三尖瓣瓣叶分层显微切割用于双轴力学表征与微观结构定量分析

摘要

本方案描述了三尖瓣瓣叶的双轴力学表征、基于偏振空间频域成像的胶原定量以及显微解剖方法。所提供的方法阐明了瓣叶各层如何共同影响整体瓣叶的功能特性。

摘要

三尖瓣（TV）调控着未氧合血液从右心房单向流入右心室。三尖瓣由三个瓣叶构成，每个瓣叶具有独特的力学行为。通过研究其四个解剖层次——心房层（A）、疏松层（S）、纤维层（F）和心室层（V），可进一步理解这三个三尖瓣瓣叶之间的差异。尽管这四个层次在所有三个三尖瓣瓣叶中均存在，但它们在厚度和微观结构成分上的差异进一步影响了各自特有的力学行为。

本方案包含四个步骤，以阐明各层之间的特异性差异：（i）表征完整三尖瓣瓣叶的力学性能及胶原纤维结构行为；（ii）分离三尖瓣瓣叶的复合层（A/S层和F/V层）；（iii）对分离后的复合层进行相同的表征；（iv）执行 事后 组织学评估。该实验框架能够直接比较完整的三尖瓣（TV）组织与其各个组成层。因此，利用本方案可获取有关三尖瓣瓣叶微结构和生物力学功能的详细信息。这些信息有望用于构建三尖瓣的计算模型，以期为三尖瓣疾病的临床治疗提供指导。

引言

三尖瓣位于心脏的右心房与右心室之间。在整个心动周期中，三尖瓣通过前瓣叶（TVAL）、后瓣叶（TVPL）和隔瓣叶（TVSL）的周期性开闭，调控血液的单向流动。这些瓣叶结构复杂，具有四层不同的解剖结构——心房层（A）、疏松层（S）、纤维层（F）和心室层（V）——每层均含有独特的微观结构成分。心房层和心室层中的弹性纤维有助于组织在机械负荷后恢复至未变形的几何形态¹。相比之下，纤维层含有致密的波浪状胶原纤维网络，赋予瓣叶承受负荷的能力²。疏松层主要由糖胺聚糖组成，被认为可在心脏瓣膜功能过程中促进瓣叶各层之间的剪切滑动³。尽管这三种瓣叶均具有相同的解剖层次，但各层的厚度及成分比例存在差异，从而影响不同瓣叶特有的力学行为。

研究人员已通过平面力学表征、组织形态学评估以及胶原纤维结构的光学表征等方法，探索了三尖瓣（TV）瓣叶的特性。例如，平面双轴力学表征通过在组织上施加相互垂直的位移并记录相应的力，以模拟生理载荷条件。由此获得的力-位移（或应力-伸长率）数据表明，所有三个三尖瓣瓣叶均表现出非线性、方向特异性的力学行为，且在径向组织方向上表现出更为明显的瓣叶特异性响应^4,5,6。这些瓣叶特异性行为被认为源于采用常规组织学技术观察到的微观结构特性差异^6,7。此外，二次谐波产生成像⁶、小角度光散射⁸和偏振空间频率域成像⁷ (pSFDI) 旨在深入理解这些微观结构特性，已揭示出胶原纤维取向和纤维屈曲在不同瓣叶之间存在特异性差异，这些差异对观察到的组织层面力学行为具有重要意义。这些研究显著推进了我们对组织微观结构及其在组织层面行为中作用的理解。然而，在实验上建立组织力学特性与潜在微观结构之间的关联方面，仍有许多问题有待解决。

近期，本实验室采用显微解剖技术将三尖瓣（TV）小叶分层为两层复合结构（A/S层和F/V层），并对这两层进行了力学表征⁹。先前的研究突出了各层之间力学性能的差异，有助于揭示分层微结构如何影响组织的力学行为。尽管该研究增进了我们对三尖瓣小叶微结构的理解，但该技术仍存在若干局限性。首先，复合层的力学性能未与完整组织直接比较，导致对力学-微结构关系的理解尚不完整。其次，未对复合层的胶原纤维架构进行分析。第三，由于难以从其余两个三尖瓣小叶中获取复合层，研究仅限于三尖瓣前叶（TVAL）的各层。本文所述方法提供了一个整体性表征框架，克服了上述局限性，实现了对三尖瓣小叶及其复合层的全面表征。

本文介绍了一种显微解剖技术，可将三尖瓣（TV）的三个瓣叶分离为其组成层次（A/S层和F/V层），以进行双轴力学性能和微观结构表征^10,11,12。该迭代式实验流程包括：（i）对完整瓣叶进行双轴力学测试和偏振空间频率域成像（pSFDI）表征；（ii）采用一种新颖且可重复的显微解剖技术，可靠地获取TV的各组成层次；（iii）对TV组成层次进行双轴力学测试和pSFDI表征。在力学测试中，组织样本受到不同力比的双轴拉伸载荷作用。随后，利用pSFDI技术测定在不同加载状态下胶原纤维的取向与排列情况。pSFDI能够保持胶原纤维的天然结构，支持载荷依赖性分析，并避免了传统方法中为分析胶原纤维结构而必需的组织固定或透明处理步骤（如二次谐波成像或小角度光散射技术）。最后，采用标准组织学技术制备样本，以观察组织的微观结构。这一迭代式、整体化的研究框架，实现了三尖瓣瓣叶与其组成层次在力学性能和微观结构特性上的直接比较。

方案

本文所述所有方法均经俄克拉荷马大学机构动物护理和使用委员会批准。动物组织取自美国农业部批准的屠宰场。

1. 双轴力学表征

1. 组织制备
   1. 从冰箱中取出TV小叶、剃须刀片、外科记号笔、镊子、装有去离子水（DI水）的移液器以及切割垫。用2-3滴室温去离子水使TV小叶解冻。
      注意：使用去离子水而非磷酸盐缓冲液（PBS），以避免 PBS 对切片显微切割造成的干扰。
   2. 将样本平放在切割垫上，使心室面（即带有腱索附着的表面）朝上。调整样本位置，使其径向方向与 Y-方向与周向对齐 X方向。
      注意：周向沿瓣膜的圆周方向排列。
   3. 检查组织的腱索附着位置。选择一个理想约为 12 x 12 mm 的区域，该区域应尽量减少大腱索的附着，同时避开过薄（即透明）的区域。图1).
   4. 将样本翻转，使心房面（即无腱索附着的一面）朝上。确保瓣叶的周向和径向方向保持与原方向一致。 X- 和 Y-轴，分别。
   5. 从步骤1.1.3中确定的避开大型腱索附着处或薄弱区域的瓣叶组织上，裁剪出一块12 mm × 12 mm的方形样本。用镊子移除修剪下来的瓣叶组织碎片，并将其放入废料容器中。
      1. 如果无法完全避免较大的腱索插入，则应将组织切割至腱索沿方形样本边缘的位置。避免腱索插入非常重要，因其有助于防止后续显微解剖过程中出现问题。
   6. 使用外科记号笔在右上角标记一个小点，以追踪标本的方向。静置约30秒，待墨水干燥。
   7. 将标本翻转，使心室面（即带有腱索附着的面）朝上。通过牵拉瓣叶上的腱索，并使用剃刀片在其附着处附近切割，修剪组织背面的腱索附着。再次翻转标本，使心房面（即光滑面）朝上。
2. 厚度测量
   1. 取出一个非接触式激光位移传感器。将位移传感器归零于靠近修剪后组织的切割垫平坦区域。
      警告：切勿将激光直接照射眼睛。
   2. 将激光定位在样本的中央区域。需去除瓣膜表面下 trapped 的空气，因其可能导致测量误差。为释放 trapped 空气，可使用镊子将气泡推至组织边缘，或抬起组织的一角。
   3. 记录位移传感器显示屏上显示的厚度。在试样的其他位置重复测量两次。
   4. 使用上一步记录的三个测量值计算平均瓣膜厚度，并在创建双轴力学表征方案时采用该数值。
3. 双向拉伸测试仪设置与组织固定
   1. 将去离子水浴锅预热至 37 °C，遵循测试系统的操作指南，以确保温度稳定在规定范围内 体内 生理条件
   2. 取出镊子、组织样本、固定装置、细尖工具、液体氰基丙烯酸酯胶水以及涂有黑色漆的玻璃珠（直径：300–500 µm）。
      注意：安装硬件包括齿状部件、安装桥和安装橡胶。
   3. 将组织样本安装到测试系统上，确保组织的周向方向与 X-方向，此过程可借助步骤1.1.6中预先放置的点来辅助完成。
      注意：此处使用的齿钉应沿整个组织边缘长度均匀分布。对于完整组织，有效边缘长度设定为 10 mm。 >3.3 mm用于复合层。
4. fiducial marker placement
   1. 确定贴附组织的中心三分之一区域。利用该区域的大致角点位置放置定位标记。
   2. 将玻璃珠放入敞口称量皿中，并在另一个称量皿中制备少量液态氰基丙烯酸酯胶水。用少量胶水涂覆细尖工具的顶端，然后在称量皿边缘蘸去多余的胶水。
   3. 用镊子夹取一颗玻璃珠，小心地放置在胶点上。使用双向拉伸测试仪的摄像头辅助放置玻璃珠。通过轻轻按压涂有胶水的尖端至组织表面，形成中心三分之一区域方阵的一个角。
   4. 重复步骤 1.4.2 和 1.4.3，再添加三个微珠，直至完成方形阵列。确保微珠牢固固定，且各自的胶点互不接触或粘连。在将组织放入水浴前，先让胶水干燥。
      1. 如果珠子粘在一起，请等待胶水干燥，然后用镊子轻轻夹住珠子或胶水，将其从组织上取下。
         注意：胶水和珠子应能被取下，以便重新尝试放置珠子。
5. 预处理
   1. 创建一个力控制的预处理方案，使具有特定边长和厚度的组织经历六次重复的等双轴加载，直至达到峰值膜张力 T_峰值 40 N/m，预紧力为3% × T_峰值¹⁰ 拉伸和恢复时间均为30秒。
      1. 构建一个任意的测试目录，用于临时存储数据以供后续计算。设置 加载速率 是 4.42 N/m.
      2. 构建一个名称为的新测试参数集 预处理0将X轴和Y轴的控制模式设为力控制，并将控制函数设为步进模式。定义载荷大小为与力相关的数值 T_峰值，即 f_峰值 = T_峰值 · L. 将预载荷大小定义为3% f_峰值 仅对第一次重复设置，并将拉伸持续时间和恢复持续时间均定义为 30 s。将重复次数定义为 10 次。
         注意：所计算的峰值第一类皮奥拉-基尔霍夫应力，即 P_峰值 = T_峰值对于较薄的组织，该值可能超过 200 kPa，这可能导致测试过程中组织撕裂。在这些情况下，将峰值膜张力调整为最大第一类皮奥拉-基尔霍夫应力 200 kPa。
   2. 执行预处理程序。预处理结束后，记录电流 X- 和 Y用于双轴测试方案的试样尺寸。
6. 双轴测试方案的创建与执行
   1. 从预处理后的状态达到具有目标位移速率的峰值等双轴构型所需的时间。在位移速率恒定的前提下，计算其余加载比率的加载时间（即 T_XX:T_YY = 1:0.5 和 T_XX:T_YY = 0.5:1).
   2. 手动调节线性执行器，以匹配给定载荷比例下的目标力。重复此过程，并记录所有载荷比例下的瓣叶尺寸。
   3. 制定一个位移控制的测试方案，从预加条件处理后的构型开始，对组织进行双轴向位移，直至达到步骤1.6.2中记录的各个构型（即 T_XX:T_YY = 1:1, 1:0.5, 0.5:1）的时间范围内进行。确保每种方案均包含三个加载/卸载循环，以保证力学行为的可重复性。
      1. 构建一个用于存储未来计算所需数据的测试目录。确保该目录名称与当前样本一致。
      2. 构建一个名为 1:1 的新测试参数集，设置 X-轴和 Y-轴控制模式设为位移控制，并将控制函数设为斜坡模式。设定拉伸幅度为步骤1.6.1中记录的构型值。预载幅度定义为3% f_峰值 仅对第一次重复进行此操作，并将拉伸持续时间和恢复持续时间均定义为步骤 1.6.1 中记录的时间。将重复次数定义为 3 次。
      3. 对剩余的载样比例重复步骤 1.6.3.2（即， T_XX:T_YY = 1:0.5 和 T_XX:T_YY = 0.5:1），但将预载荷大小定义为未施加。确保拉伸幅度、拉伸持续时间和恢复持续时间与步骤 1.6.2 中记录的参数一致。
         注意：仅使用最终（第三次）循环的数据进行应力和应变分析。
   4. 执行位移控制程序。双轴测试完成后，将组织恢复至预 conditioning 后的尺寸。
      注意：如果组织开始撕裂，应立即中止测试。
7. 进一步表征
   1. 将组织浸没在去离子水中，并固定在双轴测试系统上。按照步骤 2.1-2.3 所述进行 pSFDI 成像。
   2. 卸下组织。若为完整组织，继续进行步骤3.1-3.7中所述的显微解剖；若不完整，则按步骤3.7收集组织学样本。
      注意：同一天内可将去离子水浴用于后续的表征实验。
   3. 重复步骤1.2–1.7，对显微解剖后获得的A/S层和F/V层（步骤3.1–3.6）进行相同操作。
      注意：对各层重复进行测试方案，可实现完整组织与其自身各层之间的直接比较。
8. 双轴测试数据后处理流程
   1. 对获取的双轴测试图像进行数字图像相关分析，以确定随时间变化的标记点位置。通过公式（Eq）计算基准标记的位移。1).⁵
      (1)
      在此， x_i(t), X_i，以及 d_i(t随时间变化的位置、初始（参考）位置以及标记物的位移 i.
   2. 计算变形梯度 F 通过将基准标记视为一个四节点双线性有限元，如公式（Eq）所示2)⁵
      (2)
      何处 B_Xi 和 B_一 是节点形函数的导数 i 在 X- 和 Y-方向，分别地，并且 u_i(t）和 v_i(t是……的组成部分 d_i(t): d_i(t) = [u_i(t), v_i(t)]^T.
   3. 计算施加的第一类皮奥拉-基尔霍夫应力 P 利用记录的力，如公式（3)⁵
      (3)
      P_XX 和 P_YY 是 X- 和 Y-组分 P; L 和 t 为组织边缘的长度和厚度； f_X 和 f_Y 记录的力是否在 X- 和 Y方向。
   4. 根据需要确定其他应变和应力测量指标，¹³ 包括右柯西-格林变形 C = F^T/F，格林-拉格朗日应变 E = (C - 我)/2，柯西应力 σ = J^-1PF^T，以及第二类皮奥拉-基尔霍夫应力 S = F^-1P.
      注意：本文中， 我 是二阶单位张量，且 J = det(F是变形梯度的雅可比行列式 F.

2. 偏振空间频率域成像

1. 系统准备
   注意：如有需要，可在执行以下步骤前从组织中移除定位标记。
   1. 将 pSFDI 设备置于样本正上方（图 2）。打开投影仪，使用 490 nm（青色）光照射样本。
   2. 启动相机软件并检查相机的视场。确保样本位于画面中央，且完全处于视场范围内。
   3. 若安装的样本为完整的瓣叶，请调节数字光处理（DLP）投影仪的亮度，以确保组织被完全照亮，且组织表面无反光。若样本为复合层之一，则不要调节亮度。
   4. 旋转偏振器至其全部运动范围，以检测偏振器镜头上是否存在可能的反光或污垢。必要时，使用无绒布小心清洁偏振器镜头。
2. 数据采集
   注意：以下数据采集过程可使用 LabVIEW 或 Python 等软件实现自动化。
   1. 将偏振器移至初始位置——理想情况下与双轴测试的一个轴对齐。拍摄一张灰度图像，并将该图像连同偏振器位置（即 0°）一起保存至计算机。
   2. 将偏振器旋转 5°，并拍摄另一张灰度图像。重复此过程，共获取 37 张图像，覆盖 0° 至 180° 范围，步长为 5°。
      注意：可对第一组 pSFDI 成像序列的图像进行初步分析，以确认组织是否产生预期的光学响应。具体操作请参见步骤 2.3。
   3. 对其他所需的组织构型重复 pSFDI 成像序列，例如双轴力学测试所考虑的加载协议中的峰值构型。
3. pSFDI 数据后处理流程
   注意：以下方法以 MATLAB 编程语言为例，但也可使用其他任意编程语言（如 Python、C++）替代。
   1. 使用 MATLAB 的 imread() 函数构建数组，存储所获取的 37 张图像中每个像素的强度值。为方便起见，将这些数据排列为一个 n × m × 37 的三维数组，其中 n 和 m 分别为两个方向上的像素数量。
   2. 使用用户自定义的 grabit() 函数定义组织的兴趣区域（ROI）。
   3. 对每个 ROI 像素的强度随偏振器角度变化的数据，采用三项傅里叶级数进行拟合，如公式（4）所示：
      （4）
      其中，I(θ) 表示像素强度随偏振器角度变化的函数，b_i 为傅里叶常数。采用标准线性最小二乘回归法求解 b_i。
   4. 将每个像素的纤维取向定义为对应 I(θ) 最大值的偏振器角度。通过公式（5）计算光学各向异性度（DOA）：
      （5）
   5. 使用 plot() 和 histogram() 函数可视化所获得的纤维取向和 DOA 值。将处理后的结果保存以供后续使用。

3. 三尖瓣瓣叶复合层的显微解剖

1. 将组织固定于蜡板上
   1. 准备所需材料：蜡板、去离子水、移液器、手术刀、显微剪刀、细镊子、弯头镊子和粗镊子。
      注意：仅使用无齿或无夹持面的镊子，因为在解剖过程中此类镊子极易撕裂A/S层的薄组织。
   2. 从双向拉伸测试仪上取下组织，使用第1.2步所述的激光位移传感器测量其厚度。将组织放置在蜡板上。
   3. 检查组织的心室面是否存在较大的腱索插入点。记录这些插入点的位置，以便在解剖过程中避开（补充图S1）。拍摄照片以作参考。
   4. 将组织平铺于蜡板上，心房面朝上。使用大头针将组织固定在板上：
      1. 在组织的每个角落插入一根大头针，针的方向应略微向外倾斜（以便更好地观察），并轻微拉紧组织（图3A）。按顺时针或逆时针顺序操作。确保大头针位于组织安装时齿状结构所形成的孔洞之外。
      2. 略微调整大头针的位置，确保组织被拉紧并呈方形（图3B），使组织平整且在显微解剖过程中不会移动。
      3. 如有必要，在解剖过程中可在组织边缘增加大头针以进一步拉伸组织。放置和倾斜附加大头针时需注意，后续操作中必须绕开这些大头针。
      4. 移除玻璃珠定位标记。
         注意：以下步骤为可选步骤。添加的去离子水有助于维持组织的水合状态，并防止组织在显微解剖过程中发生自粘连。
      5. 使用移液器将去离子水滴加到组织表面，使其以类似气泡的方式完全覆盖组织。在整个解剖过程中根据需要补充去离子水。
2. 制作初始角
   1. 选择一个已固定组织的角落作为解剖起点。避开较大的腱索插入点和极薄区域。
   2. 使用手术刀沿机械测试时的安装孔位置轻轻划过组织表面，在A/S层上做一切口（图3C）。确保切口长度至少为5 mm，切口边缘开始分离，暴露出下方的F/V层。
   3. 使用无尖头的细镊子沿切口用力摩擦，并将切口边缘拉开（补充图S2）。
      1. 如果A/S层的切口未开始分离，可再次用手术刀沿同一位置轻轻划动，直至出现分离。注意不要切得过深（超过A/S复合层），否则将难以干净地分离各层。
   4. 重复步骤3.2和3.2.3，制作第二条与第一条切口垂直的切口（图3D）。确保两条切口相连，形成一个角。
      1. 如果两条切口未连接，可将细镊子插入两切口之间的小片组织下方（补充图S3），然后小心使用剪刀切断该部分组织。
3. 从角部开始剥离组织
   1. 使用细镊子沿切口摩擦，直至组织开始与F/V层分离。一旦有小片组织被分离，立即用镊子夹住并轻轻拉扯，以进一步分离复合层。
      注意：夹取时，细镊子的尖端应始终置于组织边缘之外。否则可能意外刺穿A/S复合层。
   2. 继续剥离组织并摩擦接缝，直至到达为角部所做两条切口的末端。在此过程中，可换用较大的镊子夹持组织进行剥离，以防止A/S复合层发生非预期的撕裂。
      1. 如果首次尝试的角部存在严重分离问题，可更换另一个角作为起始点（返回步骤3.2）。
4. 延长切口、继续剥离并制作第二个角
   1. 将第一个角的两条切口延长：将手术刀尖置于每条切口底部，沿组织表面轻轻拖动（图4A）。确保所有延长切口长度至少为5 mm，且延长部分与原始切口相连，并继续沿齿状结构或缝合孔延伸。
      注意：如果延长切口过深，则后续剥离过程需密切监控，以确保纤维层不会随A/S复合层一同被分离（图5A）。
   2. 继续延长切口，并在摩擦接缝的同时向后剥离上层复合A/S层，直至完成一侧。观察发现组织将沿一条切口完全分离；确保A/S与F/V复合层之间的接缝呈直线（图4B）。
   3. 重复步骤3.2和步骤3.3的操作，在已完全剥离的一侧末端垂直制作第二个角（图4C）。
5. 完全分离A/S层
   1. 延长剩余切口时，避开较大的腱索插入点。继续采用第一角所用的摩擦和拉扯技术分离A/S层与F/V层。注意记录此过程中可能出现的若干考虑事项或问题：
      1. 仅当排除腱索插入点后仍能获得足够大的A/S样本用于实验表征时（>3.3 mm），才将其从A/S分离区域中排除（图5B）。
      2. 若组织发生撕裂或形成孔洞，应立即停止分离操作。为防止镊子卡住，可在形成的孔洞中插入剪刀，并从中心向外剪开组织。若缺陷出现在分离接缝处，则应改从另一边缘开始分离，以避免进一步撕裂（图5C）。
      3. 在分离过程中注意观察是否存在层间连接结构，这些结构可能阻碍进一步分离且存在高撕裂风险（图5D）。这些结构通常为细而坚韧的纤维束，需用剪刀小心剪断。应避免在A/S层中制造孔洞或向下切入F/V层，以免造成不均匀分离。
      4. 持续操作，直至分离出尽可能大的A/S层样本。使用外科记号笔标记样本的方向（图6A）。
6. 完成解剖
   1. 使用剪刀沿剩余组织边缘的分离接缝进行切割（图6B）。确保此切口尽可能贴近分离接缝。
   2. 将已分离的A/S复合层平放在切割垫上。如有必要，使用手术刀修整组织边缘，形成适合双向力学测试的方形组织样本。将A/S层置于去离子水中，待测试时取出。
   3. 标记仍留在蜡板上的F/V层的方向。从A/S层被移除的区域中切割出尽可能大的方形样本（图6C），然后将其放入去离子水中。
7. 组织学处理
   1. 切取两块分别沿周向和径向排列的组织条，用于组织学分析。对完整组织层和复合层（即A/S层和F/V层）采用不同的处理流程。
      1. 对于完整层，从仍固定在蜡板上的剩余组织中取样。应使用齿状结构/缝合孔以外的组织，因为该部分未经过解剖，可代表完整的瓣膜小叶。
      2. 对于A/S和F/V复合层，仅在完成全部测试和成像后采集组织学样本。从双向拉伸测试系统中卸下样本，将组织平铺于切割垫上，使用剃刀刀片切取周向和径向组织条。
   2. 将切下的组织条放入组织包埋盒中，并将包埋盒浸入10%福尔马林溶液中。
   3. 丢弃剩余组织。使用清洗剂清洁解剖工具（参见材料表）。
   4. 固定24–48小时后，将包埋盒转移至乙醇中，可长期保存直至进行组织学处理和染色。
      注意：该组织学分析可用于确认显微解剖是否成功。 警告：10%福尔马林可引起皮肤刺激和严重眼损伤，吸入可能引发过敏反应或致癌。操作时应佩戴适当个人防护装备，如手套、护目镜和实验服，并仅在通风良好的环境中使用（例如通风橱内）。不使用时，务必确保储存容器密封严密。

结果

显微解剖将获得厚度相对均匀的A/S和F/V样本，可将其安装至（商用）双轴测试装置上。对完整小叶及两个解剖分层进行组织学分析，可验证组织是否沿海绵层与纤维层之间的边界被正确分离（图7）。此外，可利用ImageJ软件分析组织学显微图像，以测定各组织层的厚度及组分质量分数。当解剖所得A/S样本过小而无法固定于双轴测试仪时，即视为解剖失败。此类情况最常发生在剥离过程中A/S发生撕裂，或因腱索过厚导致F/V层出现孔洞。

位移控制的力学测试及后续处理可生成描述组织非线性力学行为的应力-应变数据（图8）。样品通常具有各向异性，其中周向组织方向的力学响应比径向组织方向更刚硬。表格 1）。这些低抗拉性和高抗拉性能可通过附加的分析技术进行定量测定。^6,14综合评估双轴力比率的范围可进一步揭示组织的方向...

讨论

该方案的关键步骤包括：（i）分层显微解剖，（ii）组织包埋，（iii）定位标记物放置，以及（iv）pSFDI装置设置。其中，适当的分层显微解剖是本方法最重要且最具挑战性的环节。在开展使用该技术的研究之前，解剖操作者应长期练习显微解剖技术，并熟练掌握全部三种腱索瓣叶（TV leaflets）的处理。操作者应确保所获取的复合层组织样本足够大（>3.3 mm），且厚度均匀。应通过组织学方法确认每次解剖均能实现准确的层次分离。

进行组织安装时，必须将组织固定在双轴测试仪上，确保组织平整，无任何人为拉伸或皱褶。这些误差将导致力学数据不准确。由于复合层更薄，因此更容易出现此类误差。在粘贴标记点时，必须确保标记点位于组织中央三分之一区域内，且彼此之间不发生粘连。标记点位置不当将导致组织拉伸程度的量化结果不准确。最后，pSFDI投影光的亮度必须谨慎选择，并在完整组织及其复合层的测量过程中保持不变。若亮度发生变化，则无法对完整组织与其复合层的pSFDI结果进行比较。

本文所述方法的灵活性主要体现在双轴力学表征方面，而大多数问题的出现则集中在基于...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
中性缓冲10%福尔马林溶液	Sigma-Aldrich	HT501128-4L
Alconox清洗剂	Alconox		清洁化合物
BioTester - 双轴拉伸测试仪	CellScale生物材料测试公司		1.5 N 负荷传感器容量
切割垫	Dahle	B0027RS8DU
去离子水	不适用
细尖工具	HTI INSTRUMENTS	NSPLS-12
弯头镊子	Scientific Labwares	16122
粗头镊子	Scientific Labwares	161001078
细头镊子	Scientific Labwares	16127
LabJoy	CellScale生物材料测试公司	版本 10.66
激光位移传感器	Keyence	IL-030
液态氰基丙烯酸酯胶水	Loctite	2436365
MATLAB	MathWorks	版本 2020a
微型剪刀	HTI Instruments	CAS55C
移液器	Belmaks	360758081051Y4
偏振空间频率域成像装置	不适用		自制设备，使用数字光投影仪、线性偏振片、旋转偏振片支架和电荷耦合器件相机组装而成。 更多细节请参见 doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028 (PMCID: PMC8101699)。
手术刀	THINKPRICE	TP-SCALPEL-3010
单刃工业剃须刀片（外科级碳素钢）	VWR International	H3515541105024
外科标记笔	LabAider	LAB-Skin-6
T型销钉	Business Source	BSN32351
石蜡板	不适用		自制，使用造型蜡和烤盘制作
称量舟	Pure Ponta	mdo-azoc-1030