一种西藏小型猪射血分数保留型心力衰竭的手术模型

摘要

本方案详细描述了通过降主动脉缩窄建立射血分数保留型心力衰竭小型猪模型的逐步操作流程。同时介绍了该疾病模型的心脏形态学、组织学及心功能评估方法。

摘要

全球超过一半的心力衰竭（HF）病例被归类为射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）。目前可用于研究HFpEF基本机制并识别潜在治疗靶点的大动物模型十分有限。本研究详细描述了在藏猪中实施降主动脉缩窄术（DAC）的外科手术流程，以建立HFpEF的大动物模型。该模型通过精确控制降主动脉的缩窄程度，诱导左心室产生慢性压力超负荷。采用超声心动图评估心脏的形态学和功能变化。在持续12周的DAC刺激后，室间隔出现肥厚，但后壁厚度显著减小，并伴有左心室扩张。然而，在这12周期间，模型心脏的左心室射血分数仍维持在>50%。此外，DAC模型表现出心肌损伤，包括纤维化、炎症以及心肌细胞肥大。DAC组的心力衰竭标志物水平显著升高。这种由DAC诱导的迷你猪HFpEF模型是研究该疾病分子机制及开展临床前测试的有力工具。

引言

射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）占所有心力衰竭病例的一半以上，已成为全球性的公共卫生问题¹。临床观察已提示HFpEF的若干关键特征：（1）心室舒张功能障碍，伴随收缩期僵硬度增加；（2）静息状态下射血分数正常，但运动耐量受损；（3）心脏重构²。目前提出的机制包括激素调节紊乱、全身微血管炎症、代谢异常以及肌节和细胞外基质蛋白的异常³。然而，实验研究表明，射血分数降低型心力衰竭（HFrEF）亦可导致这些改变。临床研究已探讨了血管紧张素受体抑制剂及用于治疗HFrEF的药物在HFpEF中的治疗效果^4,5。然而，仍需针对HFpEF开发特异性的治疗策略。相较于对临床症状的认识，HFpEF在病理学、生物化学和分子生物学层面的改变仍不明确。

已开发出多种HFpEF动物模型，以探索其发病机制、诊断标志物及治疗策略。实验室动物，包括猪、狗、大鼠和小鼠，均可发展为HFpEF，且多种危险因素（如高血压、糖尿病和衰老）已被选为诱导因素^6,7。例如，单独使用脱氧皮质酮乙酸酯或联合高脂/高糖饮食可在猪中诱导HFpEF^8,9。心室压力超负荷是另一种用于建立大动物和小动物HFpEF模型的技术¹⁰。此外，近年来各大洲已采用特定的射血分数（EF）截断值来定义HFpEF，如欧洲心脏病学会指南、美国心脏病学会基金会/美国心脏协会¹¹、日本循环学会/日本心力衰竭学会所推荐的标准¹²。因此，若采用这些临床标准，许多先前建立的动物模型可能适用于HFpEF研究。例如，Youselfi等提出，一种基因修饰小鼠品系Col4a3-/-是一种有效的HFpEF模型。该品系表现出典型的HFpEF心脏症状，如舒张功能障碍、线粒体功能障碍和心脏重构¹³。先前一项研究在老年猴中使用高能量饮食诱导出射血分数处于中间范围的心脏重构¹⁴，其特征为代谢紊乱、纤维化以及心肌组织中肌球蛋白MgATP酶活性降低。小鼠横主动脉缩窄（TAC）是目前最广泛使用的模拟高血压诱导心肌病的模型之一。左心室从射血分数升高时的向心性肥厚，逐渐进展为射血分数降低时的扩张性重构^15,16。这两个典型阶段之间的过渡表型提示，主动脉缩窄技术可用于HFpEF的研究。

此前已发表关于猪HFpEF模型的病理特征、细胞信号传导和mRNA表达谱的研究¹⁷。本文提供了一套建立该模型并评估其表型特征的逐步操作方案。该流程详见于图1。简而言之，由主要研究者、外科医生、实验室技术人员和动物护理人员共同制定手术计划。实验前对小型猪进行健康检查，包括生化检测和超声心动图检查。手术后实施抗炎和镇痛处理。通过超声心动图、组织学检查以及生物标志物检测来评估模型的表型特征。

方案

所有动物实验均经广东省实验动物监测研究所机构动物护理和使用委员会批准（批准号：IACUC2017009）。所有动物实验均遵循美国国家科学院出版的《实验动物护理和使用指南》（第8版，2011年）。动物饲养于广东省实验动物监测研究所通过AAALAC认证的实验动物设施中（许可证号：SYXK（粤）2016-0122，中国）。本研究使用了六只雄性藏猪（假手术组和DAC组各n = 3，体重25–30 kg）建立HFpEF模型。

1. 动物和仪器准备

1. 手术前将动物在设施中适应环境14天。
2. 手术前进行健康检查，包括生化检测和超声心动图检查。根据中国实验动物学会发布的《实验动物 大型实验动物重要器官（心、肝、肾、脑）健康评估指南》（T/CALAS85-2020），排除存在心脏结构异常（心室扩张或肥厚）或功能异常（射血分数 EF <50%）的动物。
3. 麻醉前禁食超过12小时，即在手术当天不给予喂食。
4. 准备手术室及设备（图2）。检查麻醉呼吸机工作站、兽用及患者监护仪、兽用超声系统、吸引器及其他手术设备。对剪刀、镊子、拉钩、手术刀柄、吸引头、手术缝合针等器械进行高压灭菌处理（见材料表）。

2. 镇静、气管插管和静脉插管

1. 称量动物并计算麻醉药物剂量。使用 1 mg/kg 的唑拉西泮-替来他明注射液（zoletil injection）和 0.5 mg/kg 的盐酸赛拉嗪注射液对小型猪进行镇静（参见材料表）。
2. 固定小型猪，并将其置于手术台上的右侧卧位。开启加热系统以维持动物体温。
3. 进行超声心动图检查（步骤 5），并采集 2 mL 血液样本。
4. 将气管插管连接至兽用麻醉呼吸机工作站（图 3A），对小型猪实施插管（参见材料表）。
5. 以 8 mL/kg 的潮气量和 30 次/分钟的呼吸频率启动机械通气。手术过程中使用 1.5%–2.5% 异氟烷维持麻醉。
6. 通过耳静脉（通常为耳缘静脉，图 3B）使用外周静脉导管（26 G）建立静脉通路（参见材料表）。
7. 将动物连接至兽用监护仪。

3. 手术步骤

1. 剃除左侧胸区毛发。将0.7%碘液和75%酒精涂抹于从肩胛骨至膈肌区域的皮肤，进行无菌处理（图3C）。
2. 在手术区域覆盖无菌手术巾。
3. 通过静脉注射丙泊酚（5 mg/kg）（见材料表），以维持全身麻醉状态。
4. 在使用电灼器切开皮肤前，沿第4肋间间隙标记切口位置（长约15 cm）。
5. 结合电灼和钝性分离肌肉及结缔组织的方法打开胸腔。术中使用吸引器清除血液。
6. 使用肋骨牵开器撑开肋骨（图3D）。
7. 定位胸主动脉降支节段，并确定缩窄部位（图3E）。用两根3-0外科缝线围绕该节段各绕两圈（图3F）。在缝线与主动脉之间放置三层医用纱布，以避免缝线对组织造成损伤。
8. 设置压力测量装置以确定缩窄程度（图3F-H）。
   注：该装置包括穿刺血管壁的导管、连接管、压力传感器和病人监护仪。
9. 逐渐收紧围绕胸主动脉降支节段的外科缝线，以达到所需的缩窄程度。使压力读数稳定20分钟，然后永久性扎紧手术结。
10. 使用胸腔引流管排出胸腔内的空气和多余液体。
11. 逐层关闭胸壁，使用可吸收缝线对合肋骨 及分离的肌肉。
12. 检查是否有出血，并确保止血良好。
13. 术后在手术区域使用一瓶苄星青霉素（800,000单位）（见材料表）。
14. 监测动物是否存在眨眼和肢体活动。断开呼吸机，但保留气管插管。监测自主呼吸是否恢复。
15. 将动物送回饲养室，使其自然苏醒。

4. 术后护理

1. 每日使用青霉素G（苄青霉素）治疗1周（20,000 U/kg）。
2. 每日使用氟尼辛葡甲胺1 mg/kg（参见材料表）治疗1周。
   注意： 阿片类药物和非甾体抗炎药（NSAID）镇痛剂应在术中和术后给予。

5. 经胸超声心动图

1. 使用 1 mg/kg 的 zoletil 对动物进行镇静。
2. 将动物置于带有帆布覆盖的移动式固定装置中。
   注意：移动式固定装置（参见材料表）设有四个开口，用于固定动物的前肢和后肢。
3. 剃除动物左侧胸部的毛发。
4. 将手指置于胸部左侧中心以感知心尖搏动，并在周围区域涂抹超声耦合凝胶。
5. 将超声系统的相控阵探头（3-8 Hz）置于第三肋间间隙，移动探头至前侧或后侧方向，并调整切迹角度。
6. 辨认心房、心室和主动脉，记录胸骨旁长轴切面的 B 模式和 M 模式图像。
   注意：B 模式图像显示乳头肌水平左心室的横截面，M 模式图像显示左心室随时间变化的运动情况。
7. 将探头顺时针旋转 90°，获取胸骨旁短轴切面图像，辨认左心室、右心室和乳头肌，并记录 B 模式和 M 模式图像。
8. 使用超声系统制造商提供的工作站评估心脏结构与功能。

结果

超声心动图
在第0、2、4、6、8、10和12周评估心脏结构和功能。胸骨旁短轴切面的B型和M型超声心动图记录显示如下 图 4A超声心动图测量包括室间隔厚度（VST）、左心室后壁厚度（PWT）和左心室内径（LVID）。在DAC心脏中，舒张末期的VST增加，而舒张末期的PWT在观察期间先增加后减少，提示DAC小型猪左心室存在肥厚性重构。 (图4B，C）舒张末期内径在第4周和第6周减小，随后自第8周起逐渐增加，提示心室在扩张之前经历了向心性肥厚。图 4D）。模型心脏的LVEF保持在 >12周期间的50% (图4E).

形态学与心力衰竭标志物
第12周后，按照先前所述方法取心脏组织

讨论

本研究采用升主动脉缩窄术（DAC）技术建立藏猪的射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）模型。本文详细介绍了动物和仪器准备的逐步操作流程，包括镇静、气管插管、静脉插管、手术操作以及术后护理。同时介绍了超声心动图B模式和M模式心脏图像的记录技术。DAC术后第4周和第6周出现左心室肥厚，第8周后出现扩张。在12周观察期内，左心室射血分数（LVEF）保持正常。DAC心脏组织中观察到纤维化和炎症表现。

开胸手术与主动脉缩窄相结合的方法已被用于在大型和小型动物中建立心力衰竭模型。例如，早在20世纪50年代就有报道报道啮齿类动物通过主动脉缩窄诱导高血压¹⁸。在2至4周龄的猪中，升主动脉缩窄可诱导轻度左心室肥厚。关于定位升主动脉的手术部位，一些研究选择第三肋间间隙^19,20，而另一项研究则选择第四肋间间隙进行侧胸切开术²¹。研究发现，在成年西藏小型猪中，降主动脉缩窄具有可行性。降主动脉节段...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
可吸收外科缝线	普同金花医疗有限公司，中国	4-0
麻醉呼吸机工作站	深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，中国	WATO EX-35vet
吸引器	上海宝嘉医疗器械有限公司，中国	YX930D
苄青霉素	四川制药有限公司，中国	H5021738
带套囊一次性气管插管	深圳维力生物科技有限公司，中国	20 cm，内径 0.9
一次性传感器	广东百合医疗科技股份有限公司，中国
解剖刀片	上海 医疗器械（集团） 有限公司，中国
电灼器	上海 沪通医用仪器（集团） 有限公司，中国	GD350-B
酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒	CUSABIO生物技术有限公司，中国	CSB-E08594r
伊红	Sigma-Aldrich公司	E4009
氟尼辛葡甲胺	上海同仁药业有限公司，中国	兽药字(2012)-090242103
镊子	上海 医疗器械（集团） 有限公司，中国
苏木精	Sigma-Aldrich公司	H3136
异氟烷	RWD生命科学有限公司，中国	Veteasy for animals
喉镜	泰兴市西美德公司，中国	成人用
LED手术灯	明泰医疗集团，中国	ZF700
酶标仪	赛默飞世尔科技，美国	Multiskan FC
显微镜	徕卡，德国	DM2500
移动式固定装置	定制	N/A	由金属框架和轮子制成、带帆布罩的移动式固定装置
氧气	本地供应商，中国广州
多聚甲醛	Sigma-Aldrich公司	V900894
病人监护仪	深圳迈瑞生物医疗电子有限公司，中国	Beneview T5
外周静脉（IV）导管	深圳伊玛宠物产业发展有限公司，中国	26G × 16 mm
丙泊酚	广东嘉博制药有限公司	H20051842
肋骨牵开器	上海 医疗器械（集团） 有限公司，中国
直尺	得力 制造 公司，中国
手术刀柄	上海 医疗器械（集团） 有限公司，中国
剪刀（g）	上海 医疗器械（集团） 有限公司，中国
缝线	美敦力-柯惠公司	3-0，4-0
超声耦合剂	天津西苑思生产研究所，中国	TM-100
兽用监护仪	深圳迈瑞生物医疗电子有限公司，中国	ePM12M Vet
兽用超声系统	伊萨托，意大利	MyLab30	配备相控阵探头（3-8 Hz）
盐酸赛拉嗪注射液	申达动物药业有限公司，中国	兽药字(2016)-07003
赛拉嗪/唑拉西泮注射液（Zoletil）	维克，法国	Zoletil 50	注射用替来他明和唑拉西泮