小动物模型中腺相关病毒载体的结膜下给药

摘要

在本研究中，通过使用由输注/抽取注射泵、可拆卸气密注射器及显微注射针组成的注射系统，证明了结膜下注射可作为小鼠眼组织有效的载体递送方法。该注射系统也可适用于其他眼内给药途径。

摘要

眼病包括多种遗传性和获得性病变，由于可通过多种给药途径相对容易地进行局部给药，这些疾病成为局部药物递送的理想靶点。与其它眼内给药途径相比，结膜下注射（SCJ）具有操作简便、安全性高、通常可在门诊条件下完成等优势。由于小动物眼球尺寸较小，进行结膜下注射通常需要手术显微镜的辅助。已有研究表明，特定血清型的腺相关病毒（AAV）通过结膜下注射是一种有效的基因递送策略，可实现对眼表、眼外肌、角膜及视神经的靶向转导，为多种眼病的治疗提供了潜在途径。

本文介绍了一种在小鼠模型中进行巩膜睫状体交界区（SCJ）注射的详细实验方案，所用注射系统包括可编程输注/回抽式注射泵（可实现稳定且精确的注射速度与压力）以及与微注射针头连接的无泄漏可拆卸注射器。该注射系统亦可适用于小动物其他眼内给药途径，如角膜基质内、前房内、玻璃体内及视网膜下注射。尽管文中以腺相关病毒载体（AAV）在眼科基因治疗研究中的递送为例进行描述，但本方案亦可适用于多种小动物模型中的眼科溶液给药。本文将详细讨论该给药途径的关键操作步骤、注射平台的设置、注射前准备以及来自实际操作经验的技术要点。此外，还将简要介绍用于确认AAV成功递送至目标组织的常用验证技术。

引言

眼病包括多种遗传性和获得性疾病。2015年，全球约有3600万人被认定为法定盲人，超过10亿人至少存在一定程度的视力障碍，这凸显了在各个层面加强防治工作的迫切需求¹。眼部药物递送的主要方法包括局部给药和眼内局部注射，例如滴眼液或结膜下（SCJ）、前房内、玻璃体内和视网膜下注射。尽管无创的局部治疗是眼科药物最常用的给药方式，并广泛用于多种眼前段疾病，但角膜解剖屏障的存在限制了局部给药物质的生物利用度、生物分布和疗效，提示该方法可能并非治疗许多眼内疾病的最佳选择。将药物直接注射至受累的眼内特定腔室可能是更有效且靶向性更强的给药策略²。然而，反复注射可能引发不良反应，使治疗方案复杂化。理想的治疗方法应在单次给药后即可维持长期的治疗效果。因此，基因治疗有望减少所需注射次数，并实现外源基因的持续表达，为治疗眼病提供一种极具前景的方案^3,4。

目前有多种病毒性和非病毒性载体可用于基因治疗，但腺相关病毒（AAV）载体因其出色的安全性而备受关注。AAV是一种小的、单链、无包膜的DNA病毒，最初由Atchison等人于1965年在腺病毒制备物中作为污染物发现^5,6。随后在20世纪80年代，AAV被改造为一种高效的病毒载体用于基因递送，并在近几十年来成为包括眼病在内的多种疾病基因治疗的首选载体。其中最显著的例子是首个上市的基因治疗药物——voretigene neparvovec，该药物已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，用于治疗一种罕见的后部眼病——莱伯氏先天性黑蒙症（Leber's Congenital Amaurosis）。尽管voretigene neparvovec已成功克服了临床开发中的诸多障碍，但其他眼科基因疗法的商业化仍面临挑战。例如，voretigene neparvovec需通过视网膜下注射给予仍保留有活性视网膜细胞的患者。因此，对于疾病进展较晚期、缺乏可存活视网膜细胞的患者而言，该治疗无效，不符合治疗适应证。此外，临床观察到与视网膜下注射相关的已知并发症，包括眼部炎症、白内障、视网膜撕裂、黄斑病变和疼痛^7,8。与此操作相关的其他担忧还包括出血、视网膜脱离、眼内炎，以及因眼组织破坏导致眼部免疫豁免状态丧失的风险^9,10,11,12。因此，探索侵入性更小的基因递送途径（如SCJ注射）的研究正变得日益重要^{13,14,15,16,17}。

结膜是一种薄层膜，由3至5层细胞构成，连接眼球前部与眼睑内侧。结膜下注射（SCJ注射）在临床上用于向眼部的前段和/或后段递送药物，以治疗年龄相关性黄斑变性、青光眼、视网膜炎及后部葡萄膜炎等眼病^18,19。该方法操作相对简便，在门诊环境中常规用于眼科药物递送²⁰，疼痛轻微，不会破坏眼部的免疫豁免状态，并可使给药后的药物扩散至包含视神经在内的较大眶周区域。因此，SCJ 注射是AAV基因治疗应用中一种具有吸引力的给药途径。既往已在小鼠中通过SCJ注射途径对天然AAV血清型的安全性、转导效率、血清免疫原性、生物分布及组织特异性进行了表征^13,16,21。这些数据表明，通过SCJ给药实现向特定眼部组织的基因递送在理论上是可行的。

本文介绍了一种简单且可调节的小鼠模型中通过巩膜睫状体交界处（SCJ）注射递送腺相关病毒（AAV）载体的实验方案。为确保该方法的可重复性，文中描述了一套注射系统，包括体视显微镜、可编程推注/回吸式注射泵（可实现稳定且精确的注射速度与压力控制），以及与微注射针头连接的气密性可拆卸注射器。该系统适用于小型动物其他眼内给药途径，如角膜基质内、前房内、玻璃体内和视网膜下注射。此外，通常使用荧光素染料以可视化AAV注射部位。本文将详细讨论给药途径中的关键操作步骤、注射平台的设置、注射前准备以及来自实际操作的经验技巧。最后，简要介绍用于确认AAV成功递送至目标组织的常用验证技术。

方案

所有动物实验均按照北卡罗来纳大学教堂山分校机构动物护理和使用委员会的规定进行。使用腺相关病毒（AAV）载体属于生物安全等级1级的生物危害风险。在操作AAV时，应穿戴适当的个人防护装备，包括实验服、手套和护目镜。在本实验中，采用了一种重组AAV载体，该载体包装了8型血清型衣壳，并携带由通用的普遍性巨细胞病毒（CMV）启动子控制绿色荧光蛋白（GFP）表达的编码序列。

1. AAV 载体的处理与保存

1. 将病毒以100 µL分装于硅化或低吸附的微量离心管中，于-80 °C冰箱中保存。
2. 使用前将所有载体储存液置于冰上解冻。
   ​注意：通常将荧光素钠溶液等染料（终浓度为0.1–2%）与AAV载体混合，以可视化注射溶液。此外，观察注射溶液有助于检测气泡，并监测注射后AAV的分布情况和/或渗漏情况。

2. 结膜下（SCJ）注射

1. 组装注射系统。
   1. 组装注射系统时，将体视显微镜和注射泵放置于生物安全柜中。
      注意：需要使用输注泵以高精度进行注射。本实验采用标准推注/回抽可编程注射泵（见材料表），该泵配备牢固的夹持装置和适用于0.5 µL至60 mL注射器的安全夹具。该泵还提供增强的流体性能，具有高准确性和平稳的流速，范围为1.28 pl/min至88.28 ml/min。
   2. 将聚乙烯管剪成约50 cm长（见材料表）。
   3. 将36 G针头的针座端插入管的一端。
      注意：将针座端滑入管中约3 mm，以确保无泄漏。36 G针头用于后续的球结膜下注射（SCJ）。32 G至36 G的针头是SCJ注射中最常用的规格。强烈建议使用止血钳辅助此步骤，以避免锐器损伤的风险。
   4. 用无菌水填充一次性3 mL注射器；将该一次性注射器插入与针头相对的管端，并将水冲洗通过整个管路/针头。再用70%酒精重复此步骤。
   5. 重复步骤2.1.4三次，交替使用无菌水和70%酒精冲洗，以消毒管路并确保在整个管路中无泄漏、堵塞或损坏现象。
   6. 使用一次性3 mL注射器将管路充满无菌水，并保持管路连接在一次性注射器上。
   7. 在实验台表面放置一片封口膜，并在其上加入约1 mL无菌水形成液滴。将连接针头的管段浸入无菌水液滴中。从另一端拔出一次性注射器时，拉动注射器活塞以防止空气进入管路/针头系统。保持连接针头的管段浸没在水中。
      注意：步骤2.1.4至2.1.7应在层流罩内进行。
   8. 用无菌水填充10 µL Hamilton注射器/针头，避免注射器内存在空气。通过将管路和Hamilton注射器针尖浸入封口膜上的无菌水液滴中，将Hamilton注射器/针头连接至管路的另一开放端。
   9. 按下泵屏幕上快速回退按钮，使推杆块移动至注射器的大致长度位置。松开支架夹紧旋钮，放松推杆和注射器支架块上的固定支架。根据制造商说明，将Hamilton注射器装入注射器支架块并固定注射器。
      注意：为固定注射器，注射器筒夹应紧贴注射器筒身；但不要过度拧紧，尤其是使用玻璃注射器时。 注射器推杆应由推杆块固定支架夹紧。
   10. 在泵设置界面中调整参数。
       1. 按下力值按钮，将力值设为30%。确认更改后返回设置界面。
       2. 按下快速启动按钮，选择方法 | 推注/回抽。
       3. 对于注射器，选择Hamilton 1700, 玻璃, 10 µL。设置推注速率、回抽速率和注射体积。
          注意：力值设置取决于注射器类型/材质/容量/制造商；请参阅厂家建议的每种注射器的推荐力值。本实验使用的注射速度为200 nL/s。SCJ注射相对安全，注射引起眼内压（IOP）升高的风险较小。对于某些应用，较慢的注射速度通常更理想，以避免液体反流至针头，并保持动物间注射的一致性。
   11. 排出Hamilton注射器中的水，但保持管路和注射针内充满水。通过按下回退按钮轻微回拉Hamilton注射器，在管路/针头中引入一个小气泡。
       注意：该气泡将作为管路中水与治疗药物（本例中为AAV）之间的屏障，确保给药剂量的准确性。
   12. 将注射针插入病毒原液分装管中，回抽病毒。确保病毒与管路中的水之间保留一个可见的气泡。
       注意：AAV载体可结合塑料管路和金属针头，导致病毒损失和/或给药剂量不准确。因此，为确保实验严谨性、可重复性和AAV剂量的准确性，建议预先包被后续与AAV接触的表面。为包被管路/针头系统，将病毒载体溶液吸入管路/针头中，在室温下孵育10分钟，使病毒充分结合至针头和/或管路内壁。随后弃去病毒溶液。
2. 病毒注射
   1. 使用吸入麻醉（异氟烷）或腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪/乙酰丙嗪对小鼠进行麻醉。通过用力捏压脚趾无反应来确认手术麻醉深度。
      注意：使用至少6周龄的雌性或雄性C57BL/6J或BALB/c小鼠。氯胺酮/赛拉嗪/乙酰丙嗪的剂量如下：氯胺酮70 mg/kg，赛拉嗪7 mg/kg，乙酰丙嗪1.5 mg/kg。
   2. 对接受注射的眼部使用局部麻醉剂。
      注意：使用0.1%盐酸丙帕他卡因和/或0.5%盐酸丁卡因眼科溶液进行局部麻醉。
   3. 对未接受注射的另一只眼睛涂抹眼膏，以防止干燥和损伤。
   4. 将小鼠置于显微镜载物台上，在体视显微镜下暴露小鼠眼部。
   5. 用两根手指捏住眼睑，轻轻将其从小鼠眼球上拉开，以暴露结膜，即连接眼睑与巩膜的内层膜。
   6. 用镊子夹住结膜。
   7. 松开眼睑，用惯用手握住针头，使针尖斜面朝上。
   8. 将针头插入结膜，直至针尖斜面完全被结膜覆盖。将针头贴紧眼球表面。
      注意：由于结膜为透明膜，针尖/斜面清晰可见。
   9. 使用脚踏开关按下开始按钮启动注射。
      注意：气泡移动与Hamilton注射器推杆运动同步；任何延迟均提示注射系统中存在多余空气，或管路、针头和/或注射器组件之间连接松动。
   10. 注射完成后，保持针头在原位10秒后再从结膜中拔出，以减少反流的可能性。
       注意：SCJ注射部位常出现水疱样隆起（bleb），此类隆起通常在注射后数小时内完全消退。
   11. 在小鼠眼睛上滴一滴局部润滑凝胶，防止眼部干燥或损伤，然后将小鼠置于加热垫上恢复。
   12. 进行眼部检查，如泪液分泌量、眼内压（IOP）和裂隙灯检查，并结合角膜荧光素染色评估注射后眼部异常。
       注意：泪液分泌量通过酚红棉线试验测定，常用眼压计检测小鼠眼内压。据报道，某些眼内注射（如玻璃体内注射）可能导致眼内压显著升高；然而，SCJ注射后的眼内压变化并不明显^13,22,23,24。
3. 结膜下注射后AAV的生物分布及转导效率检测
   1. 为研究通过SCJ递送的AAV载体的病毒基因组生物分布和/或转导特性，采用AVMA批准的方法处死小鼠。
      注意：本实验中，小鼠在注射后8周被处死。
   2. 为分析靶向眼部组织区室的生物分布和转基因表达，解剖相关感兴趣组织，如眼睑、角膜、结膜、眼外肌、视网膜和视神经。迅速冷冻所有组织并储存在-80 °C。为检测全身AAV生物分布，采集如下颌下淋巴结和肝脏等器官，迅速冷冻并储存在-80 °C。
   3. 使用DNA/RNA提取试剂盒，从同一样本中分别提取基因组DNA（gDNA）和RNA，用于检测转基因表达和AAV生物分布。若仅需检测载体生物分布，可使用DNA提取试剂盒提取gDNA。
   4. 使用载体特异性引物/探针进行标准qPCR和RT-qPCR，以确定AAV载体的生物分布和cDNA丰度^13,25。
   5. 进行组织学分析时，固定眼球，包埋于石蜡中，并切成5 µm厚切片。进行标准免疫荧光染色以显示转基因表达²⁶。

结果

注入结膜下间隙的溶液会根据注射体积形成水疱样隆起（bleb）。
本实验中，将7 µL AAV（7 × 10⁹ 病毒基因组拷贝 (vg)/眼）与荧光素混合至终浓度为0.1%，使用36 G针头在体视显微镜下进行注射，并通过可编程注射泵以1 µL/s的速度恒定控制注射速度/压力。注射过程中可见水疱样隆起形成（箭头所示）。小鼠结膜下间隙（SCJ）注射AAV载体的显微图像见图1。

注入结膜下间隙的物质会围绕眼球扩散，并分布于眼周组织中。
为了明确通过结膜下注射（SCJ）给予的AAV的分布情况，将7 µL稀释的印度墨水注射到一只10月龄小鼠的结膜下间隙。注射过程中及注射后均未观察到出血、渗漏或回流现象。注射后30分钟，取材眼部及周围组织，并用苏木精和伊红（H&E）染色以观察印度墨水的分布情况。图2所示的代表性矢状切片显示，印度墨水的扩散主要发生在眼外肌附近、巩膜外...

讨论

腺相关病毒介导的基因治疗在治疗眼部疾病方面具有巨大潜力。目前的眼部基因治疗主要依赖两种局部给药途径：玻璃体内注射和视网膜下注射。然而，这两种途径均具有侵入性，可能引起严重并发症，包括视网膜脱离、白内障形成和眼内炎。因此，探索相对创伤较小的给药途径（如结膜下注射）具有重要意义。

尽管该技术相对简单且侵入性显著较低，但仍需强调腺相关病毒（AAV）递送过程中的几个重要方面。 建议将AAV载体分装于硅化或低吸附的微量离心管中，每管体积为所需体积（本实验为100 µL），并在-80 °C保存，以避免反复冻融，防止病毒滴度下降。本实验所用载体在-80 °C保存约6年，未出现滴度显著降低的情况。此外，载体的组成可能影响病毒载体的稳定性。本实验中，病毒载体为含350 mM NaCl和5% D-山梨醇的磷酸盐缓冲液（PBS）。本研究所用病毒的滴度为5.1 × 10⁹ vg/µL（通过qPCR测定），每眼注射总量为7 × 10⁹ vg。然而，根据靶组织和目的基因的不同，每眼注射1 × 10⁸–1 × 10¹⁰

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
36 G NanoFil 针头	World Precision Instruments	NF36BV-2
AAV 载体	北卡罗来纳大学教堂山分校	/
乙酰丙嗪	Henry Schein	NDC 11695-0079-8
抗 GFP 抗体	AVES Labs 公司
数码相机	佳能	佳能 EOS T5i
DNA/RNA 提取试剂盒	Qiagen	80204
镊子	精细科学工具公司	F6521
哈密尔顿注射器	Hamilton	7654-01
印度墨水	StatLab	NC9903975
盐酸氯胺酮注射液	Henry Schein	NDC 0409-2051-05
防潮膜	Parafilm	807-6
聚乙烯导管	贝克顿·迪金森公司	427401
0.1% 丙帕卡因	Bausch Health 美国公司	NDC 24208-730-06
回弹式眼压计	Tonovet	/
荧光素钠溶液	Sigma-Aldrich	46960
标准推注/抽取泵 11 Pico Plus Elite 可编程注射泵	哈佛生物科学公司	70-4504
体视显微镜	徕卡	Mz6
0.5% 盐酸丁卡因眼科溶液	博士伦公司	处方药
局部眼膏	GenTeal	NDC 0078-0429-47
赛拉嗪	Akorn	NDC 59399-110-20
Zone-Quick 酚红棉线盒（100 根）	ZONE-QUICK	PO6448