一种改良的套管法小鼠颈部异位心脏移植模型

摘要

在本实验方案中，采用小鼠心脏移植模型来研究心脏同种异体移植物排斥反应的机制。在此异位心脏移植模型中，通过改良的套管技术进行颈部端对端吻合式心脏移植，可提高手术效率，并确保心脏移植物的存活。

摘要

心脏同种异体移植物排斥反应限制了心脏移植术后患者的长期生存。由于小鼠与人类基因具有高度同源性，小鼠心脏移植模型是临床前研究中探讨心脏同种异体移植物排斥机制的理想模型。深入了解该机制将有助于开发独特策略，以改善接受心脏同种异体移植物治疗患者的长期生存率。在小鼠模型中，通常采用端对端 吻合的方式，通过缝合将供体心脏与受体的腹主动脉和下腔静脉连接。而在本模型中，采用改良套管技术，将供体心脏通过端对端吻合连接至受体的颈动脉和颈外静脉。该移植手术无需缝合，因此可能提高受体的存活率，因为不会干扰下肢的血液供应和静脉回流。该小鼠模型将有助于研究心脏同种异体移植物免疫学及病理学（急性和慢性）排斥反应的潜在机制。

引言

心脏移植已成为终末期心力衰竭的标准治疗方法。每年在全球国际心肺移植学会注册机构中进行的心脏移植手术超过5500例。在同种异体心脏移植受者中，术后1年排斥反应发生率仍>10%，而术后3年排斥反应发生率上升至36%^1,2。然而，目前尚缺乏针对心脏移植物排斥反应的有效预防性治疗手段。因此，有必要开展动物模型研究，以阐明心脏移植物免疫学与病理学排斥反应背后的生理机制。此类研究将有助于发现新的治疗靶点，推动高效药物的开发，从而预防心脏移植物排斥反应，并提高这些患者群体的生存率。

最近，在小鼠异位心脏移植模型研究中提出了一些心脏移植物排斥反应的潜在免疫学和病理生理学机制^3,4,5。因此，由于小鼠与人类基因具有高度同源性，小鼠异位心脏移植已成为研究心脏移植后心脏移植物免疫排斥和病理损伤机制的理想临床前模型。目前普遍采用的方法是在受体小鼠腹腔内通过缝合技术将供体心脏的主动脉和下腔静脉分别与受体的主动脉和下腔静脉进行端对端吻合，以模拟正常的人体解剖结构。然而，该手术方法可能干扰受体下半身的血液供应和静脉回流⁶。因此，本文提出一种改良的小鼠异位心脏移植手术方法。

采用改良套管技术，通过端对端颈部分吻合将供体心脏与受体的颈总动脉和颈静脉连接。该改良手术方法提高了操作可行性，并确保了心脏移植物的存活，同时不影响下肢的血液供应和静脉回流。

方案

所有动物实验均按照美国国家研究委员会（US）2011年发布的《实验动物护理与使用指南》（第八版）的规定进行。涉及动物实验的操作均已获得中国重庆大学附属肿瘤医院动物护理与使用委员会的批准。 实验采用来自商业来源（见材料表）的雄性BALB/c和C57BL/6小鼠，体重为20–30 g，用于同种异体心脏移植研究。C57BL/6小鼠作为供体及同基因型受体，而BALB/c小鼠则作为同种异体受体。实验方案示意图见图1。
注意： 手术过程中使用的所有物品，包括手术器械和溶液，均为无菌。手术操作遵循 无菌操作技术的原则。

1. 受体操作步骤

1. 诱导全身麻醉 通过 通过连接通风橱的15 x 10 x 10 cm诱导室吸入5%异氟烷（见 材料表).
2. 将受体小鼠固定在带有加热垫的手术台上，通过覆盖口鼻的面罩持续吸入2%异氟烷以维持麻醉状态。
   ​注意：呼吸频率和节律减慢、角膜反射消失以及脚趾屈曲反射缺失表明麻醉有效。
3. 剃除毛发后，用聚维酮碘溶液和酒精交替进行三次消毒：先用聚维酮碘擦洗，再用酒精脱碘。然后， 切开皮肤 1.5-2 厘米 从右侧下颌角平行于颈中线至尾端。
4. 使用电凝器和显微镊分离右侧颈外静脉约1厘米。用无创微血管夹夹闭近端，远端结扎。
5. 将静脉远端穿过一个22 G聚氨酯倒刺套管（参见 材料表）并带有斜面末端和浅表沟槽。使用微血管夹具夹住袖带手柄以固定血管。
6. 移除远端的8-0结扎缝线，将管腔翻转至内侧倒钩所钩住的套管上，外翻固定，并用10-0外科缝线在表面的凹槽处缝合固定。
7. 切除右侧舌下腺以形成容纳心脏移植物的窝槽，保留下颌下腺右叶及右侧胸锁乳突肌。
8. 用显微镊分离右侧颈总动脉约1厘米，在近端用无创微血管夹夹闭动脉；在远端结扎并切断动脉。
9. 将动脉远端穿过一个26 G聚氨酯带刺套管（参见 材料表）并带有斜面末端和表面凹槽。使用微血管夹具通过套管的手柄固定动脉。
10. 移除远端结扎缝线，将管腔翻转至套管外侧，并用10-0外科缝线通过浅层倒刺和凹槽固定。
11. 制备受体血管后，在血管上滴加100 IU/mL肝素化生理盐水，以防止血栓形成。用无菌湿盐水纱布覆盖颈部切口，以备后续移植使用。

2. 供体操作步骤

1. 对供体小鼠采用相同的麻醉程序（步骤 1.1）。
2. 使用电动剃刀剃除腹部毛发，并用聚维酮碘溶液和酒精交替擦拭三遍，对术区进行消毒。
3. 沿腹中线从耻骨联合至剑突下切开腹部（2–3 cm），并用牵开器扩大切口区域。
4. 使用电凝器和显微镊子游离腹主动脉和下腔静脉约 1 cm，然后通过下腔静脉注射 1 mL 含 250 IU/mL 肝素的生理盐水进行肝素化处理。随后，切除腹主动脉和下腔静脉。
5. 使用手术剪沿两侧腋前线剪开胸腔，分离胸壁。用 8-0 手术缝线结扎上腔静脉。
6. 将头皮针插入膈肌上方的下腔静脉，然后从该处注入含 100 IU/mL 肝素的冰冻生理盐水，灌注供体心脏直至血液颜色消失。
7. 使用头皮针从主动脉弓注入 2–3 mL 含 100 IU/mL 肝素的冰冻组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐（HTK）溶液（见材料表），对供体心肌进行再灌注保护。平均热缺血时间为 5 分钟。
8. 用 5-0 手术缝线结扎上腔静脉、下腔静脉 和肺静脉 。在供体主动脉和肺动脉分叉前将其游离并切断。随后，切断上腔静脉、下腔静脉 和肺静脉 ，取出供体心脏。

3. 植入

1. 将供体心脏以倒置位置植入受体小鼠的颈部皮袋中。
2. 将翻转的受体颈外静脉套入供体肺动脉腔内，完成供体肺动脉与受体颈外静脉的端对端吻合。利用套管表面的凹槽，以10-0外科缝线结扎固定吻合口。
3. 采用类似方法完成供体主动脉与受体颈总动脉的端对端吻合。
4. 依次松开颈外静脉和颈总动脉上的无创微血管夹，恢复供体心脏的血液灌注。平均冷缺血时间为15分钟。
5. 固定心脏移植物，并妥善缝合，防止移植物扭曲。
6. 使用5-0单丝聚酰胺缝线连续缝合关闭颈部切口（参见材料表）。
   注意：待伤口完全愈合后拆除缝线。 
7. 将受体小鼠置于温暖、干燥且洁净的笼内，直至其从麻醉中恢复。
   注意：恢复时间通常为5–10分钟。
8. 术后48小时内，每6小时对受体小鼠皮下注射一次布托啡诺（0.05 mg/kg），以提供镇痛。
   注意：本研究已优化镇痛剂量。然而，若根据机构动物使用指南发现动物有疼痛迹象，可延长或调整镇痛方案。  

结果

在该小鼠颈部异位心脏移植模型中，受体小鼠的存活率约为95.2%（21只小鼠中有20只存活）。主要死亡原因为术后出血。心跳快速且节律规整是移植供体心脏存活的指标。

在此模型中，C57BL/6 和 BALB/c 小鼠分别为 MHC（H-2b）和 MHC（H-2d）类型^7,8。这两种品系在 H-2 上存在差异，从而引发急性 T 细胞介导的排斥反应⁹。在所有心脏同种异体移植物中，62.5% 在移植后 7 天内因触诊无法感知心跳而判定丢失。所有心脏同种异体移植物均在移植后 8 天内完全丢失。相比之下，所有同基因型心脏移植均存活超过 4 周（图 2）。存活超过 4 周的小鼠通过吸入 CO₂ 实施安乐死。

讨论

小鼠心脏移植模型有助于研究心脏移植后的排斥反应机制，从而推动开发独特的方法以提高心脏同种异体移植物受者的长期存活率。然而，小鼠心脏移植是一项复杂且具有挑战性的操作，尤其在血管吻合方面，需要高水平的显微外科技术^11,12,13。小鼠腹部异位心脏移植模型通过将供体主动脉和肺动脉分别与受体主动脉和下腔静脉进行缝合吻合来完成。在此手术过程中，需要阻断受体的主动脉和下腔静脉，因此可能导致受体小鼠下半身缺血以及下腔静脉血栓形成，增加其致残率和死亡率。为了降低移植过程中血管吻合的难度，Matsuura 等人于1991年首次引入了采用套管技术的小鼠颈部心脏移植模型¹⁴。该模型通过套管结扎实现血管外翻的套袖样吻合，提高了吻合效率。与腹部心脏移植模型中使用缝线进行血管吻合相比，该方法降低了术后出血的发生概率。因此，吻合效率的提升缩短了心肌缺血时间，提高了心脏移植物的存活率。此外，与腹部移植相比，供体心脏的颈部植入不会中断受体...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-0 聚酰胺单丝缝合线	B.Braun Medical Inc.	C3090954
8-0 聚酰胺单丝缝合线	B.Braun Medical Inc.	C2090880
10-0 聚酰胺单丝缝合线	B.Braun Medical Inc.	G0090781
22 G 聚氨酯套管	B.Braun Medical Inc.	4251628-02
26 G 聚氨酯套管	苏州林华医疗器械有限公司	REF383713
麻醉诱导舱	瑞沃德生命科学有限公司	V100
无创微血管夹	碧云天	FS500
BALB/c 和 C57BL/6 小鼠（20–30 g）	陆军军医大学实验动物中心（中国重庆）
丁丙诺啡	US Biological Life Sciences	352004
电凝器	广州润迈医疗设备有限公司	ZJ1099
纱布	河南飘安集团有限公司	10210402
加热垫	广州德威生物科技有限公司	DK0032
肝素	华北制药股份有限公司	2101131-2
HTK 溶液	深圳长盈医药有限公司	YZB/闽8263-2013
注射器（10 mL）	山东威高集团医用高分子制品股份有限公司	20211001
异氟烷	瑞沃德生命科学有限公司	21070201
生理盐水	西南药业股份有限公司	H50021610
头皮针	宏宇医疗集团	20183150210
剃毛器	碧云天	FS600
小动物麻醉机	瑞沃德生命科学有限公司	R500
手术显微镜	北京天诺翔仪器有限公司	SZX-6745
棉签	渝北医疗器械材料有限公司	21080274