该论文提供了多功能、稳健且灵敏的质谱分析方案，用于鉴定和定量果蝇（Drosophila）光感受器中多个类别的脂质。
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该论文提供了多功能、稳健且灵敏的质谱分析方案，用于鉴定和定量果蝇（Drosophila）光感受器中多个类别的脂质。
磷脂酶Cβ（PLCβ）的激活是果蝇（Drosophila）光感受器中感觉转导过程的关键步骤。PLCβ的活性导致细胞膜脂质磷脂酰肌醇4,5-二磷酸[PI(4,5)P2]的水解，最终引发瞬时受体电位（TRP）和TRP类似（TRPL）通道的激活。PLCβ的活性还继而导致多种脂质分子的生成，其中一些已被提出在TRP和TRPL通道的激活中发挥作用。此外，已有研究提出多类脂质在组织光感受器细胞生物学结构方面发挥关键作用，以优化信号转导反应，实现高效的感觉转导。历史上，这些发现主要依赖于分离控制特定脂质水平的果蝇（Drosophila）突变体，并在这些突变体中进行光感受器生理学分析的能力。近年来，已开发出高灵敏度和高特异性的强大质谱技术，用于脂质的分离与定量分析。这些方法特别适用于果蝇（Drosophila）研究，使得目前无需放射性同位素标记即可对光感受器中的脂质进行分析。本文阐述了在果蝇（Drosophila）光感受器中对多种信号脂质进行稳健、灵敏且准确的定量评估时，脂质质谱分析在概念和实践上的考虑因素。结合现有的分子遗传学和生理学分析方法，此类脂质分析有望进一步增强光感受器作为生物学研究模型系统的应用价值。
Drosophila 中的光转导由 G 蛋白偶联的 PLCβ 级联反应介导，导致光激活通道 TRP 和 TRPL 的激活1。PLCβ 水解膜结合的磷脂磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸 [PI(4,5)P2]，生成二酰甘油（DAG）和肌醇 1,4,5-三磷酸（IP3）。随后，DAG 被 DAG 激酶磷酸化生成磷脂酸（PA）。接着，通过一系列涉及脂质中间产物生成的反应，PI(4,5)P2 得以再生2。该 PI(4,5)P2 循环中的多个组分在 Drosophila 光感受器中具有功能。PLC 激活导致 TRP 和 TRPL 通道门控的具体机制仍不明确。然而，多条证据表明，PI(4,5)P2 水解过程中产生的脂质中间产物可能介导了这一过程3。因此，鉴定并定量这些脂质中间产物对于阐明 Drosophila 光转导中 TRP 和 TRPL 通道的激活机制至关重要。除了在光转导本身中的作用外，脂质还在光感受器细胞结构组织中发挥多种重要功能（综述见3）。了解脂质的这些功能依赖于在活体（in vivo）中检测和定量其水平的能力。本文概述了从 Drosophila 光感....
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1. 果蝇的饲养与化学试剂的准备
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质谱中测量线性的确定。线性是指质谱方法提供的结果与脂质分析物浓度成正比的能力。线性取决于（a）脂质分析物的电离效率，以及（b）在不同浓度下脂质分析物的电离行为，后者与所使用的离子源有关。在本研究采用的电喷雾电离（ESI）中，线性在较低浓度范围内成立，具体取决于（a）离子从ESI源到质量分析器的传输效率，以及（b）质量分析器的设计和检测器信号的线性特性。每次实验均需使用被分析分子的内标物来评估线性。作为示例数据集，图4展示了在浓度跨越两个数量级的范围内，DIMS实验中PA（12:0/13:0）标准品的线性响应情况。
DIMS 方法。 图 5 展示了利用全局 DIMS 方法从野生型 Drosophila 中检测并定量的所有脂质类别。Y 轴表示摩尔百分比，该值通过计算每个脂质类别中检测到的所有分子种类总和得出，总脂质中各类脂质所占百分比显示在 .......
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大量证据表明，信号脂质在调控细胞结构与功能方面具有多种作用 果蝇 光感受器。除了脂质在调控光转导中已被广泛研究的作用之外3信号脂质还参与蛋白质运输和亚细胞结构的组织23,30,39,40,41这些研究得益于已建立完善的生理学方法42 和遗传分析43 光感受器功能在 果蝇 模型系统。然而，为了充分理解脂质分子的功能 果蝇 感光细胞，还需要采用能够在不同生理条件下（例如，黑暗与光照）检测并量化感光细胞中脂质水平的方法，以及在相关情况下 果蝇 预测会影响信号脂质代谢和感光细胞生理学的突变体。
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作者无任何利益冲突需要披露。
本研究工作得到了印度原子能部（项目编号：RTI 4006）、印度生物技术部（BT/PR4833/MED/30/744/2012）以及印度联盟高级研究员项目（IA/S/14/2/501540）对PR的资助。我们感谢NCBS质谱平台，特别是Dhananjay Shinde博士以及PR实验室成员在开发这些方法过程中所做出的贡献。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.1 N 甲醇 HCl | 用于总脂质提取 | ||
| 0.88% KCl | Sigma Aldrich | P9541 | 用于总脂质提取 |
| 1.5 ml / 2 ml LoBind Eppendorf 管 | Eppendorf | 022431081/022431102 | 用于总脂质提取 |
| 2.3.18 16:0/18:1 二醚磷脂酰乙醇胺 | Avanti 极性脂质 | 999974 | 脂质内标 |
| 37% 纯度的 HCl | Sigma Aldrich | 320331 | 用于总脂质提取 |
| 96孔板 | 总有机磷酸盐测定 | ||
| 丙酮 | Fisher Scientific | 32005 | 用于解剖 |
| 钼酸铵 | 总有机磷酸盐测定 | ||
| 抗坏血酸 | 总有机磷酸盐测定 | ||
| 超声波清洗机 | |||
| BEH300 C18 色谱柱 [1.0 mm × 100 mm × 1.7 mm] | Waters India Pvt. Ltd. | 186002352 | 液相色谱 |
| 刀片架 | 精细科学工具 | 10052-11 | 用于解剖 |
| BOD 培养箱 | 总有机磷酸盐测定 | ||
| 可断裂刀片 | 精细科学工具 | 10050-00 | 用于解剖 |
| 黄油纸 | GE 医疗 | 10347671 | 用于解剖 |
| C4, 300 A0, [1.7 μm × 1 mm × 100 mm] 柱 | Waters India Pvt. Ltd. | 186004623 | 液相色谱 |
| 带衬管的棕色玻璃色谱小瓶 | 默克 | 27083-U | |
| d18:1/17:0 | Avanti 极性脂质 | 860517 | 脂质内标 |
| d5-磷脂酰肌醇3,5-二磷酸 [PI(3,5)P2]-16:0/16:0 | Avanti 极性脂质 | 850172 | 脂质内标 |
| 体视显微镜 | Olympus | SZ51 | 用于解剖 |
| 干热浴 | |||
| 洗脱液 A | 正己烷:异丙醇:100 mM 乙酸铵水溶液（68:30:2），用于液相色谱 | ||
| 洗脱液B | 正己烷:异丙醇:100 mM 乙酸铵水溶液 (70:20:10)，用于液相色谱 | ||
| 滤纸 | Indica-HM2 | 74039 | 用于解剖 |
| 烧瓶 | 硼硅酸盐 | 用于解剖 | |
| 果蝇 | NA | NA | Raghu Padinjat 实验室 |
| 果蝇培养基 | NA | NA | NCBS 实验室培养基配方：玉米粉 80 g/L，D-葡萄糖 20 g/L，蔗糖 40 g/L，琼脂 8 g/L，酵母提取物 15 g/L，丙酸 4 mL，对羟基苯甲酸甲酯（TEGO）0.7 g/L，正磷酸 0.6 mL |
| 镊子 | 精细科学工具 | 11254-20 | 用于解剖 |
| 通风橱 | |||
| 漏斗 | 硼硅酸盐 | 用于解剖 | |
| 冰醋酸 | Fisher Scientific | A35-500 | 用于衍生化 |
| 玻璃瓶：透明色和琥珀色 | 用于总脂质提取 | ||
| 耐高温无磷玻璃管 | 总有机磷酸盐测定 | ||
| 含氧化锆珠的匀浆管 | 用于总脂质提取 | ||
| 匀浆仪 | Precellys | ||
| 加湿的 CO₂2 连接至果蝇培养垫 | 用于果蝇操作 | ||
| 光照可控培养箱 | 松下三洋 | MIR-553 | 用于果蝇培养 |
| 初始有机混合物 | 甲醇：氯仿（2:1），用于总脂质提取 | ||
| LC-MS级氯仿 | Sigma Aldrich | 650498 | 用于总脂质提取 |
| LC-MS级甲醇 | Sigma Aldrich | 34860 | 用于总脂质提取 |
| LC-MS级水 | Sigma Aldrich | 34877 | 用于总脂质提取 |
| 光度计 | HTC 仪器 | LX-103 | |
| 低吸附吸头 | Eppendorf | 0030072006/72014/72022/72030 | 用于总脂质提取 |
| LTQ Orbitrap XL 仪器 | 赛默飞世尔科技，德国不来梅 | ||
| 溶血磷脂酸（LPA）- 13:0 | Avanti 极性脂质 | LM-1700 | 脂质内标 |
| 溶血磷脂酸（LPA）- 17:1 | Avanti 极性脂质 | LM 1701 | 脂质内标 |
| 溶血磷脂酰胆碱（LPC）-13:0 | Avanti 极性脂质 | LM-1600 | 脂质内标 |
| 溶血磷脂酰胆碱（LPC）-17:1 | Avanti 极性脂质 | 855677 | 脂质内标 |
| 溶血磷脂酰胆碱（LPC）- 19:0 | Avanti 极性脂质 | 855776 | 脂质内标 |
| 高氯酸 | 总有机磷酸盐测定 | ||
| 磷酸盐标准品 磷酸二氢钾 | 总有机磷酸盐测定 | ||
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | NA | NA | 成分：137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4 和 1.8 mM KH2PO4，pH 7.4 |
| 磷脂酸（PA）- 12:0/13:0 | Avanti 极性脂质 | ，LM-1400 | 脂质内标 |
| 磷脂酸（PA）- 17:0/14:1 | Avanti 极性脂质 | LM-1404 | 脂质内标 |
| 磷脂酸（PA）-(17:0/17:0) | Avanti 极性脂质 | 830856 | 脂质内标 |
| 磷脂酸（PA）-16:0-D31/18:1 | Avanti 极性脂质 | 860453 | 脂质内标 |
| 磷脂酰胆碱（PC）-12:0/13:0 | Avanti 极性脂质 | LM-1000 | 脂质内标 |
| 磷脂酰胆碱（PC）- 17:0/14:1 | Avanti 极性脂质 | LM-1004 | 脂质内标 |
| 磷脂酰乙醇胺（PE）- 17:0/14:1 | Avanti 极性脂质 | LM-110 | 脂质内标 |
| 磷脂酰肌醇 (PI) - 17:0/14:1 | Avanti 极性脂质 | LM-1504 | 脂质内标 |
| 磷脂酰肌醇4,5-二磷酸 [PI(4,5)P2)]-17:0/20:4 | Avanti 极性脂质 | LM-1904 | 脂质内标 |
| 磷脂酰肌醇-4-磷酸（PI4P）- 17:0/20:4 | Avanti 极性脂质 | LM-1901 | 脂质内标 |
| 机器人纳流离子源 | TriVersa NanoMate（Advion BioSciences，美国纽约州伊萨卡） | ||
| Rotospin 仪器 | Tarsons | 3090X | |
| 硅胶垫 | 用于解剖 | ||
| 溶剂A | 水相中含0.1%甲酸，用于液相色谱 | ||
| 溶剂B | 乙腈中含0.1%甲酸，用于液相色谱 | ||
| 台式离心机 | |||
| 恒温混匀仪 | |||
| TMS-重氮甲烷 | 阿克罗斯 | AC385330050 | 用于衍生化 |
| 三重四极杆质谱仪 | AB Sciex | QTRAP 6500 | |
| 超高效液相色谱系统 | Waters Acquity | ||
| 真空离心浓缩仪 | Scanvac，Labogene | ||
| 涡旋混合器 |
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