本方案描述了三尖瓣瓣叶的双轴力学表征、基于偏振空间频域成像的胶原定量以及显微解剖方法。所提供的方法阐明了瓣叶各层如何共同影响整体瓣叶的功能特性。
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本文内容
摘要
摘要
三尖瓣（TV）调控着未氧合血液从右心房单向流入右心室。三尖瓣由三个瓣叶构成，每个瓣叶具有独特的力学行为。通过研究其四个解剖层次——心房层（A）、疏松层（S）、纤维层（F）和心室层（V），可进一步理解这三个三尖瓣瓣叶之间的差异。尽管这四个层次在所有三个三尖瓣瓣叶中均存在，但它们在厚度和微观结构成分上的差异进一步影响了各自特有的力学行为。
本方案包含四个步骤，以阐明各层之间的特异性差异：（i）表征完整三尖瓣瓣叶的力学性能及胶原纤维结构行为；（ii）分离三尖瓣瓣叶的复合层（A/S层和F/V层）；（iii）对分离后的复合层进行相同的表征；（iv）执行 事后 组织学评估。该实验框架能够直接比较完整的三尖瓣（TV）组织与其各个组成层。因此，利用本方案可获取有关三尖瓣瓣叶微结构和生物力学功能的详细信息。这些信息有望用于构建三尖瓣的计算模型，以期为三尖瓣疾病的临床治疗提供指导。
引言
三尖瓣位于心脏的右心房与右心室之间。在整个心动周期中，三尖瓣通过前瓣叶（TVAL）、后瓣叶（TVPL）和隔瓣叶（TVSL）的周期性开闭，调控血液的单向流动。这些瓣叶结构复杂，具有四层不同的解剖结构——心房层（A）、疏松层（S）、纤维层（F）和心室层（V）——每层均含有独特的微观结构成分。心房层和心室层中的弹性纤维有助于组织在机械负荷后恢复至未变形的几何形态1。相比之下，纤维层含有致密的波浪状胶原纤维网络，赋予瓣叶承受负荷的能力2。疏松层主要由糖胺聚糖组成，被认为可在心脏瓣膜功能过程中促进瓣叶各层之间的剪切滑动3。尽管这三种瓣叶均具有相同的解剖层次，但各层的厚度及成分比例存在差异，从而影响不同瓣叶特有的力学行为。
研究人员已通过平面力学表征、组织形态学评估以及胶原纤维结构的光学表征等方法，探索了三尖瓣（TV）瓣叶的特性。例如，平面双轴力学表征通过在组织上施加相互垂直的位移并记录相应的力，以模拟生理载荷条件。由此获得的力-位移（或应力-伸长率）数据表明，所有三个三尖瓣瓣叶均表现出非线性、方向特异性的力学行为，且在径向组织方向上表现出更为明显的瓣叶特异性响应4,5,6....
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方案
本文所述所有方法均经俄克拉荷马大学机构动物护理和使用委员会批准。动物组织取自美国农业部批准的屠宰场。
1. 双轴力学表征
- 组织制备
- 从冰箱中取出TV小叶、剃须刀片、外科记号笔、镊子、装有去离子水（DI水）的移液器以及切割垫。用2-3滴室温去离子水使TV小叶解冻。
注意：使用去离子水而非磷酸盐缓冲液（PBS），以避免 PBS 对切片显微切割造成的干扰。 - 将样本平放在切割垫上，使心室面（即带有腱索附着的表面）朝上。调整样本位置，使其径向方向与 Y-方向与周向对齐 X方向。
注意：周向沿瓣膜的圆周方向排列。 - 检查组织的腱索附着位置。选择一个理想约为 12 x 12 mm 的区域，该区域应尽量减少大腱索的附着，同时避开过薄（即透明）的区域。图1).
- 将样本翻转，使心房面（即无腱索附着的一面）朝上。确保瓣叶的周向和径向方向保持与原方向一致。 X- 和 Y-轴，分别。
- 从步骤1.1.3中确定的避开大型腱索附着处或薄弱区域的瓣叶组织上，裁剪出一块12 mm × 12 mm的方形样本。用镊子移除修剪下来的瓣叶组织碎片，并将其放入废料容器中。
- 如....
- 从冰箱中取出TV小叶、剃须刀片、外科记号笔、镊子、装有去离子水（DI水）的移液器以及切割垫。用2-3滴室温去离子水使TV小叶解冻。
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结果
显微解剖将获得厚度相对均匀的A/S和F/V样本，可将其安装至（商用）双轴测试装置上。对完整小叶及两个解剖分层进行组织学分析，可验证组织是否沿海绵层与纤维层之间的边界被正确分离（图7）。此外，可利用ImageJ软件分析组织学显微图像，以测定各组织层的厚度及组分质量分数。当解剖所得A/S样本过小而无法固定于双轴测试仪时，即视为解剖失败。此类情况最常发生在剥离过程中A/S发生撕裂，或因腱索过厚导致F/V层出现孔洞。
位移控制的力学测试及后续处理可生成描述组织非线性力学行为的应力-应变数据（图8）。样品通常具有各向异性，其中周向组织方向的力学响应比径向组织方向更刚硬。表格 1）。这些低抗拉性和高抗拉性能可通过附加的分析技术进行定量测定。6,14综合评估双轴力比率的范围可进一步揭示组织的方向.......
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讨论
该方案的关键步骤包括：（i）分层显微解剖，（ii）组织包埋，（iii）定位标记物放置，以及（iv）pSFDI装置设置。其中，适当的分层显微解剖是本方法最重要且最具挑战性的环节。在开展使用该技术的研究之前，解剖操作者应长期练习显微解剖技术，并熟练掌握全部三种腱索瓣叶（TV leaflets）的处理。操作者应确保所获取的复合层组织样本足够大（>3.3 mm），且厚度均匀。应通过组织学方法确认每次解剖均能实现准确的层次分离。
进行组织安装时，必须将组织固定在双轴测试仪上，确保组织平整，无任何人为拉伸或皱褶。这些误差将导致力学数据不准确。由于复合层更薄，因此更容易出现此类误差。在粘贴标记点时，必须确保标记点位于组织中央三分之一区域内，且彼此之间不发生粘连。标记点位置不当将导致组织拉伸程度的量化结果不准确。最后，pSFDI投影光的亮度必须谨慎选择，并在完整组织及其复合层的测量过程中保持不变。若亮度发生变化，则无法对完整组织与其复合层的pSFDI结果进行比较。
本文所述方法的灵活性主要体现在双轴力学表征方面，而大多数问题的出现则集中在基于.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究工作得到了美国心脏协会科学家发展基金（16SDG27760143）和长老会健康基金会的资助。KMC 部分得到了俄克拉荷马大学（OU）本科生研究机会计划和荣誉研究学徒计划的支持。DWL 部分得到了美国国家科学基金会研究生研究奖学金（GRF 2019254233）以及美国心脏协会/儿童心脏基金会博士前奖学金（奖项编号 #821298）的支持。谨此对上述所有资助表示衷心感谢。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 中性缓冲10%福尔马林溶液 | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
| Alconox清洗剂 | Alconox | 清洁化合物 | |
| BioTester - 双轴拉伸测试仪 | CellScale生物材料测试公司 | 1.5 N 负荷传感器容量 | |
| 切割垫 | Dahle | B0027RS8DU | |
| 去离子水 | 不适用 | ||
| 细尖工具 | HTI INSTRUMENTS | NSPLS-12 | |
| 弯头镊子 | Scientific Labwares | 16122 | |
| 粗头镊子 | Scientific Labwares | 161001078 | |
| 细头镊子 | Scientific Labwares | 16127 | |
| LabJoy | CellScale生物材料测试公司 | 版本 10.66 | |
| 激光位移传感器 | Keyence | IL-030 | |
| 液态氰基丙烯酸酯胶水 | Loctite | 2436365 | |
| MATLAB | MathWorks | 版本 2020a | |
| 微型剪刀 | HTI Instruments | CAS55C | |
| 移液器 | Belmaks | 360758081051Y4 | |
| 偏振空间频率域成像装置 | 不适用 | 自制设备，使用数字光投影仪、线性偏振片、旋转偏振片支架和电荷耦合器件相机组装而成。 更多细节请参见 doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028 (PMCID: PMC8101699)。 | |
| 手术刀 | THINKPRICE | TP-SCALPEL-3010 | |
| 单刃工业剃须刀片（外科级碳素钢） | VWR International | H3515541105024 | |
| 外科标记笔 | LabAider | LAB-Skin-6 | |
| T型销钉 | Business Source | BSN32351 | |
| 石蜡板 | 不适用 | 自制，使用造型蜡和烤盘制作 | |
| 称量舟 | Pure Ponta | mdo-azoc-1030 |
参考文献
- Vesely, I. The role of elastin in aortic valve mechanics. Journal of Biomechanics. 31 (2), 115-123 (1998).
- Zhang, W., Ayoub, S., Liao, J., Sacks, M. S. A meso-scale layer-specific structural constitutive model of the mitral heart valve leaflets. Acta Biom....
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重印与许可
