我们介绍一种实时检测和捕获侵袭性细胞亚群的方法。该实验设计通过监测细胞电阻抗的变化，采用实时细胞分析技术。可在复杂组织中捕获侵袭性癌细胞、免疫细胞、内皮细胞或间质细胞，并评估共培养的影响。
我们介绍一种实时检测和捕获侵袭性细胞亚群的方法。该实验设计通过监测细胞电阻抗的变化，采用实时细胞分析技术。可在复杂组织中捕获侵袭性癌细胞、免疫细胞、内皮细胞或间质细胞，并评估共培养的影响。
癌细胞的侵袭和转移扩散是癌症致死的主要原因。早期开发的用于测量癌细胞群体侵袭潜能的检测方法通常仅提供单一的终点测量值，无法区分具有不同侵袭能力的癌细胞亚群。此外，肿瘤微环境包含多种固有的间质细胞和免疫细胞，这些细胞会改变并参与癌细胞的侵袭行为。在组织中发生侵袭的过程同样存在于免疫细胞亚群中，例如在组织重塑和血管生成过程中，免疫细胞亚群通过侵袭来抵御微生物或清除实质组织和内皮细胞中的病变细胞。利用阻抗生物传感器实时监测细胞侵袭的实时细胞分析技术（Real-Time Cellular Analysis, RTCA）相比传统的终点检测方法是一大进步：该技术可实现对侵袭过程的连续动态监测，从而揭示在终点检测中被忽略的侵袭速率差异。基于现有的RTCA技术，我们通过增加一个额外的腔室对双室阵列进行了扩展，该腔室可容纳间质细胞和/或免疫细胞，从而能够长期监测共培养的间质或免疫细胞所分泌因子影响下的侵袭速率。除此之外，该独特设计还允许在任意时间点拆卸腔室，进而分离出最具侵袭性的癌细胞或其他存在于异质性肿瘤分离物中的细胞亚群。这些最具侵袭性的癌细胞及其他细胞亚群是恶性肿瘤进展为转移性疾病的关键驱动因素，其分子特征对于深入的机制研究、开发用于检测这些细胞的诊断探针以及评估其潜在弱点至关重要。因此，可在实验中引入小分子或大分子药物，用于评估靶向癌细胞和/或间质细胞亚群的治疗策略，以期抑制（如癌细胞）或增强（如免疫细胞）其侵袭行为。
细胞侵袭是一个重要过程，可使细胞在间质细胞提供的环境信号刺激下穿越基底膜屏障。该过程在免疫反应、伤口愈合、组织修复以及恶性肿瘤的发展多个阶段中至关重要，后者可从局部病灶进展为侵袭性及转移性癌症1。早期开发的用于测量细胞群体侵袭潜能的检测方法通常只能提供单一终点测量值，或需要预先标记侵袭性细胞2。目前，微电子与微流控技术的结合已被用于检测细胞生物学的多个方面，例如通过活细胞在微电极上的电学阻抗来评估其活性、运动性和贴附性3,4。阻抗测量可实现无标记、非侵入性且定量的细胞状态评估3。本文描述了一种基于Abassi等人开发的实时细胞分析（RTCA）系统设计的三室阵列5。该三室阵列可用于共培养条件下细胞侵袭行为的评估，并可回收侵袭后的细胞以进行进一步分析或扩增。
在细胞分析系统中，细胞穿过涂覆于多孔膜上的细胞外基质，侵袭至屏障另一侧的叉指电极阵列。随着侵袭性细胞随时间持续贴附并占据该电极阵列，电学阻抗随之发生平行变化。当前系统包括一个16孔的细胞侵袭与迁移（CIM）板，该板具有两个腔室。RTCA-DP（双功能）仪器（以下简称双功能细胞分析仪）包含用于阻抗测量的传感器，以及用于分析....
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该研究经乔治城大学机构审查委员会（IRB # 2002-022）审核，并被认定为"豁免"。新鲜获取的骨髓组织采集自已去标识化的废弃健康人骨髓收集滤器。
1. 新型腔室设计（图2）
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利用新设计的三室阵列，在存在或不存在成纤维细胞等间质细胞的情况下检测了细胞的侵袭能力。当在底部腔室中接种经照射的瑞士3T3成纤维细胞（J2品系）时，MDA-MB-231细胞的侵袭能力增强，这允许两种细胞系之间进行因子交换。有趣的是，当3T3-J2细胞数量加倍时，MDA-MB-231细胞的侵袭进一步增加（图3A）。另一方面，MCFDCIS细胞的一种侵袭性克隆（DCIS-Δ4）9的侵袭速率似乎因与3T3-J2细胞的相互作用而受到抑制（图3B）。该数据表明，三室阵列可用于有效评估间质成分（本例中为成纤维细胞）对细胞侵袭的不同影响。
接下来，为了监测内皮细胞在侵袭性（MDA-MB-231）10,11 或非侵袭性（DCIS）12 癌细胞信号刺激下运动性和侵袭性的变.......
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我们改进了双室微阵列的设计，增加了一个第三室，用于在存在基质细胞的情况下实时监测细胞侵袭。我们观察到共培养的成纤维细胞对侵袭性和非侵袭性癌细胞产生不同的影响，表明该微阵列可用于区分对共培养基质细胞所分泌因子响应不同的癌细胞亚群。该阵列还被用于监测内皮细胞向基质组织中的侵袭，这是在具有不同侵袭潜能的癌细胞存在下，血管朝向促血管生成刺激物出芽过程中的关键步骤。这些实验表明，该微阵列在癌细胞或其他细胞的分离方面具有广泛的用途。
建议优化每个小室中接种的细胞数量。根据我们的经验以及制造商的建议，每个小室接种30,000至50,000个细胞为最佳。由于该阵列可同时共培养两种细胞类型，其中一种可能是基质细胞的原代培养物，因此建议监测不同培养基对细胞活力维持的影响。我们发现，在监测前对细胞进行饥饿处理可减少重复样本之间的变异。如果无血清培养条件对细胞有害，可采用低血清浓度和较短的饥饿时间。在下层小室中加入少量血清（1%–2%）可能对基质细胞（原代细胞）的存活至关重要，但务必设置适当对照条件以利于数据分析（例如，含或不含基质细胞的2%血清条件）。如果侵袭率较低，可增加每种实验条件下使用的孔数，以提.......
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乔治城大学已就本论文所述的某些方法申请了专利。G.M.S、A.W、L.D 和 M.P 被列为该专利申请的发明人，并声明此项可能的利益冲突。
我们感谢犹他大学亨斯迈癌症研究所的 Alana Welms 博士为我们提供了患者来源的异种移植瘤（HCI-010）。本研究得到了美国国立卫生研究院基金 R01CA205632、R21CA226542 的资助，以及安捷伦科技公司部分资助的支持。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA | Thermofisher | 25300-054 | |
| 粘合剂 | Norland Optical Adhesive | NOA63 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | A9418 | |
| 细胞刮刀 | Sarstedt | 83.1832 | |
| 霍乱毒素（来自霍乱弧菌） | Thermofisher | 12585-014 | |
| CIM-板 | Agilent | 5665817001 | 细胞分析板 |
| 胶原酶（来自产气荚膜梭菌） | Sigma | C0130 | |
| 中性蛋白酶（Dispase） | StemCell | 7913 | |
| DMEM | Thermofisher | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermofisher | 11875-093 | |
| 胎牛血清（FBS），热灭活 | Omega Scientific | FB-12 | |
| HEPES | Thermofisher | 15630106 | |
| 马血清（HS） | Gibco | 16050-122 | |
| 人表皮生长因子（EGF） | Peprotech | AF-100-15 | |
| 人脐静脉内皮细胞（HUVEC） | LONZA (RRID:CVCL_2959) | C-2517A | |
| HUVEC 培养基 | LONZA | CC-3162 | |
| 氢化可的松 | Sigma | H4001 | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺（ITSX）（100倍浓缩液） | Thermofisher | 51500056 | |
| 人重组胰岛素锌溶液 | Sigma | C8052 | |
| J2 成纤维细胞 | Stemcell (RRID:CVCL_W667) | 100-0353 | |
| LymphoPrep | Stemcell | 7851 | 用于单个核细胞分离的密度梯度介质 |
| Matrigel | Corning | 354230 | 基底膜基质 |
| MCFDCIS.com 细胞（DCIS） | RRID:CVCL_5552 | ||
| MDA-MB-231 细胞 | RRID:CVCL_0062 | ||
| 铣床 | Bridgeport Series 1 Vertical | ||
| 磷酸盐缓冲液（1×） | Thermofisher | 10010049 | |
| 聚醚砜（PES）膜 | Sterlitech | PCTF029030 | |
| 红细胞裂解液 | Stemcell | 7800 | |
| RNeasy 微量试剂盒 | Qiagen | 74004 | |
| RTCA DP 分析仪 | Agilent | 3X16 | 双用途细胞分析仪 |
| 胰蛋白酶 | Sigma | T4799 |
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