Life TechnologiesQ32856
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒Life TechnologiesQ32851
测序仪服务器系统Thermo Fisher ScientificTorrent Suite 软件
通用测序反应试剂盒达安基因有限公司113https://www.daangene.com/pt/certificate.html
本试剂盒包含以下组分：
1. 模板制备试剂盒套装

1.1 模板制备试剂盒：
乳液 PCR 缓冲液
乳液 PCR 酶混合液
模板载体溶液

1.2 模板制备溶液：
模板制备反应油 I
破乳液 II
模板制备反应油 II
无核酸酶水
Tween 溶液
脱乳化溶液 I
模板洗涤液
C1 磁珠洗涤液
C1 磁珠重悬液
模板重悬液

1.3 模板制备材料：
试剂管 I
连接器
收集管
试剂管移液器 I
扩增板
8 孔条
专用吸头
模板制备洗涤适配器
模板制备滤器

2. 测序试剂盒套装

2.1 测序试剂盒：
dGTP
dCTP
dATP
dTTP
测序酶溶液
测序引物
质控模板

2.2 测序溶液： 
测序溶液 II
测序溶液 IIII
退火缓冲液
上样缓冲液
起泡剂
氯片
C1 磁珠

2.3 测序材料：
试剂管 II
试剂管盖
试剂管吸液管 II 
试剂瓶吸液管
试剂瓶

3. 芯片
氢氧化钠溶液Sigma72068-100ML
热循环仪Life Technologies4375786

参考文献

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  10. PicoPLEX® Single Cell WGA Kit User Manual. Takara Bio USA. , Available from: https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf (2019).
  11. Qubit® 3.0 Fluorometer User Guide, Invitrogen by Life Technologies. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf (2014).
  12. Ion AmpliSeq™ DNA and RNA Library Preparation User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf (2019).
  13. Ion OneTouch 2 System User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf (2015).
  14. Ion Pl Hi-Q OT2 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf (2017).
  15. Ion Pl Hi-Q Sequencing 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf (2017).
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