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小型猪视网膜下植入携带视网膜色素上皮细胞的载体：术前准备、手术技术及术后护理指南

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DOI：

10.3791/63505

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2022年11月11日

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1Eye Clinic, Department of Ophthalmology, University Hospital Giessen and Marburg GmbH, 2Karl Landsteiner Institute for Retinal Research and Imaging, 3Department of Ophthalmology, University Hospital Kralovske Vinohrady and Third Faculty of Medicine, Charles University in Prague, 4Institute of Macromolecular Chemistry, Czech Academy of Sciences, 5Institute of Animal Physiology and Genetics, Czech Academy of Sciences, 6Department of Cell Biology, Faculty of Science, Charles University, 7Institute of Experimental Medicine, Czech Academy of Sciences, 8Center for Eye Research, Department of Ophthalmology, Oslo University Hospital and Institute of Clinical Medicine, Faculty of Medicine, University of Oslo, 9Moorfields Eye Hospitals UAE, 10Stem Cell Therapies in Neurodegenerative Diseases Lab, Research Center “Principe Felipe”, 11Eye Center Donaustadt, Department of Ophthalmology, Sigmund Freud University

* These authors contributed equally

本文内容

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摘要

视网膜色素上皮（RPE）的视网膜下植入是治疗退行性视网膜疾病最有前景的方法之一。然而，在大眼动物模型上开展临床前研究仍具有挑战性。本报告提供了将RPE细胞搭载于细胞载体上进行视网膜下移植至小型猪的实验操作指南。

摘要

视网膜变性疾病（包括年龄相关性黄斑变性）主要起源于视网膜色素上皮（RPE）层或该层内部，导致视网膜解剖结构进行性紊乱以及视功能衰退。用健康的视网膜色素上皮细胞（RPEs）替代受损的RPE细胞 体外 使用视网膜下细胞载体移植培养的视网膜色素上皮（RPE）细胞已显示出重建外层视网膜结构解剖形态的潜力，因此正被进一步研究。本文介绍了将携带培养RPE细胞的细胞载体有效移植至小型猪视网膜下的外科手术技术原理。手术在全身麻醉下进行，包括标准的保留晶状体的三通道睫状体平坦部玻璃体切除术（PPV）、视网膜下注射平衡盐溶液（BSS）、2.7 mm视网膜切开、通过额外的3.0 mm巩膜切口将纳米纤维细胞载体植入视网膜下腔、液-气交换（FAX）、硅油填充以及所有巩膜切口的闭合。在过去8年中，该手术方法共实施29次（18只动物），成功率为93.1%。通过以下方式对手术植入位置进行解剖学验证： 体内 眼底成像（眼底照相和光学相干断层扫描）。在小型猪眼中进行载体携带的视网膜色素上皮细胞视网膜下植入的推荐手术步骤，可为未来使用大眼动物模型的临床前研究提供参考。

引言

年龄相关性黄斑变性（AMD）被认为是发达国家中心视力丧失的主要原因，也是多种与视网膜色素上皮（RPE）功能障碍相关疾病中的一种1,2视网膜色素上皮（RPE）位于基底侧的布鲁赫膜（BM）上，为光感受器提供必要的支持与维护。RPE层的进行性退变是早期萎缩型年龄相关性黄斑变性（AMD）的典型特征，同时也伴随晚期渗出型AMD的发展过程。尽管视网膜疾病治疗已取得诸多进展，但开发有效的治疗手段仍面临挑战。3一种有前景的方法是使用RPE替代 体外 培养的RPE层。该治疗与利用人胚胎干细胞来源的RPE（hESC-RPE）和诱导多能干细胞来源的RPE（iPSC-RPE）进行的干细胞研究进展密切相关3,4,5,6,7近年来，许多研究团队致力于开发视网膜色素上皮（RPE）替代的不同方法，并初步获得了概念验证的认可8,9,10,11,12,13,14,15RPE细胞（RPEs）通常以细胞悬液、自支撑的细胞片层或由人工载体支撑的细胞单层形式递送至视网膜下腔3,16,17,18,19,20,21注射细胞悬液是最简单的方法，但骨髓的受损状态常常会阻碍移植细胞的附着，这可能导致视网膜色素上皮细胞（RPEs）的顶-基底极性排列异常，并无法形成单层结构。22,23另外两种方法（即自支撑细胞片和由人工基质支撑的细胞单层）的主要优势在于，细胞在被直接植入视网膜下腔时已处于分化的单层状态。24.

近年来，已有多种外科技术被报道用于将细胞载体递送至视网膜下腔8,9,10,11,12,13,14,15。这些研究描述了大眼动物模型的应用、细胞载体的类型、移植细胞培养物的使用、植入器械以及手术技术，作者主要关注视网膜下植入的结果。2015年，Popelka等人报道了使用支架支撑的超薄电纺聚合物膜将视网膜色素上皮细胞（RPE）移植到猪的尸体眼中的方法8。本文所述的视网膜下植入细胞载体的手术技术，可相对精确地操控载体，并便于支架在视网膜下腔中的定位。Kozak等人评估了在猪眼中递送尺寸约为2 mm × 5 mm载体的技术可行性9。该细胞载体的独特设计使其能够正确放置，防止细胞单层发生折叠和皱缩6。Al-Nawaiseh等人首次提出了在兔眼中进行视网膜下支架植入的详细分步操作指南25。Stanzel等人随后于2019年发表了一项类似的方案，适用于小型啮齿类动物、兔、猪和非人灵长类动物的移植26。如先前报道，与其它递送技术相比，将已分化且具有极性的RPE单层细胞移植到固体载体上，可显著提高移植物的存活率并促进其更好地整合（补充文件1）27。

任何临床前动物研究的目的 体内 旨在揭示经玻璃体视网膜下植入细胞载体手术的各个方面，重点关注手术安全性、移植细胞的存活情况、视网膜下操作引起的组织反应以及术后短期和长期的结局。已有研究报道，使用猪眼作为大眼动物模型所获得的数据具有相关性，这些数据可能对人类具有参考价值和潜在应用意义10,11,14本研究报道了用于手术的技术 体内 大眼动物模型中细胞载体的视网膜下植入。我们基于过去8年的经验，详细描述了术前准备、视网膜下细胞载体植入的手术技术以及小型猪眼部的术后护理。我们阐述了可用于该手术的基本外科原则 在体内 涉及不同类型细胞及细胞载体植入的实验研究。

大型动物模型
Liběchov 小型猪实验猪群最初于1967年从美国引进 Hormel 品系的五只动物建立。这些动物为开展猪血型研究，与多个其他品种或品系进行了杂交：长白猪、大白猪、康沃尔猪、越南猪以及哥廷根来源的微型猪28,29。小型猪在约5月龄、体重（BW）约20 kg时达到性成熟。亲本小型猪品系（Hormel 和 Göttingen）的寿命据报道为12至20年。细胞载体的视网膜下植入靶向视网膜中央区域。小型猪的视网膜缺乏黄斑和中央凹，但具有高密度的视锥感光细胞聚集区，称为中央区（area centralis）和视网膜条带（visual streaks）30,31。这些区域负责最敏锐的视觉功能。

手术由四位经验丰富的玻璃体视网膜外科医生在一位经验丰富的手术室技术助理（TA）的协助下完成。在进行体内实验之前，外科医生接受了专门培训，掌握了小型猪眼球解剖结构的相关知识，例如晶状体与玻璃体容积比较低、眼轴长度较短（15–19 mm）、角膜中无 Bowman 膜、玻璃体容积较小（2.8–3.2 mL）、缺乏黄斑和中央凹、无 Zinn 环以及视盘直径（垂直/水平：1.5 mm/2.1 mm）。所有手术均在全身麻醉下进行，手术场所为专门设置的手术室，并严格执行标准的无菌和抗菌措施。

方案

本研究遵循《赫尔辛基宣言》的准则以及涉及人类受试者的医学研究的伦理原则。所有实验均按照《实验动物护理和使用指南》以及视觉与眼科研究协会（ARVO）关于在眼科和视觉研究中使用动物的准则进行。研究方案已获得捷克科学院动物生理学与遗传学研究所（捷克共和国利贝霍夫）动物实验项目批准委员会的批准（批准方案编号：60/2016 和 64/2019）。

1. 向小型猪视网膜下移植细胞-载体复合物时的注意事项

  1. 动物选择
    1. 选用12至36月龄的Liběchov小型猪，性别不限，体重约40-80 kg。
    2. 将小型猪饲养于室内空调动物房中，室温控制在18-22 °C，采用13小时光照/11小时黑暗的人工光照周期，配备标准化单体圈舍，自由饮水，每日饲喂两次。
  2. 术前准备
    1. 确认眼部手术的方位并绘制眼底示意图。具体操作为：使用笔在眼底图上以垂直线将小型猪视网膜划分为颞侧（从视盘朝向耳部）、鼻侧（从视盘朝向猪吻部）和中央区域（位于鼻侧主要视网膜血管之间）（图1A，B）。
    2. 仅选择行为和神经系统无异常、皮肤、体孔、粪便及摄食情况均正常的健康动物。由经验丰富的兽医进行临床观察并完成动物筛选。
    3. 于手术当日以3 mg/kg体重（BW）剂量肌肉注射盐酸头孢噻呋（1 mL/kg）。
  3. 术前免疫抑制
    1. 参照Wang等和Sevc等文献32，33所述方法并加以改进，制备他克莫司缓释聚合物微球。
    2. 通过高效液相色谱法（HPLC）测定，确保聚合物微球中他克莫司浓度为51.3 mg/g（材料表）。
    3. 于眼部手术前6天，以0.25 mg/kg体重（BW）剂量皮下注射负载他克莫司的聚合物微球，以防止细胞移植物排斥反应。此步骤旨在确保人源视网膜色素上皮（RPE）供体细胞在异种移植至小型猪眼内时的存活。
    4. 于手术当日根据体重肌肉注射80 mg Depo-Medrol及苄青霉素（1 mL/10 kg）。
  4. 麻醉
    1. 术前通过肌肉注射给予tiletamine（2 mg/kg）、zolazepam（2 mg/kg）、ketamine（2 mg/kg）和xylazine（0.4 mg/kg）的混合制剂（TKX34，35）以诱导全身麻醉。通过意识丧失状态以及检测后肢趾间皮肤夹捏反射、角膜反射（轻触角膜）、瞳孔对光反射和眼睑反射来评估麻醉深度。确保动物无眨眼反应，并确认心率和呼吸节律正常。
    2. 麻醉诱导后，将动物置于转运推车上送至手术室（图2A）。
    3. 将动物左侧卧位置于手术台上，以便对右眼进行手术（图2B）。
    4. 使用泡沫垫调整动物头部位置，使中央视网膜处于最适宜植入的位置（即水平且与地面平行）（图2C）。
    5. 在结膜囊内滴入0.5%盐酸丙帕他卡因滴眼液，每分钟一次，共三次，以实现局部麻醉。
    6. 插入静脉留置针，并使用配备患者监护仪的麻醉机经气管插管进行吸入维持麻醉（1.5%异氟烷）（图2A，B）。
    7. 于眼部手术开始前约15分钟，肌肉注射Eficur 1 mL/16 kg体重（BW）及Depo-Medrol 20 mg（材料表）。
    8. 用保温箔包裹动物以维持生理体温，并按第3节所述进行手术操作。
    9. 术中通过耳夹式探头连接患者监护仪，持续监测动物体温、心率及血氧饱和度。操作过程中应避免体温降至38 °C以下，此为公认的安全下限36。整个实验期间维持血氧饱和度（>96%）和脉搏率（70-90次/分钟）稳定。
    10. 手术结束后关闭异氟烷气流并拔除气管插管。
    11. 待动物自主呼吸恢复并清醒后，将其转移回圈舍。
  5. 手术室布置
    1. 根据大眼动物模型眼部手术的需求布置手术室（图3A，B）。根据猪吻部位置，调节外科医生座椅高度及显微镜高度，以确保手术操作的舒适性。

视网膜视野图；视野测量、眼球结构、鼻侧-颞侧方向。
图 1：小型猪视网膜区域的示意图。 （A）小型猪头部与视网膜区域关系的示意图；黄色椭圆表示理想的视网膜下植入区域，T 代表颞侧视网膜区域，N 代表鼻侧视网膜区域。（B）通过视网膜切开术（红色）将细胞载体（黄色）植入视网膜下腔后眼底示意图的示例。 请点击此处查看该图的放大版本。

猪眼手术；麻醉设置；显示视网膜对齐的术中示意图。
图 2：动物的转运与体位安置。 （A）将镇静后的动物转运至手术室。（B）动物在插管期间的体位安置。（C）调整动物头部位置，以在手术期间实现对中央视网膜的最佳操作通路（红色箭头）。请点击此处查看该图的放大版本。

手术显微镜使用示意图；眼科手术方法；医疗操作可视化。
图3：标准手术室布局。（A）手术人员位置示意图（S = 主刀医生，A = 助手），显示与手术台（上方为小型猪）、手术显微镜（OM）、玻璃体切除仪（VM）、器械台（IT）以及麻醉机（AM）的相对位置关系。玻璃体切除仪有两种可能的摆放位置（黄色和灰色）。（B）手术室内实际布置情况。请点击此处查看该图的高清版本。

2. 细胞载体、培养的细胞培养物及植入注射器

  1. 细胞载体
    1. 使用飞秒激光从厚度为36 µm的双向拉伸聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）薄膜上切割出外径为1.7 mm × 4.8 mm、宽30 µm的椭圆形框架，该框架上带有非对称分布的三角形凸起（图4A）。
    2. 将聚（L-乳酸-co-DL-乳酸）（LLA/DLLA 90/10，MW 868,270 g/mol）溶于吡啶中，配制成浓度为11 wt%的聚合物溶液，并每克溶液加入2.2 µL甲酸。
    3. 通过三步电纺丝法将上述聚合物溶液制备成带有嵌入式支撑框架的纳米纤维膜（图4B）8：（1）在硅基底上沉积第一层纳米纤维，（2）将框架放置于该层之上，（3）再沉积第二层纳米纤维。
      注：每层沉积7分钟，以获得总厚度为3.7 µm的膜。采用以下参数制备纤维直径为380 nm、平均孔径为0.4 µm、孔隙率约为70%的膜37：20 G全钢针头，电压7.1 kV，间距10 cm，流速250 µL/min，温度25.0 °C ± 0.5 °C。
    4. 小心地将带有嵌入框架的膜从硅基底上取下，并固定至商用12孔细胞培养小室的主体上（去除原有膜），以便进行细胞接种和生长。
    5. 在接种细胞前，将纳米纤维膜置于等离子清洗仪中，在70 W功率下进行空气等离子体处理30秒。
  2. 用于细胞载体上培养的细胞系
    注：可使用以下几种细胞载体：1）不含任何细胞的纳米纤维细胞载体；2）携带原代人视网膜色素上皮细胞（hRPEs）的纳米纤维细胞载体；3）携带人诱导多能干细胞来源的RPE细胞的纳米纤维细胞载体。
    1. 原代hRPE细胞的培养
    2. 根据已报道的技术方法38，从人供体眼球中分离原代hRPE细胞。
    3. 通过酶消化视网膜30分钟获取细胞，随后将原代hRPE细胞（第0代）在添加10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培养基中培养至多2周。
    4. 当细胞培养达到融合状态后，更换为含1% FBS的培养基，并继续培养30天。
    5. 以2,000个细胞/mm2的密度将原代hRPE细胞接种至Transwell板及层粘连蛋白包被的纳米纤维细胞载体上。在含1% FBS的培养基中进一步孵育30天后，将携带原代hRPE细胞的载体用于向小型猪的视网膜下植入。
  3. 人iPSC来源的RPE细胞
    1. 使用来源于MERTK相关视网膜色素变性患者成纤维细胞的hiPSCs39，并通过CRISPR/Cas9系统对两个等位基因进行基因校正（RP1-FiPS4F1-GC2）40；同时使用来源于健康个体成纤维细胞的hiPSCs（Ctrl2-FiPS5F2）41作为对照。
    2. 按照先前报道的方法42，将上述两种hiPSC细胞系诱导并分化为RPE细胞（hiPSC-RPE）。
    3. 在含有Knockout DMEM、20% Knockout血清、0.1 mM非必需氨基酸、0.23 mM β-巯基乙醇、100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL链霉素和10 mM烟酰胺的RPE培养基中，以200,000个细胞/cm2的密度将hiPSC-RPE细胞接种于包被层粘连蛋白的纳米纤维膜细胞培养小室上，该小室带有聚（L-乳酸-co-DL-乳酸）材质的椭圆形植入框架。
    4. 每隔一天更换一次培养基，在植入前持续培养hiPSC-RPE细胞两个月，以促进其极性生长。
  4. 植入注射器
    1. 通过吹塑法将外径1.75 mm/内径1.10 mm的塑料管加工成横截面为2.8 mm × 0.8 mm的塑料毛细管。
    2. 在毛细管末端6 mm处切割出一个4 mm × 2.2 mm的装载窗口。
    3. 将塑料毛细管、硅胶手柄、钢制刀片推杆和活塞组装成注射器（图5A）。
    4. 通过装载窗口将载体装入注射器，并通过推动推杆将其释放至视网膜下腔，具体操作见步骤3.5.2（图5B）。
  5. 纳米纤维载体的制备及注射器装载
    1. 在小型塑料培养皿中加入2 mL磷酸盐缓冲液（PBS）。取出带有已制备细胞层的小室，置于半软质聚苯乙烯皿上，在光学显微镜下居中定位。使用定制改装的打孔器在显微镜下沿椭圆形框架切割出载体，其尺寸应为2 mm × 5 mm。
    2. 使用带有扁平透明管路的定制注射器进行载体装载；毛细管远端6 mm处设有用于装载的窗口。将PBS注入注射器窗口中。
    3. 使用镊子将样品从皿底释放，将其提起并转移至注射器窗口处，转移前需先观察框架上的侧面取向标记，以识别附着细胞的载体上表面。椭圆形框架有助于载体的操作。
    4. 使用牙科探针（末端尖锐的不锈钢牙科工具）将载体定位在注射器窗口内，然后用推杆将载体推入注射器封闭且安全的上部区域。随后准备用于手术。
    5. 在每一步操作中均需检查载体的取向。通过推动金属推杆将纳米纤维载体从注射器中卸出。

弹性模量测量示意图；纤维拉伸；显微视图；力学性能。
图 4：带有嵌入式支撑 PET 框架的纳米纤维载体。（A）框架上的三个可见标记可用来确定载体的侧面方向（白色箭头）。（B）细胞载体的纳米纤维膜中嵌入的 PET 框架片段的放大视图（白色箭头）。请点击此处查看该图的放大版本。

毛细管法示意图，显示柱塞、毛细管及用于样品加载的纳米纤维载体。
图 5：植入注射器。（A）注射器的组成部分。（B）带有嵌入式支撑PET框架的纳米纤维细胞载体，已装载至植入注射器的塑料矩形毛细管中。请点击此处查看该图的放大版本。

3. 手术步骤

  1. 手术器械
    1. 使用眼科手术显微镜、前段和后段眼内手术操作系统、非接触式玻璃体视网膜手术系统、激光光凝装置以及数码相机等手术设备。
      注意：玻璃体切除术、外部和内部电凝以及激光光凝设备的标准参数见表1。
  2. 手术器械
    1. 根据标准操作程序，使用便携式高压蒸汽灭菌器或类似设备对可重复使用的手术器械进行灭菌。手术中所需的一次性手术器械和材料列于材料表中。
  3. 手术步骤的准备工作
    1. 按照步骤1.4.1所述方法麻醉动物后，在手术前15分钟向结膜囊内滴加1%托吡卡胺溶液和10%盐酸去氧肾上腺素溶液，以诱导药物性散瞳。
    2. 术者位于上方位置，助手位于侧方位置，接近手术台（图3）。
    3. 使用一次性剃须刀剃除眼部周围区域的毛发，并清除粗大污物。
    4. 用5%聚维酮碘溶液对结膜囊消毒5分钟。
    5. 使用棉签从眼睑向周围区域擦拭，对眼周区域进行消毒。使用10%聚维酮碘溶液重复此过程三次，每次停留5分钟。
    6. 使用带有粘性透明薄膜的标准无菌眼科手术巾覆盖手术区域，使眼睛位于中央。将睫毛移离眼球表面。避免剪除睫毛，以降低术后眼内炎的风险。
    7. 插入眼睑撑开器（Liberman型或Cook眼撑）。可选操作：使用8-0聚乳酸羟基乙酸缝线将瞬膜固定于皮肤上。
    8. 使用手术镊和Westcott结膜剪，在鼻侧角膜缘后2 mm至3 mm处切开结膜，暴露巩膜以便进行巩膜切口。
    9. 在平坦部区域，距角膜缘2.5–3 mm处插入三阀式25 G套管针（分别置于7点、10点和11点位置）。插入时以轻微倾斜（100°–110°）的方式旋转推进，并用镊子夹持套管针（图6）。
    10. 在整个手术过程中保持角膜湿润，或涂抹甲基纤维素，以防止渗透性角膜水肿。
  4. 经平坦部玻璃体切除术（PPV）
    1. 采用标准三通道经平坦部玻璃体切除术方法，切除玻璃体中央部分。小心清除晶状体后方、未来大切口区域的玻璃体。
    2. 向玻璃体内注射2–4 mg曲安奈德乙醇溶液（50–100 µL），以染色通常仍与视网膜粘连的后部玻璃体，从而实现可控的后玻璃体脱离。
    3. 随后，使用41 G导管更靠近中心部位缓慢进行0.05–0.1 mL平衡盐溶液（BSS）的视网膜下注射，避免液体隆起向周边扩散。
    4. 在视网膜下注射期间，将灌注系统的灌注压调低至15 mmHg，以防止短暂性视网膜血管阻塞。
    5. 使用27 G内电凝探针，在靠近鼻侧液体隆起基底部3 mm处对视网膜进行线性大范围内电凝。
    6. 之后，在灌注系统将眼内压（IOP）升高至60 mmHg并维持3–5分钟的条件下，使用25 G MVR刀片或垂直剪刀制作一个3 mm大的视网膜切口。确认视网膜切口无出血后，将眼内压降至25 mmHg。
    7. 使用27 G内电凝探针，轻触巩膜表面，对距角膜缘2.5–3 mm处两个鼻侧套管针之间的巩膜上血管进行外电凝。
    8. 在扩大巩膜切口前检查输液瓶的液位，因为在巩膜切口扩大后，液体消耗量会暂时增加。
    9. 使用2.75 mm超声乳化刀，在距角膜缘3 mm处制作一个3.0 mm大的巩膜切口。
    10. 注意大巩膜切口内巩膜血管和睫状体可能发生的出血。若发生出血，使用27 G内电凝探针对受损血管进行凝固止血。使用缎面刀将巩膜切口扩大至3.0 mm，以便容纳注射器头端（0.8 mm × 2.8 mm）。
    11. 使用玻璃体切割头清除大巩膜切口处脱出的玻璃体组织。通过玻璃体切除系统维持25–30 mmHg的BSS灌注压力，以防止眼球塌陷。
  5. 细胞载体植入
    1. 用主手将注射器经大巩膜切口轻柔插入玻璃体腔。如遇阻力，可扩大巩膜切口尺寸。
    2. 通过视网膜切口将细胞载体植入视网膜下间隙。必要时可采用双手操作技术，辅以额外的巩膜切口和吊灯照明，以提高植入过程的可控性。
    3. 将注射器从眼内撤出，并使用8-0聚乳酸羟基乙酸缝线关闭大巩膜切口，以避免与眼内低压相关的并发症。
    4. 使用硅胶头导管完成完全的液-气交换（FAX）并引流视网膜下液体。
    5. 随后，通过玻璃体切除系统及硅油注射管路向玻璃体腔内注入硅油（1,000 cSt），直至眼内压恢复正常。
  6. 术中成像与记录
    1. 在整个手术过程中使用录像系统进行视频录制，并对植入关键步骤进行拍照记录。
    2. 通过眼底绘图模板记录巩膜切口、视网膜切口、视网膜下植入物的位置以及任何术中并发症，完成眼底绘图。
  7. 术后处理
    1. 手术结束时，取出套管针，并使用8-0聚乳酸羟基乙酸缝线关闭三个巩膜切口及结膜。
    2. 用5%聚维酮碘溶液冲洗结膜囊。
    3. 在结膜下注射0.3 mL混合液，包含20 mg庆大霉素、2 mg地塞米松和2%利多卡因。
    4. 通过显微镜观察检查眼底和晶状体的状况。
    5. 使用手术镊和Westcott结膜剪拆除瞬膜上的缝线（可选操作）。
    6. 将新霉素眼膏或氧氟沙星眼用眼膏涂抹于结膜囊内。

眼部手术设置示意图及显微外科手术过程，显示切口角度和手术部位。
图6：微型猪眼球中套管的插入。（A）套管的示意图，显示其在人眼（灰色）中垂直插入巩膜，指向玻璃体腔中心；而在微型猪眼（蓝色）中则以斜向方式插入，指向后部视网膜，以避免损伤晶状体。微型猪的晶状体（蓝色）相较于玻璃体腔的大小，比人类的更大。（B）三通道玻璃体切割术（PPV）中已插入套管的术中视野。角膜覆盖甲基纤维素以防止干燥和肿胀。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 术后护理

  1. 每日五次将杆菌肽锌/醋酸氢化可的松/硫酸新霉素或 0.3% 氧氟沙星滴入动物的结膜囊内。
  2. 术后使用手持裂隙灯或间接检眼镜检查以下眼部参数：通过触诊评估眼周软组织的张力、眼表炎症反应，以及眼睑保护性反应（如眯眼）。
  3. 术后全身护理使用以下抗生素：
    1. 在术后第二和第三天，按 3 mg/kg 体重（1 mL/kg）剂量肌内注射盐酸头孢噻呋。
    2. 术后 72 小时给予泰拉霉素（1 mL/40 kg 体重），以预防继发性细菌感染。
  4. 术后连续 3 天，每 24 小时肌内注射一次氟尼辛（2 mL/45 kg 活体重）和盐酸曲马多（100 mg），以预防疼痛。
  5. 将小型猪饲养于专用的空调设施中，环境温度控制在 18–22 °C，光照周期为人工控制的 13 小时光照/11 小时黑暗。
  6. 确保动物可自由饮水，并每日两次提供标准饲料。

5. 术后操作

  1. 术后眼科检查
    1. 术后期间，使用间接检眼镜检查眼睛，观察是否存在炎症（即结膜囊内充血、组织肿胀或黏液淤积）。采用触诊法测量手术眼的眼内压。
  2. 术后成像
    1. 在进行眼底照相和光学相干断层扫描（OCT）检查前，通过肌内注射 TKX 混合剂对小型猪进行镇静。向小型猪的结膜囊内滴入 1% 托吡卡胺和 10% 盐酸去氧肾上腺素滴眼液，以诱导散瞳。
    2. 使用眼睑撑开器保持眼睛睁开。为保持眼球表面湿润并获得清晰的 OCT 图像，每隔 30–60 秒用生理盐水（0.9% NaCl）冲洗动物的角膜一次。
    3. 将小型猪以与手术期间相同的方式置于手术台上（图 2B、C，图 3A）。主要要求是将头部侧放，并使其垂直于 OCT 设备的扫描部件。在动物鼻部下方使用泡沫垫以固定头部，使眼球表面处于水平位置。
    4. 使用彩色非散瞳眼底相机采集彩色眼底图像，以便记录眼前节、视网膜和视盘。此外，使用非散瞳眼底相机获取视网膜的无红光图像。
    5. 采用谱域 OCT 系统进行光学相干断层扫描成像。在进行 OCT 或眼底成像期间，手动将小型猪的头部向 OCT 镜头或眼底相机镜头方向倾斜，以优化对后部视网膜及植入区域的观察（图 2C）。为获得眼底植入载体的最佳成像效果，使用 OCT 设备的红外反射光对准植入物（图 2C）。采用 OCT 十字线扫描模式和视网膜地图扫描模式。
    6. 检查结束时，在动物眼睑下方涂抹氧氟沙星眼膏。
    7. 将小型猪转移至室内饲养设施，并持续观察其整体状况，直至镇静作用完全消失（约 2 至 5 小时）。

安乐死后尸体眼球摘除术

  1. 使用TKX混合物进行肌内注射使小型猪镇静，随后通过耳缘静脉（22 G套管针）快速推注1%丙泊酚（每只动物20 mL），然后进行放血处死。不要使用常规固定剂。
  2. 在细胞移植后7天、14天、28天和42天，于深度全身麻醉状态下通过放血处死动物。
  3. 使用镊子和剪刀去除上下眼睑，移除瞬膜并切开结膜，剪断眼外肌和视神经。
  4. 死后使用手术剪和手术镊进行眼球摘除术。确保该操作由经验丰富的人员执行。

结果

Liběchov 小型猪细胞载体视网膜下植入的结果见表2。成功植入定义为获得了足够的组织用于组织学和免疫组织化学研究；失败病例定义为术中出现严重并发症，导致无法进一步观察眼组织。

使用硅油作为眼内填充物，结合所述技术，可在术后次日起直至眼球摘除前，通过影像学方法持续监测视网膜下移植体的状态图7, 图8，以及 图9).

眼底成像与谱域光学相干断层扫描
在术后阶段，使用眼底成像、无红光成像以及谱域光学相干断层扫描对小型猪进行了检查（图7）。得益于透明的屈光介质，包括透明的晶状体以及硅油填充，实现了高质量的眼底成像（图7A）。视网膜切口部位未见增殖性反应迹象（图7A，黄色箭头），且可通过半透明的猪视网膜层清晰观察到细胞载体上的PTE框架。在无红光成像中，载体上培养的人视网膜色素上皮细胞（hRPEs）的反射率与内源性猪RPE层的反射率无明显差异（图7B）。在谱域OCT图像中，PTE框架仅对下方解剖结构造成轻微遮蔽效应，并引起视网膜轻微增厚（图7C，红色箭头）。谱域OCT未发现异常的低反射或高反射区域，且Bruch膜似乎保持完整。图8展示了术后1个月接种原代人RPE细胞的支架的眼底及术中OCT图像（图8）。仅细胞载体本身（不含任何细胞）未引起视网膜厚度显著增加（图9C）。这些结果表明，植入物在术中造成的医源性影响极小，且植入的细胞载体实现了移植细胞与上方光感受器细胞及神经视网膜组织之间的充分适应。

眼底检查；A：光学图像，B：红外图像，C：OCT扫描；诊断成像方法。
图7：小型猪视网膜的术后成像。（A）眼底成像，（B）无红光成像，以及（C）在小型猪眼中进行视网膜下移植后1周，携带原代人视网膜色素上皮细胞的纳米纤维载体的光学相干断层扫描成像。（A）黄色箭头指示视网膜切开部位。（B）红色箭头显示纳米纤维细胞载体的边缘。（C）红色箭头显示由植入视网膜下间隙的纳米纤维载体的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）支撑框架引起的OCT信号轻微遮蔽现象。请点击此处查看该图的放大版本。

OCT视网膜分析，光学相干断层扫描，显微成像结果，视网膜层评估。
图8：小型猪视网膜下植入支架后30天的眼底成像与术中光学相干断层扫描（iOCT）图像。 A、B、C、D 和 E 分别对应于编号为169、182、179、199和224的小型猪。黄色箭头指示支架的轮廓。请点击此处查看该图的放大版本。

组织学与免疫组织化学分析
动物安乐死后，完整取出小型猪眼球，并在4%多聚甲醛（PFA）中固定24小时。切除眼球前段，于鼻侧中央视网膜处识别植入的纳米纤维载体，并连同附着的巩膜一并分离。所有组织均经梯度蔗糖溶液进行冷冻保护处理，并按文献详细描述的方法制备垂直冷冻切片43。植入4周后，不含视网膜色素上皮细胞的纳米纤维膜组织学结果显示，视网膜未见炎症及退行性改变（图9A）。在偏振光下可检测到纳米纤维膜的存在（图9B）。

视网膜横切面、组织学和光学相干断层扫描图像，显示视网膜各层及结构分析。
图9：植入后无细胞纳米纤维膜的组织学分析。植入4周后无细胞纳米纤维膜的苏木精-伊红染色图像，（A）为标准光照下成像，（B）为偏振光显微镜下成像。白色箭头指示纳米纤维膜的位置（比例尺：50 µm）。（C）植入后4周的体内光学相干断层扫描（OCT）图像显示，纳米纤维膜在视网膜下腔内具有良好的生物相容性和黏附性。白色箭头指示在视网膜横截面图像中植入物的位置。请点击此处查看该图的高清版本。

图10 显示了小型猪眼球中植入纳米纤维载体（黄色箭头）上的原代人视网膜色素上皮（hRPE）细胞所在视网膜区域的苏木精-伊红（H&E）染色结果。植入的原代hRPE细胞呈现色素性外观，形成一层连续但不规则的色素层（图10，红色箭头）。在较长观察期（6周）后，植体下方的神经视网膜在视网膜切开部位周围呈现出花环样或类似增生性反应的形态，可能由医源性操作引起。这些形态学结果与SD-OCT检查结果相似，支持载体递送对视网膜组织影响较小的证据。

显示视网膜各层的组织学图像，包括RPE细胞和脉络膜；箭头指示细胞位置。
图10：植入原代hRPE细胞的纳米纤维膜的组织学分析。 显示植入纳米纤维载体（黄色箭头）并携带原代hRPE细胞的迷你猪眼球视网膜区域的苏木精-伊红染色图像。动物在植入后6周被实施安乐死并进行分析。原代hRPE细胞因其大小、圆形形态以及色素沉积（红色箭头）而在感光细胞相对的视网膜下腔中清晰可辨。外核层（ONL）中的感光细胞核形成类玫瑰花结样结构。视网膜下腔呈现肥厚状态。缩写：hRPE = 原代人视网膜色素上皮细胞，ONL = 外核层，INL = 内核层。 请点击此处查看该图的放大版本。

采用两步间接法进行免疫染色。将切片与CRALBP单克隆一抗以1:100稀释度在室温下孵育过夜。使用Alexa Fluor 488标记的二抗进行免疫荧光染色。

植入的原代人视网膜色素上皮细胞（hRPE）存在于植入区域，并表达典型的RPE细胞标志物CRALBP，其表达模式与内源性小型猪RPE细胞相似（图11A）。相比之下，植入细胞的形态在植入后尚未形成单层结构，但仍局限于定义的视网膜下腔内（图11A、B，白色箭头）。在植入后6周，以下RPE/视网膜标志物及形态特征仍呈阳性：色素/黑色素颗粒的存在、视杆双极细胞（PKC-alpha）和视锥光感受器细胞（PNA）等终末期视网膜特异性神经元标志物，以及GFAP阳性——提示小胶质细胞被激活。

荧光显微镜，CRALBP和DAPI染色，猪/人视网膜组织分析，细胞层比较。
图11：移植原代人视网膜色素上皮细胞（hRPE）后6个月，小型猪体内RPE细胞标志物CRALBP（细胞视黄醛结合蛋白）的免疫标记结果。（A）经处理的猪眼垂直冷冻切片使用CRALBP单克隆抗体（绿色）进行免疫标记，并用DAPI复染（蓝色）。（B）DAPI标记的细胞核以黑白形式单独显示，高对比度下可清晰观察到单个人源RPE细胞的圆形轮廓（部分细胞以白色箭头标示）。缩写：hRPE = human retinal pigment epithelium（人视网膜色素上皮），ONL = outer nuclear layer（外核层）。请点击此处查看该图的放大版本。

眼部并发症
总共29例手术中成功完成27例（93.1%）。所谓“成功完成的手术”是指手术眼直至眼球摘除时未出现任何可能影响组织学和免疫组织化学研究的临床显著术后并发症的病例。在4例（13.7%）中，眼内光学介质透明度降低影响了术后影像学检查；然而，这些眼球仍进行了后续的组织学和免疫组织化学分析。

术中发生周边视网膜脱离4例（13.8%）。其中2例在液-气交换过程中通过抽吸视网膜下液体，并对脱离区域的视网膜进行激光光凝治疗得以处理。另2例（6.9%）的视网膜脱离伴有严重的视网膜及视网膜下出血，导致细胞载体无法植入，手术随即终止，并立即对实验用小型猪实施安乐死。

编号参数标准使用设置
1玻璃体切除速度（切割速率）最高 20,000 cuts/min
2文丘里泵50–180 mmHg
3上升时间1 秒
4灌注压力18–25 mmHg
5空气灌注压力20–25 mmHg
6双极外用透热法18–26%
7单极内用透热法16–18%
8视网膜激光光凝，532 nm功率 100–150 mW
间隔 100 ms
持续时间 100 ms

表1： 玻璃体切除术和激光光凝术期间使用的标准参数。

动物总数，n18
眼睛总数，n36
手术眼睛数，n29
成功植入数，n27
失败案例数，n2
平均手术时间，min57
成功率，%93.1

表2： 2016年至2020年间在利贝霍夫小型猪中采用标准化手术技术进行细胞载体视网膜下植入的结果。

补充文件 1：关于视网膜色素上皮细胞在细胞载体上进行视网膜下移植研究的综述。请点击此处下载该文件。

讨论

将不同来源的视网膜色素上皮（RPE）细胞进行视网膜下移植，是治疗视网膜变性疾病（如年龄相关性黄斑变性，AMD）3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,25 眼科研究中的一个极具前景的方向。该策略的核心理念是利用体外培养（ex vivo）的健康RPE细胞替代受损的RPE细胞（补充文件1）44,45,46,47,48。采用细胞载体移植培养的RPE细胞是最为合理的方法，因为多孔膜能够维持RPE细胞层的极性，并使其相对于光感受器层保持正确的空间取向。

最佳动物模型
开发此类治疗方法的关键步骤之一是使用最佳的动物模型49。过去，已采用过小型和大型动物模型，包括兔子、狗、猪以及非人灵长类动物8,9,10,11,12,13,14,15,27,29。在本文中，我们提出采用利贝霍夫小型猪（Liběchov minipig）模型，并描述了实现高效移植效果所需的术前、术中及术后操作步骤。利贝霍夫小型猪约在20年前培育而成，已广泛应用于帕金森病和亨廷顿病等神经退行性疾病领域的生物医学研究29,50。由于猪的大脑相对较大，其血液供应和免疫反应与人类相似，因此也被用于同种异体移植实验的动物模型51,52,53,54。尽管小型猪的视网膜不具备类似人类的黄斑和中央凹，但其具有中央区（area centralis）和视杆带（visual streaks），这些区域是视网膜上视锥光感受器高度集中的区域30。与人眼相似的尺寸、富含视锥细胞的中央视网膜、免疫系统特征明确，以及存在可用于评估术后形态和功能的方法，均为本研究中采用该大型动物模型提供了重要依据。

手术步骤
据我们所知，目前尚无标准化且被广泛接受的用于载体携带的视网膜色素上皮（RPE）细胞进行玻璃体视网膜移植的外科技术。细胞替代治疗的关键问题之一是手术操作具有挑战性，术中和术后可能出现与视网膜脱离、低眼压、巩膜外、脉络膜和/或视网膜出血以及眼内湍流过高相关的并发症风险，这些因素可能导致支架损伤。术后存在增殖性玻璃体视网膜病变、眼内炎、低眼压、视网膜脱离和白内障形成的危险4,10,13,14,15。

关于使用细胞载体方法的首批研究是在绒毛兔中进行的13,16,25。尽管这些动物属于小型动物模型，但这些研究在手术技术方面的结果对于大动物模型手术方法的建立至关重要，因此在下文中进行了总结。

最初使用了一种定制的带有两个侧孔的23 G灌注套管，以改变射流方向，从而有助于解决滤过泡塌陷及随之发生的视网膜脱离问题13。在本研究中，我们未观察到此类滤过泡塌陷现象。可能的原因在于眼球尺寸较大，且在套管灌注部位进行了中央玻璃体切除而保留了周边部玻璃体，这可能会减弱定向射流的冲击力。

在小型动物模型中，细胞载体从仪器中推出时出现困难是另一种术中障碍，被归类为"被仪器卡住"。此外，作者指出，视网膜表面残留的玻璃体可能导致植入后载体从视网膜切口向后"弹出"。该问题可通过酶辅助的玻璃体切除术解决，从而实现细胞载体向视网膜下腔平稳、连续的推出。在大多数情况下，作者会重新调整载体位置，使植入物远离视网膜切口，达到更远的位置。在我们的病例系列中，也曾遇到细胞载体仍附着于注射器尖端的情况。然而，通过缓慢而轻柔地操作导光管和注射器尖端，该问题得到了有效处理。在所有病例中，我们均未观察到视网膜切口处有残留玻璃体。建议在手术中采用TA辅助的玻璃体切除术（PPV），以降低玻璃体残留附着的风险。可能需要多次使用TA染色，以彻底清除覆盖的玻璃体。

在另一项研究中，报道了将生长在聚酯膜上的极化单层人视网膜色素上皮（RPE）干细胞进行视网膜下植入的结果24。实验过程中采用了此前描述过的相同手术技术13，但使用了双通道玻璃体切除术（PPV）方法。最终，随后发表了一项关于在兔眼中进行细胞载体视网膜下植入手术的逐步操作方案25。该研究对手术步骤提供了非常详尽且易于重复的描述，包括术前和术后护理，这些内容也基于以往的经验。

在后续研究中使用大型动物模型时，不仅探讨了技术性问题，还研究了移植细胞引发的免疫反应以及细胞载体尺寸相关的问题。一项利用食蟹猴（Macaca fascicularis）的研究描述了人干细胞来源的视网膜色素上皮（RPE）单层细胞经视网膜下植入后的结果15。所有动物均接受了系统性免疫抑制治疗，方案包括手术前7天开始、术后持续3个月使用西罗莫司（负荷剂量2 mg，每日剂量1 mg）和四环素（7.5 mg/kg- 体重）。手术操作依据先前报道的方案进行24,25。研究人员采用25G三通道玻璃体切割术（PPV）并配合吊灯式内照明系统。重要的是，使用辅助TA的玻璃体后脱离（PVD）技术以排除后部视网膜残余的玻璃体视网膜粘连。在原描述手术步骤基础上，研究人员还使用一种20G定制的可伸缩环形器械，去除了拟植入区域的宿主RPE层。

在我们的小型猪研究中，我们也采用了全身性免疫抑制。然而，所使用的免疫抑制类型与上述方法不同。我们以0.25 mg/kg体重的剂量，皮下注射缓释他克莫司的聚合物微球作为药物储库，以抑制细胞移植物排斥反应和炎症反应。手术过程中我们未去除宿主的视网膜色素上皮（RPE）细胞层，因为本研究的主要目的是评估该操作的安全性以及植入细胞的存活情况，而非其在宿主视网膜中的整合能力。

既往研究已在14只雌性尤卡坦小型猪中评估了将人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞（RPE）单层种植于可折叠、不可降解、网状支撑的亚微米聚对二甲苯C膜（6.25 mm × 3.5 mm，0.4 µm厚）上并进行视网膜下植入的安全性和可行性10。细胞培养完成后，被接种至带网状支撑的膜上。免疫抑制通过全身给予他克莫司（未说明具体方案和剂量）以及手术结束时玻璃体内注射0.7 mg地塞米松植入物实现。采用20 G方法行玻璃体切除术（PPV）。作者使用玻璃体内注射曲安奈德（triamcinolone acetonide, TA）晶体以更好地观察玻璃体结构。巩膜切口大小为2 mm至3 mm。视网膜下注射后，通过临时注入全氟化碳液体使视网膜复位。在液-气交换后，实施硅油填充（1,000/5,000 cSt）。术后护理包括手术后1周局部眼部应用地塞米松/新霉素/多黏菌素B眼膏。作者报告手术成功率为91%（即成功实现视网膜下植入并获得足够的术后影像学数据）。在本研究中，术中采用玻璃体内注射TA晶体，主要用于观察玻璃体结构，但该药物的局部免疫抑制作用尚不明确。本研究使用的纳米纤维细胞载体尺寸为5.2 mm × 2.1 mm，厚度为3.7 µm，孔径为0.4 µm。手术过程中，我们直接进行液-气交换（FAX），而非注入全氟化碳液体。我们的手术成功率（93.1%）与Koss等人的结果10一致，且略优。

2019年，首次在约克夏猪中研究了用于视网膜下植入的完全可降解细胞载体（支架）的视网膜下移植14。该研究主要关注纤维蛋白水凝胶植入物的可生物降解特性。作者指出，对家猪使用的强烈免疫抑制治疗可能抑制纤维蛋白水凝胶植入物在降解过程中引发的局部炎症反应。然而，他们并未具体说明在猪模型中所采用的免疫抑制治疗方案。在行玻璃体切割术（PPV）时，他们于角膜缘后方约3.5 mm处，平行于角膜缘做长度为3.6 mm的巩膜切口，用于插入视网膜下植入装置。此外，他们采用了一种气动驱动注射系统，旨在减少因手指操作引起的持针不稳。在我们的病例系列中，所有巩膜切口均位于距角膜缘2.5 mm至3.0 mm处。用于插入注射器的大切口长度为3 mm。本研究中使用的植入注射器为手动操作。对睫状体平坦部进行彻底的电凝以及在大切口中进行充分的切割，对于避免术中并发症（如医源性周边视网膜脱离、出血及植入物丢失）至关重要。

综上所述，我们描述了利用利贝霍夫迷你猪模型进行可生物降解载体携带的视网膜色素上皮（RPE）细胞移植，作为遗传性和获得性视网膜疾病的治疗方案。由于其在眼部解剖结构、生理特性以及免疫系统方面与人类具有相似性，因此可用于开发和优化细胞视网膜下植入的外科技术与器械，且这些技术和经验可直接应用于人类眼病的治疗。重要的是，在迷你猪上进行的手术应使用与人类手术相同的器械（包括植入递送工具），以确保所获得的技术经验和专业知识能够顺利转化至临床应用。其他具有黄斑区域的大眼动物模型（如非人灵长类动物）可能有助于对视网膜中央区域细胞视网膜下植入后解剖和功能变化的后续观察与分析。术前、术中及术后护理程序的详细描述将有助于未来研究，提高数据生成的效率与标准化水平。

致谢

该项目由捷克科学基金会（项目编号 18-04393S）以及挪威资助项目和捷克共和国技术局（KAPPA 计划，项目编号 TO01000107）提供支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>技术设备
Wato EX-65 配合 Mindray iMEC10迈瑞，中国深圳Wato Ex-65麻醉机
R-Evolution CROptikon，罗马，意大利R-Evolution CR超声乳化仪/玻璃体切除器
绿色激光 Merilas 532α瑞士，图恩，子午线Merilas 532α眼科绿激光
Microscope Hi-R NEO 900AHaag-Streit 外科，韦德尔，德国Hi-R NEO 900A眼科手术显微镜
相机 Sony PMW-10MD索尼，日本东京PMW-10MD全高清医用两件式 
非接触式玻璃体视网膜手术系统 MERLIN BIOMVolk, Mentor, OH, USAMERLIN 生物分子生物分子
高压蒸汽灭菌器Tuttnauer Europe B.V.，布雷达，荷兰3870 HSG灭菌器
iCam100Optovue，弗里蒙特，加利福尼亚州，美国iCAM100眼底相机
iVue OCT100-2Optovue，弗里蒙特，加利福尼亚州，美国iVue OCT100-2OCT
<强>显微外科器械与设备
库克眼睑撑开器美国新泽西州卡特纳K1-540315毫米刀片
眼科手术铺巾Hylyard，美国佐治亚州阿尔法雷塔79304132 x 142厘米
一次性双步玻璃体切除系统。（23G/0.6 mm）DORC，荷兰南兰德1272.ED06
23G / 0.6 mm 灌注套管用输液管DORC，荷兰南兰德1279.P
2.75毫米刀片，IQ Geometry™斜缝刀片（倾斜，刃口向上）美国雷丁外科专科公司72-2761G
可伸缩41G视网膜下注射针头（23G / 0.6 mm）DORC，荷兰南兰德1270.EXT
Omnifix 3ml 鲁尔锁式单件式注射器BBraun，德国美尔松根4617022V3ml
1ml 软注射结核菌素注射器Henke Sass Wolf，德国图特林根5010.200V01 ml
8-0 涂层薇乔缝线美国波多黎各埃西康J409G
纯化硅油（注射器装）10 ml（FCI，法国巴黎）S5.71701000cSt
Pinnacle 360 Morris 垂直剪刀 23Ga协同力学，美国密苏里州奥法伦10.24.23PIN23Ga
Revolution DSP 23Ga ILM 镊子Alcon，瑞士日内瓦706.44格里沙伯革命
23号直型激光探针 协同作用，O’Fallon，美国55.21.23
FCI Protect 2.0%FCI Ophthalmics，法国巴黎S5.9100粘弹性
DK Westcott 风格弯头缝合剪Duckworth &英格兰赫特福德郡肯特1-501曲线
皮尔斯齿状镊，0.3 mm 直头Duckworth &英格兰赫特福德郡肯特2-100-1E0.3 mm 直
DK Harms-Tubingen 直型打结钳Duckworth &英格兰赫特福德郡肯特2-504E6 mm
DK持针器，直型Duckworth &英格兰赫特福德郡肯特3-2019 mm 直头
<强>药物与溶液
Unitropic 1% 滴眼液 UNIMED PHARMA spol. s r.o.，布拉迪斯拉发，斯洛伐克共和国托吡卡胺 10 mg/ml滴眼液
Diprophos默克雪兰诺 & Dohme B.V.，荷兰哈勒姆betamethasonum 7 mg/ml1 ml
Alcon BSS 灌注液Alcon，瑞士日内瓦平衡盐溶液（BSS）500ml
BetaisodonaMundipharma，英国剑桥聚维酮碘 1g/10ml30ml
Depo-medrol 120mg辉瑞，纽约，美国甲基泼尼松龙5 ml/200 mg
Shotapen法国赛德克斯，Virbac公司苄青霉素，双氢链霉素250 ml
氟尼辛 a.u.v.Norbrook，Newry，北爱尔兰氟尼辛 50.0 mg250毫升
曲马多 100MG/2MLStada Arzneimittel AG，巴特菲爾貝爾，德國曲马多2ml
Zoletil 100法国赛德克斯 Virbac 公司替来他明，唑拉西泮100mg
Narkeran 10Vetoquinol，法国马涅-韦努瓦氯胺酮2 ml
Rometar 20mg/ml斯波法制药公司，捷克共和国布拉格xylazinum20mg
Braunol 75mg/gB.Braun 医疗公司，捷克共和国布拉格聚维酮碘75 mg/g
丙泊酚 1% MCT/LCTFresenius Kabi，巴特洪堡，德国丙泊酚10 mg/1 ml
异氟烷 100% 吸入用蒸气，液体Piramal Critical Care Limited，英国韦斯特德雷顿异氟烷100%
苯氧乙滴眼液  4mg/1mlUnimed pharma，斯洛伐克布拉迪斯拉发oxybuprakaine10 ml
Neosynephrin POS 10% 滴眼液 Ursapharm，萨尔布吕肯ü肯，德国去甲肾上腺素氯化物10 ml
Ophthalmo-framykoin 1X5GMZentiva a.s.  捷克共和国布拉格杆菌肽锌/醋酸氢化可的松/醋酸氢化可的松/硫酸新霉素5mg
Floxal 软膏德国柏林，格尔哈德·曼化学制药厂氧氟沙星0.30%
Eficur 注射液 Hipra，Amer，西班牙盐酸头孢噻呋 50 mg / 1 ml
Draxxin美国新泽西州，硕腾公司tulathromycinum100 mg / 1 ml
曲马多Stada Arzneimittel AG，巴特菲爾貝爾，德國盐酸曲马多100 mg / 2 ml
XylapanVetoquinol，法国马涅-韦努瓦xylazinum0.4 mg/kg
0.5% 盐酸丙帕他卡因滴眼液Bausch&博士伦公司，佛罗里达州坦帕市，美国盐酸丙帕卡因0.50%
Prograf Astellas Pharma，美国伊利诺伊州迪尔菲尔德他克莫司粉末1 mg
<强>细胞载体、培养细胞、培养物及植入注射器
Falcon 细胞培养小室康宁公司，缅因州肯尼邦克，美国353103
TrypLE Express 酶 (1X)Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州，美国12604021
DMEM/F-12赛默飞世尔科技，马萨诸塞州，美国11320033
Biolaminin 521 LN（LN521）BioLamina，Sundbyberg，瑞典LN521-02
GlutaMAX 补充剂Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州，美国35050061
2-巯基乙醇赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州，美国J66742.0B
青霉素-链霉素Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯P4333
CRALBPNovus Biologicals，英国阿宾顿NB100-74392
Alexa Fluor 488赛默飞世尔科技，德国 21202

参考文献

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勘误


Formal Correction: Erratum: Subretinal Implantation of RPE on a Carrier in Minipigs: Guidelines for Preoperative Preparations, Surgical Techniques, and Postoperative Care
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

An erratum was issued for: Subretinal Implantation of RPE on a Carrier in Minipigs: Guidelines for Preoperative Preparations, Surgical Techniques, and Postoperative Care. The Authors section was updated from:

Lyubomyr Lytvynchuk*1,2
Zbynek Stranak*3, Hana Studenovska4
David Rais4
Štěpán Popelka4
Lucie Tichotová5,6
Yaroslav Nemesh5,6
Anastasiia Kolesnikova5,6
Ruslan Nyshchuk5,6
Anna Brymová5,6
Zdeňka Ellederová5
Jana Čížková5
Jana Juhásová5
Štefan Juhás5
Pavla Jendelová7
Richárd Nagymihály8
Igor Kozak9
Slaven Erceg10
Susanne Binder11
Brigitte Müller1
Knut Stieger1
Jan Motlik5
Goran Petrovski*8
Taras Ardan*5
1Eye Clinic, Department of Ophthalmology, University Hospital Giessen and Marburg GmbH
2Karl Landsteiner Institute for Retinal Research and Imaging
3Department of Ophthalmology, University Hospital Kralovske Vinohrady and Third Faculty of Medicine, Charles University in Prague
4Institute of Macromolecular Chemistry, Czech Academy of Sciences, 5Institute of Animal Physiology and Genetics, Czech Academy of Sciences
6Department of Cell Biology, Faculty of Science, Charles University
7Institute of Experimental Medicine, Czech Academy of Sciences
8Center for Eye Research, Department of Ophthalmology, Oslo University Hospital and Institute of Clinical Medicine, Faculty of Medicine, University of Oslo
9Moorfields Eye Hospitals UAE
10Stem Cell Therapies in Neurodegenerative Diseases Lab, Research Center “Principe Felipe”
11Eye Center Donaustadt, Department of Ophthalmology, Sigmund Freud University

* These authors contributed equally

to:

Lyubomyr Lytvynchuk*1,2
Zbynek Stranak*3, Hana Studenovska4
David Rais4
Štěpán Popelka4
Lucie Tichotová5,6
Yaroslav Nemesh5,6
Anastasiia Kolesnikova5,6
Ruslan Nyshchuk5,6
Anna Brymová5,6
Zdeňka Ellederová5
Jana Čížková5
Jana Juhásová5
Štefan Juhás5
Pavla Jendelová7
Richárd Nagymihály8
Igor Kozak9
Slaven Erceg10
Susanne Binder11
Brigitte Müller1
Knut Stieger1
Jan Motlik5
Goran Petrovski*8
Taras Ardan*5
1Department of Ophthalmology, Justus Liebig University, University Hospital Giessen and Marburg GmbH
2Karl Landsteiner Institute for Retinal Research and Imaging
3Department of Ophthalmology, University Hospital Kralovske Vinohrady and Third Faculty of Medicine, Charles University in Prague
4Institute of Macromolecular Chemistry, Czech Academy of Sciences, 5Institute of Animal Physiology and Genetics, Czech Academy of Sciences
6Department of Cell Biology, Faculty of Science, Charles University
7Institute of Experimental Medicine, Czech Academy of Sciences
8Center for Eye Research, Department of Ophthalmology, Oslo University Hospital and Institute of Clinical Medicine, Faculty of Medicine, University of Oslo
9Moorfields Eye Hospitals UAE
10Stem Cell Therapies in Neurodegenerative Diseases Lab, Research Center “Principe Felipe”
11Eye Center Donaustadt, Department of Ophthalmology, Sigmund Freud University

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视网膜色素上皮细胞载体小型猪眼模型经平坦部玻璃体切除术视网膜变性年龄相关性黄斑变性视网膜切开术硅油填充光学相干断层扫描免疫组织化学分析
小型猪视网膜下植入携带视网膜色素上皮细胞的载体：术前准备、手术技术及术后护理指南
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