用于量化生长因子介导的整合素力学与黏附的张力测量锚定探针

摘要

TGT 表面是一种用于研究生长因子与整合素串扰的创新平台。该平台采用灵活的探针设计、特异性的黏附配体以及对刺激条件的精确调控，可对 EGFR 与整合素之间的相互作用进行可靠的定量评估。研究结果表明，EGFR 作为一种“机械组织者”，能够调节整合素的力学特性，影响黏着斑的组装和细胞铺展。

摘要

多细胞生物依赖细胞膜受体与其周围细胞外基质（ECM）中对应配体的相互作用，以协调多种功能，包括黏附、增殖、迁移和分化。机械力可从细胞传递 通过 细胞黏附受体整合素与细胞外基质（ECM）中配体的相互作用。这些由细胞产生的力学力的大小和空间分布可受到生长因子受体的调控，包括表皮生长因子受体（EGFR）。目前可用的工具可用于量化由信号串扰介导的细胞力学特性变化，并将其与 黏着斑、细胞形态及信号转导的研究受限。基于DNA的分子力传感器，即张力阈值拴系物（tension gauge tethers, TGTs），已被用于量化这些变化。TGT探针的独特之处在于能够调控其内在的力阈值，并在衍射极限的空间分辨率下，报告整个贴壁细胞表面皮牛顿量级的受体受力情况。本文所使用的TGT探针依赖于受体-配体作用力导致DNA双链发生不可逆解离，从而产生荧光信号，由此可量化细胞整合素张力的累积值（即受力历史）。本文介绍了一种利用TGT研究表皮生长因子受体（EGFR）对整合素力学特性及黏附形成影响的实验方案。该探针的组装 TGT机械传感平台被系统地详细阐述，并概述了成像力、黏着斑及细胞铺展的实验流程。总体而言，该平台可通过调节探针的内在力阈值、黏附配体以及所用刺激因子的类型和浓度，成为研究多种膜受体在调控整联蛋白介导的力学作用中相互关系的可靠工具。

引言

细胞具有感知、产生和响应机械力的内在能力，从而导致细胞表型的改变以及局部微环境的重塑^1,2。机械力在调控细胞行为的诸多方面发挥着关键作用，包括黏附、迁移、增殖、分化以及伤口愈合^3,4。细胞与微环境之间双向力学交换的异常可导致疾病状态，包括癌症⁵。多种膜受体参与维持细胞-基质稳态，其中整合素（integrins）与表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）之间存在显著的协同作用^6,7。传统上，整合素建立微环境与细胞内细胞骨架之间的力学连接，而EGFR则调控细胞生长、增殖和存活^8,9。EGFR是一个被广泛研究的治疗靶点，其研究重点在于介导胞外到胞内的信号转导。EGFR与整合素之间的相互作用已在遗传学和生物化学层面被证实，可调控包括癌症在内的多种疾病的进展^10,11。尽管研究提示EGFR与整合素之间存在相互作用，但这些效应通常归因于远离质膜的信号通路^7,12,13,14。由于缺乏用于测量细胞力学和信号输出的工具，EGFR或其他生长因子对细胞力学的影响在很大程度上仍未被探索。当前的挑战在于识别合适的工具，以研究这两种并行信号模式之间的通讯，并量化它们对细胞力学的特定贡献。

已开发出多种方法用于测量细胞黏附受体产生的力，读者可参考有关这些技术的深入综述^15,16简而言之，牵引力显微镜和微柱阵列检测依赖于基底材料的形变来推断纳牛顿（nN）级的力，该力级比单个受体所受的力高一个数量级。^17,18单分子技术（包括原子力显微镜和光镊）能够检测单个蛋白质的皮牛顿（pN）级力，但每次仅能测量一个受体，且空间分辨率较差（或无空间分辨率）。基于DNA的分子张力探针和张力阈值拴系（TGT）探针则可在衍射极限（或更高）的空间分辨率下实现pN级力的检测，因而在单细胞力学研究中具有独特作用。^19,20 来自多种细胞类型，包括成纤维细胞、癌细胞、血小板和免疫细胞^21,22,23,24. 尽管分子张力探针具有可延伸性 "弹簧" 元素，适用于实时成像，TGT 探针不可逆地破裂，留下荧光标记 "受力历史"TGT 还可调节其下方基底的张力阈值；一系列具有相似化学组成但断裂力或张力耐受性（T_tol)，可用于量化黏着斑形成和细胞铺展所需的最小张力。TGT探针由两条互补的DNA链组成，其中一条固定在表面，另一条向细胞呈现配体。当受体结合该配体并施加的力超过T_tol 探针的链将被分开。T_tol 定义为在理想条件下，2秒内使50%的探针断裂所需的恒定力。在 "开启" TGT探针中，上链的淬灭剂可与下链的荧光团分离。只有在TGT探针发生断裂的位置（推测是由于受到大于或等于T的力所致），才会出现这种分离现象_tol，将产生荧光信号。TGT探针还可被固定，便于对生物系统进行操作以及多种条件的测试。因此，本研究采用了TGT探针。

采用TGT探针研究了活化的EGFR如何调节整合素依赖性细胞黏附和机械力²¹。该研究确立了EGFR作为一种“机械组织者”的作用，可调控黏着斑的组装及张力生成。此外，研究发现EGF刺激影响了黏着斑的分布与成熟度，并促进细胞铺展。该方法可用于未来研究生长因子如何影响肿瘤进展和动态过程中的机械力。尽管EGFR与整合素串扰在调控上皮-间质转化中的作用已较为明确，但机械力在该过程中的作用仍缺乏深入研究¹⁰。

本文详细介绍了这些实验的操作流程，涵盖56 pN TGT探针的合成与组装、在玻璃盖玻片上构建TGT表面、将Cos-7细胞接种于TGT表面并用EGF刺激、细胞固定、鬼笔环肽染色以及抗paxillin抗体染色、高分辨率全内反射荧光（TIRF）显微镜和反射干涉对比显微镜（RICM）成像，以及图像定量分析。尽管本实验方案旨在研究EGF对Cos-7细胞的刺激作用，但其可轻松适用于多种基于TGT的实验。通过替换不同的配体、T_tol、细胞类型、刺激参数、固定后标记的蛋白质以及定量分析方法，该方案具有高度的灵活性和广泛的应用价值。

方案

1. TGT 寡核苷酸的制备

注意：此处概述了寡核苷酸探针的合成细节。请注意，某些修饰和纯化步骤可外包进行定制合成。

1. 按照 Zhang 等人的方法，使用叠氮-NHS 连接剂活化环状[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(PEG-PEG)]肽的伯胺²² 以1:1.5的比例（100:150 nmol）混合，最终体积为10 µL 二甲基甲酰胺。加入 0.1 µL 有机碱三乙胺，4 ℃孵育 12 小时° C.
2. 使用0.1 M TEAA（溶剂A）和100%乙腈（溶剂B），在流速为1 mL/min、初始条件为10%溶剂B、梯度为0.5%/min的条件下，通过反相高效液相色谱法纯化产物。收集洗脱峰（在203 nm处有吸收），并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）验证。产物为cRGDfK-叠氮。
3. 为了生成TGT上链，将cRGDfK-叠氮和炔基-21-BHQ2寡核苷酸（TGT上链：5Hexynyl/GTGAAATACCGCACAGATGCG/3BHQ_2）以2:1的比例混合（῀200 µM：100 µM）在 100 µ1×磷酸盐缓冲液（PBS）1 升，含 5 mM 抗坏血酸钠和 0.1 µM 预形成的 Cu-THPTA。室温（RT）下反应至少 4 小时，或在 4 ℃ 过夜反应。 °C.
4. 通过 P2 脱盐凝胶处理混合物，以去除过量染料、副产物、有机溶剂和未反应的试剂。用 650 μL 离心柱进行准备。 µ通过在18,000 x g下离心，收集预水化P2凝胶的L组分 g 离心1分钟。弃去流出液，加入反应混合物。再次以18,000 x g 1 分钟，收集流穿液。将反应混合物补至终体积 300 µ用超纯水定容至 L。
   注意：使用水对 P2 凝胶预水化 6 小时。
5. 通过反相高效液相色谱法纯化脱盐后的反应混合物。用于此纯化的有机溶剂包括含0.1 M TEAA的H₂O（溶剂A）和100%乙腈（溶剂B，或流动相）。
   1. 在注入混合物之前，用初始条件为10%溶剂B、梯度为1%/min的流动相平衡色谱柱。调节流速至1 mL/min。用500 μL进样环将反应混合物注入HPLC系统。 µL注射针
   2. 通过检测DNA在260 nm和BHQ2淬灭剂在560 nm处的峰值吸收来收集产物。将洗脱产物在真空离心浓缩仪中干燥过夜。
6. 采用亲核取代反应将TGT底链与Cy3B-NHS酯偶联，具体方法见Ma等人的文献描述。²⁵. 混合100 µ56 pN TGT 底链（5Biosg/TTTTTT/iUniAmM/CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT）的 M 值与 50 µCy3B-NHS酯预溶于10 µL 的 DMSO 中。用 0.1 M 碳酸氢钠将该混合物的 pH 值调至 9，并将最终体积定容至 100 µ用 1× PBS 洗涤。在室温下孵育反应混合物过夜。
7. 使用P2凝胶过滤和反相高效液相色谱法依次纯化混合物，以分离未反应的试剂、盐类和有机溶剂（见步骤1.4和1.5）。
8. 使用分光光度计在260 nm处测定纯化后的寡核苷酸-染料偶联物的吸光度，以估算其浓度。
9. 通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF 质谱）对纯化产物进行表征。将过量的 3-羟基吡啶甲酸溶解于 TA50 溶剂（50:50 v/v 乙腈和含 0.1% 三氟乙酸的去离子水）中。₂O) 以制备新鲜的MALDI基质。标记产物的理论分子量与实测分子量分别为：cRGDfK-1-BHQ2 — 8157.9（计算值），8160.1（实测值）；Cy3B标记的56 pN TGT — 10272.7（计算值），10295.8（实测值）。
10. 将上链和下链分别溶解于无核酸酶的水中，浓度为 30–50 µM. 使用无DNase的移液器吸头以避免原液污染。4℃保存 °C用于短期应用或-20 °C 适用于长期应用。寡核苷酸的稳定性不受反复冻融循环的影响。

2. 表面准备

第1天：

1. 将25 mm的玻璃盖玻片（最多8片）放入聚四氟乙烯架中，将架放入含有40 mL无水乙醇的50 mL硼硅酸盐烧杯中。用石蜡膜覆盖烧杯以防止水分进入，并在室温下以35 kHz频率超声处理10–15分钟（图1A）。
2. 在50 mL烧杯中加入40 mL新配制的piranha溶液，该溶液由在耐热玻璃烧杯中按3:1比例混合浓硫酸和过氧化氢制得。用玻璃移液管搅拌，将盖玻片架转移至烧杯中，在通风橱内室温孵育30分钟以蚀刻盖玻片表面（图1B）。
   注意：穿戴全套个人防护装备（包括实验服、手套和护目镜），并在化学通风橱中操作。将过氧化氢缓慢加入酸中，以防止溶液过热。
3. 蚀刻完成后，用镊子将盖玻片架转移至盛有超纯水的烧杯中。每15秒重复一次，共重复六次，以彻底中和残余酸液（图1C）。
   注意：使用后的piranha溶液应留在化学通风橱中过夜，再倒入酸性废液容器中处理。
4. 目视检查盖玻片表面，确保其清洁、无图案或灰尘颗粒。若发现图案或灰尘，则需重复步骤2.1–2.4。
   注意：通过将处理后的盖玻片垂直浸入水中并取出，测试其表面亲水性。处理后的盖玻片表面水膜均匀回缩形成杨氏环，而未处理的盖玻片则形成水斑。
5. 将盖玻片架转移至盛有无水乙醇的烧杯中，用无水乙醇洗涤两次，每次15秒，使表面与有机溶剂平衡。随后将盖玻片架放入含3% APTES的无水乙醇溶液中，在室温下孵育1小时以完成硅烷化处理（图1D）。用石蜡膜覆盖烧杯。
   注意：APTES沉积参数可能因表面清洗方法、溶剂含水量、APTES浓度、孵育时间及退火温度的不同而有所变化。
6. 将架浸入盛有无水乙醇的洁净烧杯中，每次15秒，重复洗涤三次（图1E）。
7. 使用低压氮气（N₂）吹干盖玻片。将盖玻片放入一个10 cm的聚苯乙烯培养皿中，皿内预先平铺一片石蜡膜。确保盖玻片干燥且彼此分离（图1F）。
8. 在石蜡膜上放置四片盖玻片，每片上加入100 µL浓度为2 mg/mL的NHS-生物素DMSO溶液。将另外四片盖玻片盖在上方，形成“三明治”结构（两片盖玻片相对放置，功能化溶液夹在中间），将培养皿在4 °C下孵育过夜（图1G）。
   注意：在4 °C条件下，NHS试剂更稳定，有助于实现均匀的表面功能化。此外，三明治结构可节约试剂用量。避免加入过多溶液，以防泄漏导致盖玻片滑动。

第2天：

9. 将培养皿从 4 °C 取出，分离夹心式盖玻片。将盖玻片按 图 2A 所示方向放置在支架上，使涂层表面相对。用 200 证明乙醇溶液清洗三次，每次 15 秒。用 N₂ 气体吹干，并将其放入内含石蜡膜的新培养皿中。
   注意：按所示方式放置盖玻片有助于识别功能化表面。
10. 用 1 mL 的 1× PBS 溶液清洗盖玻片三次，使其重新平衡至水相环境。在每片盖玻片上加入 800 µL 含 0.1% 牛血清白蛋白（BSA）的 1× PBS 溶液（w/v），室温孵育 30 分钟，以钝化表面并阻断后续功能化试剂的非特异性结合（图 2B）。
11. 孵育结束后，用 1 mL 的 1× PBS 清洗盖玻片三次。在每片盖玻片上加入 800 µL 含 1 µg/mL 链霉亲和素的 1× PBS 溶液，室温孵育 45–60 分钟，以实现盖玻片的功能化（图 2C）。
    注意：可保留一片未加链霉亲和素的盖玻片用于验证钝化效率（可选）。加入 10 nM 生物素化分子，并在实验条件下成像。该表面荧光强度应接近相机的暗噪声水平。
12. 与步骤 2.11 同时进行，在 PCR 管中将 TGT 探针（上链：下链摩尔比为 1:1）以终浓度 50 nM 溶于 100 µL 的 1 M NaCl 溶液中，使用热循环仪进行退火。95 °C 解链 5 分钟，然后逐步降温至 25 °C 并维持 25 分钟以完成退火（图 2D）。避免 TGT 探针长时间暴露于光照下。
13. 链霉亲和素孵育结束后，用 1× PBS 清洗盖玻片三次。取四片盖玻片，每片加入 100 µL 预组装的 TGT 探针，并用剩余的 4 片盖玻片（功能化面朝向探针）形成夹心结构（共八个表面，需四管杂交完成的 TGT 探针）。用铝箔包裹，室温孵育 1 小时，使探针充分结合至表面（图 2E）。
14. 孵育结束后，分离夹心结构，用 1× PBS 清洗盖玻片三次。此时 TGT 表面已准备就绪，可用于成像。小心将盖玻片装入预先清洁的成像腔室，并加入 1× PBS 以保持表面湿润（图 2F）。
    ​注意：过度拧紧腔室会导致表面破裂。防止表面干燥。

3. 细胞准备与染色

1. 为研究表皮生长因子（EGF）刺激对Cos-7细胞力学特性、黏附及铺展的影响，使用0.05%胰蛋白酶-EDTA处理Cos-7细胞2分钟进行消化。用HBSS洗涤并以800 × g 离心5分钟以中和胰蛋白酶。重复中和步骤一次。
2. 将细胞以4 × 10⁴ 个/孔的密度接种于已组装的TGT表面，培养基为添加50 ng/mL EGF的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），或不含EGF的DMEM。将细胞置于37 °C、5% CO₂ 的细胞培养箱中孵育60分钟，使其充分铺展（图3A）。
   注：为避免血清中生长因子的干扰，细胞在无血清DMEM中孵育。EGF用10 mM乙酸溶解配制成1 mg/mL的储存液，成像实验中使用浓度为50 ng/mL的DMEM溶液。
3. 孵育结束后，用1× PBS洗涤细胞三次，随后加入2 mL 4%多聚甲醛，在室温下固定12分钟（图3B）。
   注：所有孵育步骤均在约35 rpm的旋转摇床上进行，以确保溶液均匀分布。TGT表面需避光覆盖，直至成像前。
4. 吸除固定液，于室温下用1× PBS洗涤盖玻片五次，每次间隔5分钟。可选步骤：将盖玻片置于含50 mM NH₄Cl的1× PBS中，37 °C孵育30分钟以淬灭多聚甲醛引起的自发荧光，随后用1× PBS洗涤三次，每次间隔5分钟（图3B）。
5. 加入缓冲液A（1× PBS、5%正常马血清、5%正常山羊血清、1% BSA、0.025% Triton X-100），37 °C孵育30分钟，用于封闭并通透细胞。随后用1× PBS洗涤三次，每次间隔5分钟（图3B）。
6. 将带有盖玻片的成像腔室置于湿盒中。将一抗（抗paxillin抗体，作为黏着斑标记物）按1:250比例溶于封闭缓冲液（1× PBS、5%正常马血清、5%正常山羊血清、1% BSA、0.005% Triton X-100）中。每张盖玻片加入200 μL一抗溶液，37 °C孵育2小时（图3B）。
   注：避免表面干燥。
7. 用1× PBS洗涤盖玻片五次，每次间隔5分钟，然后放回湿盒中。每张盖玻片加入200 μL封闭缓冲液，其中含按1:800稀释的荧光标记山羊抗兔二抗和按1:400稀释的荧光标记鬼笔环肽（标记肌动蛋白），同时对细胞进行染色。37 °C孵育60分钟（图3B）。
8. 用1× PBS洗涤表面五次，每次间隔5分钟，随后于4 °C保存，待成像时取出（图3B）。
   注：建议在表面制备后3天内完成样品成像，以避免信号衰减。

4. 图像采集

1. 使用倒置显微镜上的60倍油浸物镜（高数值孔径，1.49），配备488、561和647 nm TIRF激发光、RICM激发光、完美聚焦系统以及数字相机。
   1. 在物镜上添加镜油，清洁样品腔盖玻片底部，并将样品放置于载物台上。对焦至一个细胞，并启用完美聚焦功能。
2. 将显微镜切换至RICM成像模式，使用落射荧光激发和GFP滤光立方体，但移除发射滤光片。通过关闭并居中落射照明孔径光阑来校准RICM。
3. 将显微镜切换至TIRF模式，使用激光激发和四通道TIRF滤光立方体。将488 nm激光聚焦到房间天花板上形成一个小光斑，并逐渐增大入射角直至超过临界角，同时在实时模式下监测相机上的荧光信号。当超过临界角时，可观察到背景荧光显著降低，并仅保留一个清晰的焦平面。
   注意：TIRF可激发紧邻样品与盖玻片界面的极薄区域（约100 nm），从而突出显示开放的TGT探针和局灶性黏附结构，同时消除细胞内部的离焦荧光。若无TIRF条件，可使用落射荧光成像；但信噪比将较低。
4. 使用相机的“实时”模式结合RICM观察，选择用于成像的细胞。
5. 依次采集RICM图像以及肌动蛋白（640 nm激发）、整合素张力（561 nm激发）和paxillin（488 nm激发）的TIRF图像，曝光时间设为200 ms。
   注意：曝光时间取决于多种因素，包括物镜、激光功率、发射滤光片和相机灵敏度。信号强度应至少为背景的2倍。背景约为1000 AU，因此信号应至少达到2000–3000 AU。
6. 对至少30个细胞重复步骤4.4–4.5。更换盖玻片，重新对焦，并重复步骤4.4–4.5。

5. 数据分析

注意：使用 Fiji 软件进行定量图像分析，并使用统计学软件进行数据分析。

1. 打开一个细胞的图像集。
2. 在 RICM 图像中使用 ImageJ 的徒手选择工具勾勒细胞边界，创建细胞区域的掩膜（RICM 掩膜）。将该区域保存至 ROI 管理器（分析 > 工具 > ROI 管理器）（图 4A1,2）。
3. 在整合素张力图像中选取细胞外的一个代表性区域，绘制至少 200 × 200 像素的 ROI。确保 ROI 内不包含其他细胞或荧光碎片。使用测量工具（分析 > 测量）测定该 ROI 内的背景荧光强度（图 4A3）。
4. 从张力图像中减去步骤 5.2 获得的平均背景荧光值（处理 > 数学 > 减去）（图 4A4）。
5. 使用步骤 5.2 建立的 RICM 掩膜，定义细胞贴附区域内的张力信号（ROI 管理器 > 选择 > 应用掩膜 > 编辑 > 清除外侧）（图 4A5）。
6. 对张力图像使用 Huang 自动阈值法创建阈值掩膜（图像 > 调整 > 阈值）（图 4A6）。确保阈值掩膜能最佳地反映整合素张力产生的区域。作为经验法则，将阈值设定为平均背景荧光强度的 2 倍。
7. 基于阈值化后的张力掩膜创建选区（编辑 > 选区 > 创建）（图 4A7）。
8. 将选定的掩膜转移至步骤 5.4 生成的张力图像上，并测量开放探针的积分荧光强度（ROI 管理器 > 选择 （张力掩膜）> 分析 > 测量 > RawIntDen）（图 4C）。
9. 从 RICM 掩膜中测量细胞的形态计量学参数，包括面积、圆度和长宽比（ROI 管理器 > 选择 （RICM 掩膜）> 应用掩膜 > 分析 > 测量）（图 4B）。
10. 测量机械断裂密度，定义为探针发生断裂的细胞贴附区域所占百分比：选择张力掩膜图像并应用 RICM 掩膜（ROI 管理器 > 选择 （RICM 掩膜）> 分析 > 测量 > %Area）（图 4C）。
11. 导出测量数据，用于后续的统计分析和可视化。
12. 对每个细胞重复步骤 5.1–5.11。

结果

开启型TGT探针被用于研究配体激活的表皮生长因子受体（EGFR）对Cos-7细胞中整合素介导的细胞力学及黏附形成的影响²¹。该探针呈递环状Arg-Gly-Asp-Phe-Lys（cRGDfK）配体^21,23,25,26，其对整合素异源二聚体αVβ3具有选择性，仅对α5β1整合素具有微弱亲和力^27,28,29,30。TGT探针由一个双链DNA构成，通过生物素-链霉亲和素结合将底链固定在玻璃盖玻片表面。via底链固定于玻璃盖玻片表面。顶链展示整合素配体，并可与细胞膜上的相应整合素受体结合（图5A）。底链标记有荧光团，顶链标记有淬灭剂，因此当双链TGT完整时，背景荧光极低。当整合素结合配体并施加超过探针T_tol的力时，DNA双链将发生解离，从而产生荧光信号（图5A）。任何未被机械力破坏的TGT探针将保持非荧光状态。这种力选择性的荧光开启机制可在衍射极限分辨率下系统性、定量地绘制皮牛顿（pN）尺度的整合素产生力图谱。此外，TGT探针还可调节基底的张力阈值。

此处展示的是一个具有 56 pN T_tol 的 TGT 表面的代表性示例。将 Cos-7 细胞接种于该 TGT 表面，并在有或无 EGF 刺激的条件下培养，以研究配体刺激下 EGFR 激活对细胞黏附和整合素力学的影响（图 5A、B）。细胞在 TGT 表面上有或无 EGF 刺激孵育 60 分钟，随后固定并进行免疫荧光染色，以显示黏着斑分布（paxillin）和细胞骨架的组织结构（F-actin）（图 5B）。然后使用反射干涉显微镜（RICM）和全内反射荧光显微镜（TIRF）对细胞成像。RICM 图像中可明显看出，在 56 pN TGT 表面上，经 EGF 刺激后 Cos-7 细胞的铺展显著增强，相较于无刺激组。通过测量 RICM 图像中细胞-基底接触区域的大小，对每种条件下 50 个细胞进行了量化分析（图 5C）。经 EGF 刺激后，细胞呈现更趋圆形的形态，这代表了 Cos-7 细胞在其天然生理环境中铺展和生长的典型特征（图 5D）。在张力荧光图像中也可观察到，EGF 刺激下开放探针的荧光信号更强。开放探针的积分荧光强度（与开放探针数量成正比）在 EGF 刺激下明显高于无刺激组（图 5B、E）。这反映了所有受体-配体结合事件中，整合素施加的力超过 T_tol（56 pN）的情况。

使用paxillin染色显示，EGF刺激也影响了黏着斑的分布、数量、成熟度（大小）和组织结构。与未添加EGF的对照组相比，经EGF刺激的细胞中的黏着斑显得更为成熟，并呈放射状排列。通过鬼笔环肽染色评估发现，EGF刺激还增强了F-肌动蛋白细胞骨架的组织性（图5B）。这些定性评估是通过对两组处理的图像进行视觉比较得出的。虽然可以进行黏着斑的定量分析，但这超出了本实验方案的范围。在本实验中，TGT表面为系统阐述EGFR激活对细胞铺展、整合素力学以及黏着斑形成的影响提供了平台。

图1：TGT表面制备第一天的示意图。 （A）清洗盖玻片。（B）蚀刻盖玻片表面。（C）中和piranha溶液。（D）对表面进行硅烷化处理以生成反应性氨基。（E）使盖玻片与有机相平衡。（F）用惰性气体干燥盖玻片。（G）对表面的氨基进行生物素标记。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：TGT表面制备第二天的示意图。（A）清洗并干燥盖玻片，以去除前一天残留的生物素。（B）用BSA进行封闭，防止后续步骤中试剂发生非特异性结合。（C）用链霉亲和素对盖玻片进行功能化处理。（D）在热循环仪中使探针杂交。（E）将合成的探针加到盖玻片上。（F）将盖玻片组装到细胞成像室中。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：整个实验设置中主要步骤的总体工作流程示意图。（A）在基础培养基（DMEM）中将细胞从培养表面解离并接种到TGT表面的过程，可选择是否添加EGF刺激。（B）细胞在TGT表面贴附并铺展后，进行固定和免疫染色各步骤的流程图。（C）染色完成后，使用倒置荧光显微镜结合RICM和TIRF显微镜对细胞进行成像。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：数据处理与定量分析示例。 （A）在 Fiji（ImageJ）中用于 RICM 和张力图像定量分析的分析流程逐步分解图。 （B）使用上述流程分析细胞形态计量学结果的代表性示例。 （C）使用上述流程分析细胞力学结果的代表性示例。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：TGT 实验的示例数据。 （A）示意图突出显示细胞膜与 TGT 表面界面处的接触区域。插图展示了整合素与其特异性配体 cRGDfK 的相互作用，在有（右）或无（左）EGF 刺激的情况下。 （B）Cos-7 细胞在 56 pN TGT 表面上铺展后的 RICM 和 TIRF 图像。图像采集于接种后 60 分钟，分别在有或无 EGF 刺激条件下获取。分别展示了 RICM（原始采集图像）、整合素张力（灰度）、paxillin（橙红色调）和 F-actin（蓝绿色）图像，并对两种刺激条件均提供了叠加图像。比例尺：10 μm。插图放大显示了一个感兴趣区域（ROI），详细说明了由 paxillin 标记的黏附形成位点处产生的整合素张力，以及由肌动蛋白标记的底层亚细胞骨架组织的共定位情况。比例尺：5 μm。 （C-E）Cos-7 细胞在有或无 EGF 刺激条件下的铺展面积（RICM 细胞投影面积）（C）、圆形度（D）和总张力积分值（E）的散点图。柱状图表示均值 ± 标准差。组间差异通过 Student's t-检验进行统计学评估；****P < 0.0001。数据来自三次独立实验，共分析了 50 个细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6：不同潜在问题的TGT表面示例。（A）理想TGT表面的张力和RICM图像，探针在细胞黏附前已组装并淬灭。（B）TGT探针缺少上链（淬灭剂）的TGT表面的张力和RICM图像。张力图像显示下链中开放荧光团的均匀荧光。（C）细胞在理想TGT表面上铺展的张力和RICM图像。（D）细胞在制备不良的TGT表面上铺展的张力和RICM图像，该表面存在钝化不足或探针降解问题。（E）细胞接种在含cRGDfK配体的理想表面上的张力、RICM和明场图像，表明cRGDfK-整合素相互作用对细胞黏附和张力生成至关重要。（F）细胞接种在TGT表面无cRGDfK配体的表面上的张力、RICM和明场图像。尽管明场图像中可见细胞，但未观察到细胞黏附或整合素张力的生成。比例尺：10 μm。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

通过上述详细的逐步操作流程，可制备TGT表面，用于量化经EGF处理后贴壁细胞在黏附和铺展过程中产生的细胞形态变化及整合素张力。该探针设计简洁，合成与表面制备过程简便，实验装置简单，为研究EGFR与整合素之间的相互作用提供了稳定的平台。总体结果表明，配体依赖性激活的EGFR可增强细胞铺展，调节整合素受体的承力特性，并促进黏着斑的组装与成熟。利用TGT探针获得的结果支持了总体假设：生长因子（如EGFR）可作为“机械组织者”，增加整合素张力的强度及其空间分布的有序性，并调控黏着斑的取向与力学特性。

当细胞施加于TGT表面时，其会着陆、附着并铺展，此时整合素（αVβ3）受体感知并结合cRGDfK配体。在此过程中，TGT探针可能因机械断裂而在配体结合位点产生荧光信号。该信号读出的是细胞与表面相互作用过程中的累积"受力历史"。在这些实验中，TGT表面可能出现一些常见问题，例如表面背景荧光过高（图6A、B）、表面呈现斑驳外观、细胞未能产生张力信号（图6C、D）以及细胞未能铺展（图6E、F），这些问题可能源于TGT探针或表面合成过程中的技术缺陷。针对这些常见问题的解决方案见表1。

TGT探针的简单设计为细胞生物学家提供了一种强大工具，可在仅提供特定配体和刺激的情况下，独立研究特定生长因子-整合素信号转导的结果，而不受其他细胞表面受体的干扰。此外，TGT探针能够在细胞黏附过程中以皮牛顿（pN）级别的灵敏度，检测单个整合素受体所涉及的张力阈值。其他方法无法在固定样本中以高空间分辨率报告单个受体施加的力³¹。牵引力显微镜仅对纳牛顿（nN）级别的力敏感，比单个整合素受体施加的力高出一个数量级¹⁵；而分子张力探针虽可测量皮牛顿级别的力，但由于其可逆性，无法在固定过程中保持稳定。基于这些原因，TGT探针成为研究生长因子-整合素相互作用力学特性的理想工具。

在设计实验之前，应考虑与TGT探针相关的若干技术细节。张力图像代表的是某一时间点的快照，反映的是受体-配体相互作用的力历史，而非在任意特定时刻受体-配体结合状态的指示。由于信号的产生依赖于探针的分离，TGT荧光来源于未处于受体-配体相互作用主动张力下的开放探针。这意味着在TGT表面获得的整合素张力读数具有历史性和累积性，仅反映曾经存在超过T_tol的力的位置；而当前受体-配体作用力低于T_tol的位置则不会被报告^19,32。由于TGT断裂会导致受体-配体相互作用的终止，因此细胞铺展是由所受力低于T_tol的整合素-配体相互作用所介导的。因此，用户在定义接种后的时间点以评估基于整合素黏附的力学结果时必须谨慎。最后，必须理解T_tol的含义。本研究所采用的TGT探针的T_tol为56 pN，其中T_tol是指在持续施加2秒时能够使50%探针断裂的恒定力值。在复杂的生物系统中，TGT探针可能经历具有不同时间依赖性的异质且多样的力梯度。若TGT探针受到高于T_tol的力而断裂，则荧光信号将低估总张力。相反，低于T_tol的力若作用时间更长，也可能导致与高强度短时作用力相似数量的探针断裂。上述两种情况可能产生相同的荧光强度读数，使得利用TGT探针难以分辨确切的张力大小或动态变化^33,34。

总体而言，在进行生长因子刺激下整合素张力的评估时，应谨慎设计实验，设置内部对照，比较细胞在其他基质包被表面的铺展特征，平行检测有无生长因子刺激条件下细胞中TGT荧光信号的变化，并使用具有不同T_tol的TGT探针。TGT技术可实现对生长因子信号通路在调控整合素受体力学特性、黏着斑动态行为及细胞铺展过程中作用的定量分析。本实验方案可作为多种基于TGT探针的研究工作的模板，适用于不同T_tol、不同配体、不同细胞类型或不同刺激条件的实验体系。固定后可对任何感兴趣的蛋白质进行标记，并可采用任意类型的定量图像分析方法。因此，本文提供了一个适用于多种TGT实验的通用模板。

TGT探针的应用不仅限于整合素的研究，通过更换配体，还可扩展至不同类型细胞的多种细胞膜受体。TGT探针已被用于研究力学在调控各种受体信号通路中的作用，包括揭示Notch受体力学在胚胎发育和神经发生中的机械作用³⁵，B细胞受体识别和内化抗原过程中介导的力学作用³⁶，以及T细胞表面受体通过检测力学变化实现机械校对的能力，从而增强信号传递的强度与特异性³⁷。这些研究结果共同凸显了TGT探针在多种实验条件下的巨大应用潜力。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷	Millipore Sigma	440140	表面制备
3-羟基吡啶甲酸（3-HPA）	Millipore Sigma	56197	MALDI-TOF-MS 基质
冰醋酸	Fisher Scientific	A38S	EGF 稀释
乙腈（HPLC 级）	Fisher Scientific	A998SK	寡核苷酸制备
Alexa Fluor 488 鬼笔环肽	Cell Signaling Technology	8878S	免疫细胞化学
氯化铵	Fisher Scientific	A687	免疫细胞化学
抗 Paxillin 抗体 [Y113]	Abcam	ab32084	免疫细胞化学
BD 带鲁尔锁扣的注射器	BD bioscience	309657	表面制备
Bio-Gel P-2	Bio-Rad	1504118	寡核苷酸制备
无蛋白酶牛血清白蛋白（BSA）粉末	Fisher Scientific	BP9703100	表面制备
Cos-7 细胞	ATCC	CRL-1651	细胞培养，传代次数 11–20
8 片盖玻片用小型支架	Fisher Scientific	C14784	表面制备
c(RGDfK(PEG-PEG))，其中 PEG = 8-氨基-3,6-二氧代辛酸	Vivitide	PCI-3696-PI	寡核苷酸制备
Cy3B NHS 酯	GE Healthcare	PA63101	寡核苷酸制备
二甲基甲酰胺	Millipore Sigma	PHR1553	寡核苷酸制备
含 L-谷氨酰胺、4.5 g/L 葡萄糖和丙酮酸钠的 DMEM 培养基	Fisher Scientific	MT10013C	细胞培养
人表皮生长因子（EGF）	Millipore Sigma	E9644	细胞培养
乙醇，200 证明（100%）	Fisher Scientific	22032601	表面制备
Falcon 标准组织培养皿	Fisher Scientific	08-772E	表面制备
胎牛血清	Fisher Scientific	10-438-026	细胞培养
Flurobrite DMEM 培养基	Fisher Scientific	A1896701	细胞培养
山羊抗兔 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647 标记	Invitrogen	A-21244	免疫细胞化学
山羊血清	Fisher Scientific	16-210-064	免疫细胞化学
Hank’s 平衡盐溶液（HBSS）	Fisher Scientific	14-170-161	细胞培养
马血清	Fisher Scientific	16050130	免疫细胞化学
过氧化氢	Fisher Scientific	H325-500	表面制备
Nanosep MF 离心过滤装置	Pall laboratory	ODM02C35	寡核苷酸制备
NHS-叠氮化物	Fisher Scientific	88902	寡核苷酸制备
氮气钢瓶	Airgas		表面制备
2 号圆形玻璃盖玻片，直径 25 mm	VWR	48382-085	表面制备
Parafilm M 实验室封口膜	Fisher Scientific	13-374-10	表面制备
16% 戊二醛	Fisher Scientific	50-980-487	免疫细胞化学
PBS，1×	Fisher Scientific	21-030-CV	表面制备/免疫细胞化学
青霉素-链霉素（5,000 U/mL）	Fisher Scientific	15-070-063	细胞培养
PYREX 低型 Griffin 烧杯	Fisher Scientific	02-540G	表面制备
抗坏血酸钠	Fisher Scientific	18-606-310	寡核苷酸制备
碳酸氢钠	Fisher Scientific	S233	寡核苷酸制备
氯化钠	Fisher Scientific	BP358	表面制备
链霉亲和素	Fisher Scientific	434301	表面制备
磺基-NHS-LC-生物素	Fisher Scientific	21335	表面制备
硫酸	Fisher Scientific	A300-500	表面制备
TEAA	Fisher Scientific	NC0322726	寡核苷酸制备
三乙胺	Millipore Sigma	471283	寡核苷酸制备
三氟乙酸（TFA）	Fisher Scientific	PI28901	寡核苷酸制备
THPTA	Fisher Scientific	NC1296293	寡核苷酸制备
曲拉通 X-100 去垢剂表面活性剂溶液	Fisher Scientific	85111	免疫细胞化学
DNA 级水，无 DNase 和蛋白酶	Fisher Scientific	BP24701	寡核苷酸制备
设备
Agilent AdvanceBio 寡核苷酸 C18 柱，4.6 × 150 mm，2.7 μm	Agilent	653950-702	寡核苷酸制备
高效液相色谱仪	Agilent	1100	寡核苷酸制备
低速轨道摇床	Fisher Scientific	10-320-813	免疫细胞化学
基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）	Voyager STR		寡核苷酸制备
Molecular Probes Attofluor 细胞培养腔室	Fisher Scientific	A7816	表面制备
Nanodrop 2000 紫外-可见分光光度计	Thermo Fisher		寡核苷酸制备
Nikon Eclipse Ti 倒置显微镜	pe Nikon		显微镜
Nikon 完美对焦系统	Nikon		显微镜
NIS Elements 软件	Nikon		显微镜
ORCA-Flash4.0 V3 数字 CMOS 相机	Hamamatsu		显微镜
四通道 TIRF 405/488/561/647 滤光片组	CHROMA		显微镜
RICM 滤光片组	CHROMA		显微镜
SOLA v-nIR 光源引擎	Lumencor		显微镜
Thermo Forma Steri Cycle 370 CO2 培养箱	Fisher Scientific		细胞培养
VWR 75D 超声波清洗器	VWR	13710	表面制备
数据分析			用途
Fiji（Image J）		https://imagej.net/software/fiji/downloads	定量分析
GraphPad Prism	Graph Pad		统计分析
寡核苷酸名称	5'修饰/3'修饰	序列（5' 至 3'）	用途
Alkyne-21-BHQ2	5' 己炔基/3' BHQ_2	GTGAAATACCGCACAGATGCG	上链 TGT 探针
56 pN TGT	5' Biosg/TTTTTT/iUniAmM	CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT	下链 TGT 探针
12 pN TGT	5' AmMC6/3' BioTEG	CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT	下链 TGT 探针