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方法文章

使用质谱法分析 Drosophila 光感受器中的脂质信号传导

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DOI：

10.3791/63516

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2022年3月7日

 ,  ,  , 
1National Centre for Biological Sciences-TIFR, GKVK Campus, 2Department of Cell Biology, Yale University, 3Department of Neuroscience, Brown University

本文内容

摘要

该论文提供了多功能、稳健且灵敏的质谱分析方案，用于鉴定和定量果蝇（Drosophila）光感受器中多个类别的脂质。

摘要

磷脂酶Cβ（PLCβ）的激活是果蝇（Drosophila）光感受器中感觉转导过程的关键步骤。PLCβ的活性导致细胞膜脂质磷脂酰肌醇4,5-二磷酸[PI(4,5)P2]的水解，最终引发瞬时受体电位（TRP）和TRP类似（TRPL）通道的激活。PLCβ的活性还继而导致多种脂质分子的生成，其中一些已被提出在TRP和TRPL通道的激活中发挥作用。此外，已有研究提出多类脂质在组织光感受器细胞生物学结构方面发挥关键作用，以优化信号转导反应，实现高效的感觉转导。历史上，这些发现主要依赖于分离控制特定脂质水平的果蝇（Drosophila）突变体，并在这些突变体中进行光感受器生理学分析的能力。近年来，已开发出高灵敏度和高特异性的强大质谱技术，用于脂质的分离与定量分析。这些方法特别适用于果蝇（Drosophila）研究，使得目前无需放射性同位素标记即可对光感受器中的脂质进行分析。本文阐述了在果蝇（Drosophila）光感受器中对多种信号脂质进行稳健、灵敏且准确的定量评估时，脂质质谱分析在概念和实践上的考虑因素。结合现有的分子遗传学和生理学分析方法，此类脂质分析有望进一步增强光感受器作为生物学研究模型系统的应用价值。

引言

Drosophila 中的光转导由 G 蛋白偶联的 PLCβ 级联反应介导，导致光激活通道 TRP 和 TRPL 的激活1。PLCβ 水解膜结合的磷脂磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸 [PI(4,5)P2]，生成二酰甘油（DAG）和肌醇 1,4,5-三磷酸（IP3）。随后，DAG 被 DAG 激酶磷酸化生成磷脂酸（PA）。接着，通过一系列涉及脂质中间产物生成的反应，PI(4,5)P2 得以再生2。该 PI(4,5)P2 循环中的多个组分在 Drosophila 光感受器中具有功能。PLC 激活导致 TRP 和 TRPL 通道门控的具体机制仍不明确。然而，多条证据表明，PI(4,5)P2 水解过程中产生的脂质中间产物可能介导了这一过程3。因此，鉴定并定量这些脂质中间产物对于阐明 Drosophila 光转导中 TRP 和 TRPL 通道的激活机制至关重要。除了在光转导本身中的作用外，脂质还在光感受器细胞结构组织中发挥多种重要功能（综述见3）。了解脂质的这些功能依赖于在活体（in vivo）中检测和定量其水平的能力。本文概述了从 Drosophila 光感受器中定量脂质的方法选择与实施，并提供了相关实验方案。

传统上，脂质分析包括按化学类别进行分离，随后对各个类别进行分析。为了成功鉴定和定量脂质，已开发出多种分析方法，这些方法可分为靶向脂质分析和非靶向脂质分析4,5,6,7,8,9,10靶向分析专注于已知脂质，采用高灵敏度的特定方法对这些特定脂质进行定量分析。非靶向脂质分析旨在同时检测样品中的多种脂质种类。这些分析方法包括薄层色谱法（TLC）4，气相色谱法（GC）5，液相色谱法（LC）6，酶联免疫吸附测定（ELISA）7，核磁共振（NMR）8放射性核素标记和质谱法（MS）9,10尽管放射性标记法是一种检测脂质的灵敏方法，且可用于培养细胞的研究，但其在完整生物体（如 果蝇 由于活体放射性标记的安全性问题，这一过程具有挑战性 飞行动物。放射性标记的另一个挑战在于，它依赖于将所有前体库标记至接近平衡状态，而在以下情境中实现这一点可能较为困难： 体内 模型

利用质谱法进行综合脂质分析是近年来的一项进展，得益于现代质谱技术的发展11。基于质谱的脂质分析具有多项优势，包括所需样品量小、适用于动物模型样品、高灵敏度、高特异性以及高通量。特别是电喷雾电离技术的广泛应用，显著提升了质谱在脂质分析中的性能。质谱仪中质量分析器的不断改进，包括不同类型质量分析器的联用，进一步增加了优势，而高分辨质量分析器的发展则推动了脂质研究的复兴11。基于质谱的分析主要通过两种方式对脂质分子进行表征：（1）自上而下的脂质组学，其质谱实验旨在快速定量分析脂质组内整体变化，仅依赖完整脂质前体离子的精确质量12；（2）自下而上的脂质组学，通过串联质谱检测特征性结构碎片离子，实现对单个分子种类的定量13,14。

总体而言，果蝇（Drosophila）感光细胞中脂质的分析包括两个步骤：首先从眼部/头部组织中提取脂质，其次通过质谱法（MS）分析提取的脂质。该分析可采用以下两种方法之一进行：通过液相色谱法（LC）与质谱联用分离脂质，或不依赖色谱分离的鸟枪法脂质组学/直接进样质谱法（DIMS）。这两种脂质谱分析方法均基于电喷雾电离质谱法（ESI-MS），已被证明具有高灵敏度、定量准确性和高效性10,15。在DIMS分析中，脂质的鉴定依赖于前体离子质量、中性丢失扫描以及脂质类别特异性特征信号14,16,17,18。尽管该方法具有分析速度快、结果稳健的优点，但由于样品中高丰度且高度可极化的脂质存在，低丰度脂质的离子抑制效应难以避免。因此，诸如磷脂酰肌醇和磷脂酸（PA）等低丰度脂质常常在标准DIMS平台上无法被检测到或检测效果较差，离子抑制是其中重要原因19,20。在质谱分析前采用液相色谱分离（LC-MS）可有效缓解离子抑制问题，并有助于聚焦于特定类别或特定种类脂质的分析21。

本文介绍了定量分析主要目标脂质的步骤 黑腹果蝇 描述了光感受器。在这方面，已优化了三种不同的质谱方法：（1）使用高分辨率质谱仪的直接进样质谱法（DIMS），（2）使用三重四极杆质谱仪的衍生化后反相液相色谱-质谱法（RPLC-MS），以及（3）使用具备增强产物离子扫描功能的三重四极杆质谱仪的正相液相色谱-多反应监测-增强产物离子扫描-质谱法（NPLC-MRM-EPI-MS）。方法的选择取决于具体的研究问题。若需对参与光转导过程的所有类型甘油磷脂进行全局性描述与分析，应采用DIMS。但需注意，该方法难以检测极化性低且丰度低的甘油磷脂，如磷脂酰肌醇类。22为了检测这些低丰度脂质，应进行衍生化后反相液相色谱-质谱分析（RPLC-MS）。采用该方法，我们已成功检测并定量了磷脂酸（PA）23,24,25磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰肌醇5-磷酸（PI5P）26，磷脂酰肌醇4-磷酸（PI4P），以及PI(4,5)P₂227DIMS 和衍生化后 RPLC-MS 方法可提供脂质类别水平的信息。例如，使用这两种方法可以定量 m/z 值与多种分子种类一致的 PA (34:2)，包括：(i) PA (16:0/18:2)、(ii) PA (18:2/16:0)、(iii) PA (16:2/18:0)、(iv) PA (18:0/16:2)、(v) PA (16:1/18:1)、(vi) PA (18:1/16:1)、(vii) PA (14:2/20:0) 和 (viii) PA (20:0/14:2)。然而，使用这些方法无法获得样品中 PA (34:2) 的脂肪酰基链组成信息。该难题可通过一种结合液相色谱分离、多反应监测（MRM）和增强型产物离子扫描（EPI）的混合质谱方法加以解决。该方法具有高灵敏度和定量能力，可实现对样品的直接检测（无需任何预标记或后续处理），并确定具有精确脂肪酰基链信息的分子种类。25利用该方法，我们已鉴定出大量磷脂酸（PA）的分子种类，并确定了甘油骨架SN1和SN2位点上脂肪酰基链的精确组成。该策略在分析光感受器中任何类别脂质特定分子种类的功能时将具有重要应用价值。本文提供的上述各类分析的详细实验方案可适用于其他与信号传导相关的脂质研究。 果蝇 光感受器功能（示意图参见 图1）。需要注意的是，其他几类脂质（本文未涵盖）的脂质组学分析详细方法已在别处有所描述，其中包括神经酰胺28,29，鞘脂类30,31，中性脂质如二酰甘油和三酰甘油32,33和甾醇15,33在某些情况下，已针对这些脂质的分析方法进行了描述 果蝇 幼虫组织，并可调整用于光感受器。

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方案

1. 果蝇的饲养与化学试剂的准备

  1. 在25 °C、相对湿度50%且无内部照明的培养箱中，使用标准果蝇培养基饲养果蝇（Drosophila melanogaster）。按如下方法制备果蝇培养基：添加80 g/L玉米粉、20 g/L D-葡萄糖、40 g/L蔗糖、8 g/L琼脂、15 g/L酵母提取物、4 mL丙酸、0.7 g/L TEGO（对羟基苯甲酸甲酯）和0.6 mL正磷酸，具体方法见文献34，也可在 https://bangalorefly.ncbs.res.in/drosophila-media-preparation 获取。另将一组果蝇在羽化后置于持续白光照射（照度约2,000 lux）且温度维持在25 °C的冷却培养箱中培养。
  2. 通过将氯仿:甲醇:2.4 M盐酸按250:500:200（体积比）混合制备磷脂酰肌醇洗脱缓冲液（PEB）。通过将甲醇:1 M盐酸:氯仿按235:245:15（体积比）混合制备下层相洗涤缓冲液（LPWS）。通过将氯仿:甲醇:水按8:4:3（体积比）混合制备衍生化后洗涤溶液。
    注意：使用质谱级溶剂和试剂。PEB和LPWS缓冲液存放时间不得超过3个月。
  3. 检测磷脂酰肌醇类物质PI4P和PI(4,5)P2时使用C4柱（1.7 µm x 1 mm x 100 mm），检测磷脂酸（PA）、磷脂酰胆碱（PC）和磷脂酰肌醇（PI）时使用C18柱（1.0 mm x 100 mm x 1.7 mm）。进行NPLC-MRM-EPI分析时，使用硅胶柱（1 mm x 150 mm x 3 µm）。
  4. 为检测PA、PC和PI，将己烷:异丙醇:100 mM乙酸铵水溶液按68:30:2（体积比）混合配制流动相A，按70:20:10（体积比）混合配制流动相B。为检测磷脂酰肌醇类物质，将0.1%甲酸水溶液作为溶剂A，0.1%甲酸乙腈溶液作为溶剂B。

2. 组织的分离

  1. 使用二氧化碳（CO2）麻醉法收集每份样品10只果蝇（果蝇在数秒内即被固定），并在CO2麻醉板上用锋利刀片将果蝇断头。
  2. 将特定日龄（12–24小时龄）且处于暗适应或光适应状态的果蝇收集至1.5 mL离心管中，迅速在液氮中冷冻。将果蝇置于玻璃小瓶中，在-80 °C条件下用丙酮脱水48小时35。对于视网膜组织，从冻干的果蝇中收集100个视网膜。使用解剖刀将眼睛从头部其余部分分离，并挖出视网膜。
  3. 在进行磷脂酰肌醇PI4P和PI(4,5)P2分析时，若使用新鲜视网膜，则每份样品需取25个视网膜，其中用于检测光照条件下脂质水平的样品来自在适当光照条件下培养的果蝇，而用于检测暗处脂质水平的样品则来自在无光条件下培养的果蝇。将样品保存于含有50 µL 1× PBS的匀浆管中，并置于干冰上，直至进行提取。

3. 脂质提取

警告：氯仿是一种有毒溶剂，具有致癌性。它会影响生殖系统，并对皮肤和眼睛产生刺激作用。操作该化学品时应采取预防措施。所有涉及氯仿的步骤均应在通风良好的化学通风橱中进行。

  1. 除 PI4P 和 PI(4,5)P2 以外的所有甘油磷脂
    1. 对于每个样品，将 10 个果蝇头部或 100 个视网膜（按步骤 2.2 所述方法收集）在 0.1 mL 冰冷的 0.1 N 甲醇-HCl 溶液和 30 µL 内标混合物（PA (17:0/14:1)、PC (17:0/14:1)、溶血磷脂酸 (LPA; 13:0)、溶血磷脂酰胆碱 (LPC; 13:0)、LPC (17:1)、PA (17:0/17:0)、PA (16:0-D31/18:1)、LPA (17:1)、LPC (19:0)、PI (12:0/13:0)、PA (12:0/13:0) 和 PC (12:0/13:0)）中匀浆。配制标准品，使任何脂质标准品的最终含量均处于质谱仪线性响应曲线范围内。
    2. 使用可对所有样品进行快速且同步处理的自动匀浆器匀浆组织。在台式离心机中短暂离心管子，并确保未形成沉淀——这表明匀浆完全。将甲醇匀浆液转移至 2 mL 带盖微量离心管中。
    3. 加入 0.2 mL 冰冷的 0.1 N 甲醇-HCl 以回收管中残留物质，并合并至 2 mL 管中。加入 0.1 mL 冰冷的 0.1 N 甲醇-HCl，随后加入 0.8 mL 氯仿，并充分混匀。将含有组织匀浆的混合物置于冰上静置 10 分钟，然后加入 0.4 mL 0.88% KCl 溶液并涡旋 30 秒。
    4. 在 4 °C 条件下以 1,000 x g 离心 10 分钟，以分离水相和有机相。极其小心地取出含有脂质的下层有机相，避免与水相混合，并转移至新的 2 mL 微量离心管中。
      注意：在脂质提取过程中，务必格外小心地转移下层有机相，防止与水相混合，以免影响后续脂质分析。
    5. 在 4 °C 条件下使用真空蒸发仪干燥该脂质溶液，目视检查样品以确保完全干燥。用 420 µL 2:1 甲醇:氯仿混合液重悬，用于分析。样品应立即分析，避免储存。
  2. 针对磷脂酰肌醇磷酸酯 PI4P 和 PI(4,5)P2
    1. 将 25 个视网膜在 950 µL 磷脂酰肌醇洗脱缓冲液（PEB；250 mL CHCl3、500 mL 甲醇和 200 mL 2.4 M HCl）中匀浆，并加入内标混合物（磷脂酰乙醇胺 (PE) 17:0/14:1；PI (17:0/14:1)；PI4P (17:0/20:4)；PI(4,5)P2 (16:0/16:0)），每份样品含 50 ng PI、25 ng PI4P、50 ng PI(4,5)P2 和 0.2 ng PE。
    2. 依次加入各 250 µL 氯仿和 2.4 M HCl，随后超声处理 2 分钟，并在 4 °C 条件下以 1,000 x g 离心 5 分钟以实现相分离。将下层有机相转移至新管中，用 900 µL LPWS 洗涤，并在 4 °C 条件下以 1,000 x g 离心 5 分钟。
    3. 对剩余的水相再次执行步骤 3.2.2 中的相分离操作以提取脂质。在 4 °C 条件下使用真空离心浓缩仪干燥收集的有机相，并目视检查样品以确保完全干燥。

4. 有机磷酸盐测定

  1. 配制 7.34 mM KH 的储备液2PO4使用蒸馏水在微量离心管中进行标准稀释，具体操作如下 表1轻轻涡旋混匀各管，然后将标准品稀释液转移至无磷酸盐的玻璃管中。
  2. 准备一组单独的玻璃试管，分别装入脂质样品。优化脂质样品的体积，使其在完成本方案后的630 nm处吸光度处于标准KH的范围内2PO4 （即 0 到 20 倍）
  3. 将含有标准稀释液的玻璃试管在120 °C加热至完全干燥。取八分之一的脂质样品，放入玻璃试管中，同样在120 °C加热至完全干燥。th 所需总样品体积，以使吸光度处于标准 KH 的范围内2PO4在90 °C下完全干燥。
  4. 向所有试管中加入 50 μL 70% 高氯酸，于 180 °C 加热 30 分钟。将试管冷却至室温。每支试管中加入 250 μL 水、50 μL 2.5% 钼酸铵和 50 μL 10% 抗坏血酸。
    注意：2.5% 钼酸铵和 10% 抗坏血酸为质量/体积浓度，需新鲜配制，可在 4 °C 保存至多 1 周。
  5. 将试管置于37 °C摇床培养箱中孵育1小时。取130 μL样品加入96孔板中，使用分光光度计在630 nm处测定吸光度。

5. 衍生化

警告：据报道，三甲基硅基重氮甲烷（TMSD）对人体具有多种毒理学效应。TMSD 溶液可损害肾脏、肝脏、胃肠道、骨骼肌、中枢神经系统以及呼吸和生殖系统。操作该化学品时应采取极端预防措施。整个操作过程必须在通风良好的化学通风橱中进行。

  1. 向步骤3.2.3结束时获得的样品的下层有机相中加入50 µL的2 M TMSD。在室温下以250 rpm持续振荡反应10分钟。10分钟后，加入10 µL冰醋酸以终止反应，溶液中黄色消失即表明反应已淬灭。
  2. 轻敲离心管并小心打开，以释放淬灭反应过程中产生的N2气体。待N2气体完全逸出后，关闭管盖并短暂离心。随后，向管中加入600 µL衍生化后洗涤液，在250 rpm的混合器中涡旋振荡2分钟。
  3. 弃去上层形成的约400 µL液相。重复步骤5.2，彻底弃去全部上层液相，向下层液相中加入50 µL 90%甲醇并充分混匀。
  4. 将样品置于离心浓缩仪中，在真空条件下以800 × g离心干燥2小时。干燥后，每管应残留约20 µL样品。加入180 µL 100%甲醇，充分混匀后于4 °C保存，可在LC-MS/MS分析前保存2–3天。

6. 数据采集与分析

  1. 直接进样质谱（DIMS）中的数据采集
    注意：质谱分析可通过直接进样或液相色谱-质谱（LC-MS）方法进行。本节描述基于直接进样的质谱分析方法。
    1. 实验开始前，按照仪器制造商的说明对质谱仪进行校准。
    2. 对合成标准品的稀释系列生成线性响应曲线，并根据仪器的线性响应情况稀释样品，使脂质分析物的信号强度处于仪器的线性范围内。使用2:1甲醇:氯仿（体积比）混合液稀释总脂质提取物或脂质标准品。针对每个实验，分别选择总脂质提取物和合成标准品的稀释倍数。
    3. 将提取物和标准品转移至各自的样品瓶中。转移样品至质谱样品瓶时避免产生气泡。气泡会在色谱柱中产生高压，干扰脂质分析。
    4. 分析前，将样品在6,440 × g 条件下离心9分钟，然后转移至96孔板中，并用铝箔密封。
    5. 采用高分辨质谱仪通过直接进样法进行质谱分析。使用带有直径为4.1 µm喷雾喷嘴的机器人纳流电离源，实现甘油磷脂类化合物稳定的电喷雾电离（ESI）。
    6. 使用定制的质谱仪软件控制电离源，设定正离子模式和负离子模式下的电离电压分别为+1.2 kV和-1 kV；两种模式下的背压均为1 psi；离子传输毛细管温度为180 °C。质谱采集时的分辨率设定为Rm/z400 = 100,000。设置质谱仪参数的软件界面详见图2A。
    7. 将干燥的总脂质提取物重新溶解于400 µL氯仿:甲醇（1:2）溶液中。分析时，取60 µL样品加入96孔板电离源中，并用铝箔密封。每份样品在正离子模式下分析20分钟，用于检测磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰乙醇胺（PE）、醚键连接的磷脂酰乙醇胺（PE-O）、神经酰胺（Cer）和神经酰胺磷酸（Cer-P）。
    8. 在负离子模式下独立进行20分钟的数据采集，以检测磷脂酸（PA）和磷脂酰肌醇（PI）。高分辨质谱数据采集的具体仪器设置以及包含在数据依赖性采集（DDA）设置中的PA物种靶向列表详见图2B。
      注意：DDA方法设置的软件界面如图2C所示。本方法中靶向的PA分子列表见表2。DDA方法实验结果的截图如图2D所示。
  2. 直接进样质谱（DIMS）中的数据分析
    注意：所有类型质谱仪产生的质谱数据均需借助自动化脂质分析平台进行分析。LipidXplorer36 是一种非商业软件，支持所有类型的DIMS脂质实验。该软件可在此处获取： https://www.mpi-cbg.de/research-groups/current-groups/andrej-shevchenko/projects/lipidxplorer/
    1. 使用步骤6.1所述方法获取数据后，通过匹配单一同位素峰的m/z值及其相应的元素组成约束条件，在脂质分析平台中鉴定脂质物种。数据导入示例如图3A所示。将质量容差设为10 ppm，强度阈值根据质谱仪软件报告的噪声水平设定。
    2. 导入数据后，基于PA的化学结构（见图3B），在脂质分析平台中编写针对PA的分子碎片查询语言（MFQL）查询。MFQL在脂质分析平台中的设置详见图3C。
    3. 采用类似方法，在脂质分析平台软件中为其他甘油磷脂类化合物编写MFQL查询。每个查询针对一个脂质类别，多个查询可在一次运行中同时使用。
    4. 点击运行按钮执行所有MFQL查询。所有鉴定出的脂质物种将以.csv文件格式输出至单一结果文件中，包含相应前体离子和/或碎片离子的丰度信息，用于后续脂质定量分析。输出结果示例见表3。

7. 衍生化样品的液相色谱串联质谱分析

  1. 使用超高效液相色谱系统，通过液相色谱法分离步骤5.4中获得的样品。在选择该系统时，需确保其软件能够与用于分析的质谱仪软件相整合。
  2. 将系统连接至三重四极杆质谱仪。选择分离柱：对于PI4P和PI(4,5)P2以外的脂质分离，选用C18柱（1.0 mm × 100 mm × 1.7 mm）；对于PI4P和PI(4,5)P2，则选用尺寸为300 Å（1.0 mm × 100 mm × 1.7 µm）的C4柱。
  3. 通过先将甲酸铵溶解于质谱级水中，再溶于有机溶剂，配制含甲酸铵的流动相。对所有用于质谱分析的溶剂进行20分钟超声处理，以去除气泡。
  4. 使用含水+0.1%甲酸的溶液A和含乙腈+0.1%甲酸的溶液B对色谱柱进行平衡。
  5. 将液相色谱系统洗脱出的组分（进样体积范围为1–20 µL）注入质谱仪进行分析。设定流速为0.1 mL/min，色谱柱温度为室温。将色谱柱洗脱出的全部体积注入质谱仪。
  6. 在样品进样序列中，始终以空白溶剂（甲醇）进样开始，并在生物样品之间间歇插入纯净的标准品样品，用于质谱运行过程中的质量控制检查（每第六次运行一次）。
  7. 对于混合型三重四极杆离子阱质谱仪的实验设置，在开始实验前，按照制造商说明对质谱仪进行校准。针对PA、PC和PI，采用电喷雾电离（ESI）生成离子，并在正离子模式下检测带正电荷的脂质种类。使用系统配套的数据分析软件采集并分析数据。
  8. 根据所用的相应内标物优化分析参数。质谱仪参数如下：驻留时间 = 30 ms；CAD（碰撞活化解离）= 3 psi；GS1（源气体1）= 24 psi，GS2（源气体2）= 21 psi；CUR（帘气）= 30 psi；IS（ESI电压）= 4.5 kV；TEM（源温度）= 450 °C。
  9. 对于PI4P和PI(4,5)P2，使用质谱仪的正离子模式。质谱仪参数如下：驻留时间 = 65 ms；CAD（碰撞活化解离）= 2 psi；GS1（源气体1）和GS2（源气体2）= 20 psi；CUR（帘气）= 37 psi；IS（ESI电压）= 5.2 kV；TEM（源温度）= 350 °C。

8. 正相液相色谱-多反应监测-增强型产物离子扫描质谱法（NPLC-MRM-EPI MS）

  1. 色谱条件
    1. 采用正相液相色谱法，使用硅胶柱，能够将磷脂酸（PA）与其他磷脂分离。以正己烷:异丙醇:100 mM 水相 NH4COOH 按体积比 68:30:2 作为流动相 A，异丙醇:正己烷:100 mM 水相 NH4COOH 按体积比 70:20:10 作为流动相 B。
      注：该组合可实现不同分子种类 PA 的最佳分离效果和峰选择性。
    2. 根据参考化合物（内标）的色谱行为（包括分辨率和峰形），选择最优条件。
    3. 在超高效液相色谱系统上，使用正相硅胶柱（1 mm × 150 mm × 3 µm），于室温下进行色谱分离。自动进样器进样体积设为 6 µL，洗脱液流速设为 210 µL/min。
    4. 用 100% 流动相 A 平衡 5 分钟后，在 5 分钟内将流动相 B 线性增加至 30%，再在 5 分钟内升至 80%，随后在 5 分钟内升至 100%，并在 100% 条件下保持 5 分钟。最后，重新平衡色谱柱 9 分钟。
  2. 质谱分析
    1. 使用在负离子电喷雾电离（ESI）模式下运行的混合型三重四极杆-离子阱质谱仪。通过配套的分析软件控制仪器操作和数据采集。实验开始前，按照制造商说明对质谱仪进行校准。
    2. 利用内标混合物进行流动注射分析，优化离子源参数。设定喷雾电压为 -4.5 kV，源温度（TEM）为 450 °C，碰撞活化解离气（CAD）为 3 psi。使用氮气作为碰撞气，雾化气（GS1）设为 24 psi，辅助气（GS2）设为 21 psi，帘气（CUR）设为 30 psi。
    3. 根据内标混合溶液的连续进样结果，设定依赖于化合物的离子通道参数：去簇电位（DP）= -42 V，入口电位（EP）= -6 V，碰撞池出口电位（CXP）= -12 V。使用质谱仪中可用的EPI扫描功能，记录全产物离子谱图以及前体离子到产物离子的多反应监测（MRM）跃迁，并在 12 eV 至 40 eV 范围内变化碰撞能量（CE），用于碎片分析。
      注：基于MRM触发的IDA-EPI模式可同时记录前体离子-产物离子扫描及实时MS/MS数据采集。MRM通过四极杆1（Q1）缩小了离子扫描范围，而离子阱增强了穿过Q2的碎片离子信号，从而显著提升了四极杆MS/MS的定性能力，尤其有利于捕获前体离子产生的全部碎片离子。在EPI模式下，多个由前体离子产生的碎片离子可在Q3中以更高的信噪比被检测到。
    4. 进行MRM实验时，设定碰撞能量（CE）为39 eV，以获得高灵敏度。将MRM通道最大数量限制为75，驻留时间设为30 ms，以便在运行期间检测并记录任何特定分子从色谱柱洗脱时的MRM信号。这有助于提高仪器的占空比。
    5. 如上所述，通过实验调谐确定PA的最佳电离参数。本实验中设定喷雾电压为 -4.5 kV，源温度（TEM）为 450 °C，碰撞活化解离气（CAD）为 3 psi。使用氮气作为碰撞气，雾化气（GS1）设为 24 psi，辅助气（GS2）设为 21 psi，帘气（CUR）设为 30 psi。
    6. 手动检查所有调谐数据，确保电离参数和产物离子选择恰当。在选择产物离子时，应尽量减少不同MRM通道之间的潜在干扰。用于分析所有PA分子种类的实验参数见表4。
      注：混合型三重四极杆-线性离子阱质谱仪使我们能够将MRM扫描模式与离子阱扫描功能相结合，从而利用EPI扫描等方法实现快速且高灵敏度的串联质谱数据采集，记录每个检测到的前体离子的有用二级质谱图。在本研究中，为鉴定不同的PA分子种类，我们采用了基于传统三重四极杆离子路径并结合离子阱EPI扫描特性的MRM-EPI型MS/MS方法，由分析软件进行控制。

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结果

质谱中测量线性的确定。线性是指质谱方法提供的结果与脂质分析物浓度成正比的能力。线性取决于（a）脂质分析物的电离效率，以及（b）在不同浓度下脂质分析物的电离行为，后者与所使用的离子源有关。在本研究采用的电喷雾电离（ESI）中，线性在较低浓度范围内成立，具体取决于（a）离子从ESI源到质量分析器的传输效率，以及（b）质量分析器的设计和检测器信号的线性特性。每次实验均需使用被分析分子的内标物来评估线性。作为示例数据集，图4展示了在浓度跨越两个数量级的范围内，DIMS实验中PA（12:0/13:0）标准品的线性响应情况。

DIMS 方法。 图 5 展示了利用全局 DIMS 方法从野生型 Drosophila 中检测并定量的所有脂质类别。Y 轴表示摩尔百分比，该值通过计算每个脂质类别中检测到的所有分子种类总和得出，总脂质中各类脂质所占百分比显示在 ...

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讨论

大量证据表明，信号脂质在调控细胞结构与功能方面具有多种作用 果蝇 光感受器。除了脂质在调控光转导中已被广泛研究的作用之外3信号脂质还参与蛋白质运输和亚细胞结构的组织23,30,39,40,41这些研究得益于已建立完善的生理学方法42 和遗传分析43 光感受器功能在 果蝇 模型系统。然而，为了充分理解脂质分子的功能 果蝇 感光细胞，还需要采用能够在不同生理条件下（例如，黑暗与光照）检测并量化感光细胞中脂质水平的方法，以及在相关情况下 果蝇 预测会影响信号脂质代谢和感光细胞生理学的突变体。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究工作得到了印度原子能部（项目编号：RTI 4006）、印度生物技术部（BT/PR4833/MED/30/744/2012）以及印度联盟高级研究员项目（IA/S/14/2/501540）对PR的资助。我们感谢NCBS质谱平台，特别是Dhananjay Shinde博士以及PR实验室成员在开发这些方法过程中所做出的贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.1 N 甲醇 HCl用于总脂质提取
0.88% KClSigma AldrichP9541用于总脂质提取
1.5 ml / 2 ml LoBind Eppendorf 管Eppendorf022431081/022431102用于总脂质提取
2.3.18 16:0/18:1 二醚磷脂酰乙醇胺Avanti 极性脂质999974脂质内标
37% 纯度的 HClSigma Aldrich320331用于总脂质提取
96孔板总有机磷酸盐测定
丙酮Fisher Scientific32005用于解剖
钼酸铵总有机磷酸盐测定
抗坏血酸总有机磷酸盐测定
超声波清洗机
BEH300 C18 色谱柱 [1.0 mm × 100 mm × 1.7 mm]Waters India Pvt. Ltd.186002352液相色谱
刀片架精细科学工具10052-11用于解剖
BOD 培养箱总有机磷酸盐测定
可断裂刀片精细科学工具10050-00用于解剖
黄油纸GE 医疗10347671用于解剖
C4, 300 A0, [1.7 μm × 1 mm × 100 mm] 柱Waters India Pvt. Ltd.186004623液相色谱
带衬管的棕色玻璃色谱小瓶默克27083-U
d18:1/17:0Avanti 极性脂质860517脂质内标
d5-磷脂酰肌醇3,5-二磷酸 [PI(3,5)P2]-16:0/16:0Avanti 极性脂质850172脂质内标
体视显微镜OlympusSZ51用于解剖
干热浴
洗脱液 A正己烷:异丙醇:100 mM 乙酸铵水溶液（68:30:2），用于液相色谱
洗脱液B正己烷:异丙醇:100 mM 乙酸铵水溶液 (70:20:10)，用于液相色谱
滤纸Indica-HM274039用于解剖
烧瓶硼硅酸盐用于解剖
果蝇NANARaghu Padinjat 实验室
果蝇培养基NANANCBS 实验室培养基配方：玉米粉 80 g/L，D-葡萄糖 20 g/L，蔗糖 40 g/L，琼脂 8 g/L，酵母提取物 15 g/L，丙酸 4 mL，对羟基苯甲酸甲酯（TEGO）0.7 g/L，正磷酸 0.6 mL
镊子精细科学工具11254-20用于解剖
通风橱
漏斗硼硅酸盐用于解剖
冰醋酸Fisher ScientificA35-500用于衍生化
玻璃瓶：透明色和琥珀色用于总脂质提取
耐高温无磷玻璃管总有机磷酸盐测定
含氧化锆珠的匀浆管用于总脂质提取
匀浆仪Precellys
加湿的 CO₂2 连接至果蝇培养垫用于果蝇操作
光照可控培养箱松下三洋MIR-553用于果蝇培养
初始有机混合物甲醇：氯仿（2:1），用于总脂质提取
LC-MS级氯仿Sigma Aldrich650498用于总脂质提取
LC-MS级甲醇Sigma Aldrich34860用于总脂质提取
LC-MS级水Sigma Aldrich34877用于总脂质提取
光度计HTC 仪器LX-103
低吸附吸头Eppendorf0030072006/72014/72022/72030用于总脂质提取
LTQ Orbitrap XL 仪器赛默飞世尔科技，德国不来梅
溶血磷脂酸（LPA）- 13:0Avanti 极性脂质LM-1700脂质内标
溶血磷脂酸（LPA）- 17:1Avanti 极性脂质LM 1701脂质内标
溶血磷脂酰胆碱（LPC）-13:0Avanti 极性脂质LM-1600脂质内标
溶血磷脂酰胆碱（LPC）-17:1Avanti 极性脂质855677脂质内标
溶血磷脂酰胆碱（LPC）- 19:0Avanti 极性脂质855776脂质内标
高氯酸总有机磷酸盐测定
磷酸盐标准品 磷酸二氢钾总有机磷酸盐测定
磷酸盐缓冲液（PBS）NANA成分：137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4 和 1.8 mM KH2PO4，pH 7.4
磷脂酸（PA）- 12:0/13:0Avanti 极性脂质，LM-1400 脂质内标
磷脂酸（PA）- 17:0/14:1Avanti 极性脂质LM-1404脂质内标
磷脂酸（PA）-(17:0/17:0)Avanti 极性脂质830856脂质内标
磷脂酸（PA）-16:0-D31/18:1Avanti 极性脂质860453脂质内标
磷脂酰胆碱（PC）-12:0/13:0Avanti 极性脂质LM-1000脂质内标
磷脂酰胆碱（PC）- 17:0/14:1Avanti 极性脂质LM-1004脂质内标
磷脂酰乙醇胺（PE）- 17:0/14:1Avanti 极性脂质LM-110脂质内标
磷脂酰肌醇 (PI) - 17:0/14:1Avanti 极性脂质LM-1504脂质内标
磷脂酰肌醇4,5-二磷酸 [PI(4,5)P2)]-17:0/20:4Avanti 极性脂质LM-1904脂质内标
磷脂酰肌醇-4-磷酸（PI4P）- 17:0/20:4Avanti 极性脂质LM-1901脂质内标
机器人纳流离子源TriVersa NanoMate（Advion BioSciences，美国纽约州伊萨卡）
Rotospin 仪器Tarsons3090X
硅胶垫用于解剖
溶剂A水相中含0.1%甲酸，用于液相色谱
溶剂B乙腈中含0.1%甲酸，用于液相色谱
台式离心机
恒温混匀仪
TMS-重氮甲烷阿克罗斯AC385330050用于衍生化
三重四极杆质谱仪AB SciexQTRAP 6500
超高效液相色谱系统Waters Acquity
真空离心浓缩仪Scanvac，Labogene
涡旋混合器

参考文献

  1. Hardie, R. C. C., Raghu, P. Visual transduction in Drosophila. Nature. 413 (6852), 186-193 (2001).
  2. Raghu, P., Yadav, S., Mallampati, N. B. N. Lipid signaling in Drosophila photoreceptors. Biochimica et Biophysica Acta. 1821 (8), 1154-1165 (2012).
  3. Hardie, R. C. TRP channels and lipids: from Drosophila to mammalian physiology. The Journal of Physiology. 578 (1), 9-24 (2007).
  4. Fuchs, B., Süss, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. Lipid analysis by thin-layer chromatography--a review of the current state. Journal of Chromatography. A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).
  5. Tang, B., Row, K. Development of gas chromatography analysis of fatty acids in marine organisms. Journal of Chromatographic Science. 51 (7), 599-607 (2013).
  6. Kinsey, C., et al. Determination of lipid content and stability in lipid nanoparticles using ultra high-performance liquid chromatography in combination with a Corona Charged Aerosol Detector. Electrophoresis. , (2021).
  7. Gandhi, A. S., Budac, D., Khayrullina, T., Staal, R., Chandrasena, G. Quantitative analysis of lipids: a higher-throughput LC-MS/MS-based method and its comparison to ELISA. Future Science OA. 3 (1), 157(2017).
  8. Ouldamer, L., et al. NMR-based lipidomic approach to evaluate controlled dietary intake of lipids in adipose tissue of a rat mammary tumor model. Journal of Proteome Research. 15 (3), 868-878 (2016).
  9. Li, L., et al. Mass spectrometry methodology in lipid analysis. International Journal of Molecular Sciences. 15 (6), 10492-10507 (2014).
  10. Welti, R., Wang, X. Lipid species profiling: a high-throughput approach to identify lipid compositional changes and determine the function of genes involved in lipid metabolism and signaling. Current Opinion in Plant Biology. 7 (3), 337-344 (2004).
  11. Köfeler, H. C., Fauland, A., Rechberger, G. N., Trötzmüller, M. Mass spectrometry based lipidomics: an overview of technological platforms. Metabolites. 2 (1), 19-38 (2012).
  12. Schwudke, D., Liebisch, G., Herzog, R., Schmitz, F., Shevchenko, A. Shotgun lipidomics by tandem mass spectrometry under data-dependent acquisition control. Methods in Enzymology. 433, 175-191 (2007).
  13. Ejsing, C., et al. Automated identification and quantification of glycerophospholipid molecular species by multiple precursor ion scanning. Analytical Chemistry. 78 (17), 6202-6214 (2006).
  14. Schwudke, D., et al. Top-down lipidomic screens by multivariate analysis of high-resolution survey mass spectra. Analytical Chemistry. 79 (11), 4083-4093 (2007).
  15. Carvalho, M., et al. Effects of diet and development on the Drosophila lipidome. Molecular Systems Biology. 8, 600(2012).
  16. Han, X., Gross, R. W. Global analyses of cellular lipidomes directly from crude extracts of biological samples by ESI mass spectrometry a bridge to lipidomics. Journal of Lipid Research. 44 (6), 1071-1079 (2003).
  17. Schwudke, D., et al. Lipid profiling by multiple precursor and neutral loss scanning driven by the data-dependent acquisition. Analytical Chemistry. 78 (2), 585-595 (2006).
  18. Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
  19. Fauland, A., et al. A comprehensive method for lipid profiling by liquid chromatography-ion cyclotron resonance mass spectrometry. The Journal of Lipid Research. 52 (12), 2314-2322 (2011).
  20. Schuhmann, K., et al. Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).
  21. Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography-mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical Biochemist. Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
  22. Blanksby, S. J., Mitchell, T. W. Advances in mass spectrometry for lipidomics. Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), Palo Alto, Calif. 433-465 (2010).
  23. Thakur, R., et al. Phospholipase D activity couples plasma membrane endocytosis with retromer dependent recycling. eLife. 5, 18515(2016).
  24. Donaldson, K. The inhalation toxicology of p-aramid fibrils. Critical Reviews in Toxicology. 39 (6), 487-500 (2009).
  25. Panda, A., et al. Functional analysis of mammalian phospholipase D enzymes. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
  26. Ghosh, A., Sharma, S., Shinde, D., Ramya, V., Raghu, P. A novel mass assay to measure phosphatidylinositol-5-phosphate from cells and tissues. Bioscience Reports. 39 (10), (2019).
  27. Balakrishnan, S. S., et al. Regulation of PI4P levels by PI4KIIIα during G-protein-coupled PLC signaling in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 131 (15), (2018).
  28. Masood, M. A., Yuan, C., Acharya, J. K., Veenstra, T. D., Blonder, J. Quantitation of ceramide phosphorylethanolamines containing saturated and unsaturated sphingoid base cores. Analytical Biochemistry. 400 (2), 259-269 (2010).
  29. Acharya, U., et al. Modulating sphingolipid biosynthetic pathway rescues photoreceptor degeneration. Science. 299 (5613), New York, N.Y. 1740-1743 (2003).
  30. Hebbar, S., Schuhmann, K., Shevchenko, A., Knust, E. Hydroxylated sphingolipid biosynthesis regulates photoreceptor apical domain morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 219 (12), (2020).
  31. Abhyankar, V., Kaduskar, B., Kamat, S. S., Deobagkar, D., Ratnaparkhi, G. S. Drosophila DNA/RNA methyltransferase contributes to robust host defense in aging animals by regulating sphingolipid metabolism. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 22 (2018).
  32. Subramanian, M., et al. Altered lipid homeostasis in Drosophila InsP3 receptor mutants leads to obesity and hyperphagia). DMM Disease Models and Mechanisms. 6 (3), 734-744 (2013).
  33. Guan, X. L., et al. Biochemical membrane lipidomics during Drosophila development. Developmental Cell. 24 (1), 98-111 (2013).
  34. Caravaca, J. M., Lei, E. P. Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (109), e53756(2016).
  35. Fujita, S. C., Inoue, H., Yoshioka, T., Hotta, Y. Quantitative tissue isolation from Drosophila freeze-dried in acetone. TheBiochemical Journal. 243 (1), 97-104 (1987).
  36. Herzog, R., et al. LipidXplorer: a software for consensual cross-platform lipidomics. PloS One. 7 (1), 29851(2012).
  37. Itoh, Y. H., Itoh, T., Kaneko, H. Modified Bartlett assay for microscale lipid phosphorus analysis. Analytical Biochemistry. 154 (1), 200-204 (1986).
  38. Hsu, F. F., Turk, J. Charge-driven fragmentation processes in diacyl glycerophosphatidic acids upon low-energy collisional activation. A mechanistic proposal. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 11 (9), 797-803 (2000).
  39. Acharya, J. K., et al. Cell-nonautonomous function of ceramidase in photoreceptor homeostasis. Neuron. 57 (1), 69-79 (2008).
  40. Dasgupta, U., et al. Ceramide kinase regulates phospholipase C and phosphatidylinositol 4, 5, bisphosphate in phototransduction. Proceeding of the National Academy of Science of the United States of America. 106 (47), 20063-20068 (2009).
  41. Yonamine, I., et al. Sphingosine kinases and their metabolites modulate endolysosomal trafficking in photoreceptors. The Journal of Cell Biology. 192 (4), 557-567 (2011).
  42. Katz, B., Gutorov, R., Rhodes-Mordov, E., Hardie, R., Minke, B. Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55627(2017).
  43. Pak, W. L. Drosophila in vision research. The Friedenwald Lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (12), 2340-2357 (1995).
  44. Shevchenko, A., Simons, K. Lipidomics: coming to grips with lipid diversity. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (8), 593-598 (2010).
  45. Garcia-Murillas, I., et al. lazaro encodes a lipid phosphate phosphohydrolase that regulates phosphatidylinositol turnover during Drosophila phototransduction. Neuron. 49 (4), 533-546 (2006).
  46. Raghu, P., et al. Rhabdomere biogenesis in Drosophila photoreceptors is acutely sensitive to phosphatidic acid levels. TheJournal of Cell Biology. 185 (1), 129-145 (2009).
  47. Ogiso, H., Suzuki, T., Taguchi, R. Development of a reverse-phase liquid chromatography electrospray ionization mass spectrometry method for lipidomics, improving detection of phosphatidic acid and phosphatidylserine. Analytical Biochemistry. 375 (1), 124-131 (2008).
  48. Raghupathy, R., et al. Transbilayer lipid interactions mediate nanoclustering of lipid-anchored proteins. Cell. 161 (3), 581-594 (2015).
  49. Randall, A. S., et al. Speed and sensitivity of phototransduction in Drosophila depend on degree of saturation of membrane phospholipids. The Journal of Neuroscience. 35 (6), 2731-2746 (2015).
  50. Schuhmacher, M., et al. Live-cell lipid biochemistry reveals a role of diacylglycerol side-chain composition for cellular lipid dynamics and protein affinities. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (14), 7729-7738 (2020).
  51. Raghu, P. Functional diversity in a lipidome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11191-11193 (2020).
  52. Khandelwal, N., et al. Fatty acid chain length drives lysophosphatidylserine-dependent immunological outputs. Cell Chemical Biology. 28 (8), 1169-1179 (2021).
  53. Piper, M. D. W., et al. A holidic medium for Drosophila melanogaster. Nature Methods. 11 (1), 100-105 (2014).
  54. Wang, F., et al. FlyVar: a database for genetic variation in Drosophila melanogaster. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2015, (2015).
  55. Hammond, G. R. V., Balla, T. Polyphosphoinositide binding domains: Key to inositol lipid biology. Biochimica et Biophysica Acta. 1851 (6), 746-758 (2015).
  56. Chakrabarti, P., et al. A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors. PLoS Genetics. 11 (1), 1004948(2015).
  57. Hardie, R. C., Liu, C. -H., Randall, A. S., Sengupta, S. In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).
  58. Yadav, S., Garner, K., Georgiev, P., Li, M., Gomez-espinosa, E. RDGB, a PI-PA transfer protein regulates G-protein coupled PtdIns (4, 5)P2 signalling during Drosophila phototransduction. Journal of Cell Science. 128 (17), 3330-3344 (2015).
  59. Unsihuay, D., Mesa Sanchez, D., Laskin, L. Quantitative Mass Spectrometry Imaging of Biological Systems. Annual Review of Physical Chemistry. 72, 307-329 (2021).

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