原子力显微镜压痕实验方案能够解析在正常或受限生长条件下（例如，在水分亏缺情况下），组织或器官中特定细胞的细胞壁物理特性所起的作用。
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方法文章
利用原子力显微镜研究活体表皮细胞的物理特性 拟南芥 根
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摘要
摘要
本文介绍了一种利用原子力显微镜（AFM）结合倒置荧光光学显微镜，通过纳米压痕技术对活体拟南芥根表皮细胞细胞壁物理特性进行表征的方法。该方法通过对样品施加可控的力并同时测量其形变，可量化细胞壁在亚细胞分辨率下的表观杨氏模量等参数。实验需对样品进行精确的机械固定，并合理选择压头及压痕深度。尽管该方法仅适用于外部组织，但可用于表征植物细胞壁在发育过程中的力学变化，并实现这些微观力学变化与整个器官生长之间的关联分析。
引言
植物细胞由细胞壁包围，细胞壁是一种复杂的结构，由相互作用的多糖、蛋白质、代谢物和水构成的网络组成，其厚度从0.1到几微米不等 µm 取决于细胞类型和生长阶段1,2细胞壁的机械特性在植物生长过程中起着至关重要的作用。细胞壁刚度较低被认为是细胞生长和细胞壁扩张的前提条件，越来越多的证据表明，所有细胞均能感知机械力以执行其功能。然而，细胞壁物理性质的改变是否决定细胞命运，目前仍存在争议。2,3,4由于植物细胞在发育过程中不会移动，器官的最终形态取决于细胞扩展的方向和程度。因此，拟南芥根是研究细胞壁物理特性对细胞扩展影响的理想模型，因为根部不同区域会发生不同类型的扩展。例如，各向异性扩展在伸长区尤为明显，特别是在表皮细胞中5.
本文所述方法利用原子力显微镜（AFM）结合倒置荧光相差显微镜，在纳米尺度上对活体拟南芥根表皮细胞的细胞壁物理特性进行了表征6。有关原子力显微镜技术的全面综述，请参阅文献7,8,9。
本方案概述了一种植物细胞壁基于原子力显微镜（AFM）的弹性测量的基本样品制备方法和通用方法。
图1：利用原子力显微镜（AFM）在拟南芥根中进行力-压痕实验的示意图。 该示意图概述了力-压痕实验的各个步骤，包括用于牢固固定根样本的基底制备（1-2）、通过碘化丙啶染色确认根的活性（3）、将悬臂梁定位在主根伸长区表皮细胞表面（4-5）、测量力-压痕曲线（6），以及处理力-压痕曲线以计算表观杨氏模量（7-8）。EZ：伸长区。 请点击此处查看此图的放大版本。
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方案
1. 植物材料的准备与培养条件
- 为获得所需的植物材料，对拟南芥野生型及目标突变品系的种子进行表面灭菌。
注意：本实验中使用了以下材料：ttl1：T-DNA 插入系 Salk_063943（对应 TTL1 基因，AT1G53300）—哥伦比亚-0（Col-0）野生型；Procuste1 (prc1-1) 突变体，该突变体在 CESA6 基因（AT5G64740）中具有敲除突变（Q720终止），如先前文献10,11所述；以及 ttl1 x prc1-1 双突变体。- 取约 50 μL 种子置于微量离心管中。加入 500 μL 室温的 70% 乙醇 + 0.01% Tween 溶液。混匀后，室温孵育 7 分钟。
- 倒去乙醇溶液，加入 500 μL 20% 次氯酸钠溶液。混匀后孵育 7 分钟。
- 倒去次氯酸钠溶液，用无菌水清洗种子三至四次。
- 播种
- 提前配制基本 Murashige 和 Skoog (MS) 培养基12 + 1.5% 蔗糖 + 1% 琼脂（pH 5.7）（见材料表）。将培养基高压灭菌。在超净工作台中准备好无菌操作环境，并对实验所需的方形培养皿进行标记。将培养基倒入培养皿中，静置使其凝固。
- 使用无菌枪头将灭菌后的种子接种到含培养基的方形培养皿中。将种子均匀分布为两行。待种子干燥后，盖上皿盖并密封培养皿。将培养皿置于 4 °C 黑暗条件下春化处理 4 天。
注意：春化处理有助于同步种子萌发。 - 将培养皿垂直放置于生长室中，在长日照条件下（光照 16 小时/黑暗 8 小时），光照强度为 25 μmol m2 s−1，温度为 23 °C（昼夜恒温），培养幼苗 7 天。
2. 渗透压胁迫处理（可选）
注意：本节提供了关于在冰点渗透压计测定为 -1.2 MPa 渗透势下拟南芥根生长的详细信息（材料表）。根据具体实验问题，此部分内容可省略或修改。
- 配制基本MS培养基，加入1.5%蔗糖、400 mM甘露醇和1%琼脂（pH 5.7）。将培养基高压灭菌后，在超净工作台中倒入方形培养皿中，静置使其凝固。
- 用镊子（材料表）将在基本MS + 1.5%蔗糖培养基中预培养5天的幼苗转移至含有添加400 mM甘露醇的培养基的方形培养皿中。将培养皿垂直放置于生长室中，培养条件与步骤1.2.3相同。在该渗透胁迫条件下培养幼苗7天。
注意：为评估严重渗透胁迫下主根根系生长的适应性，建议使用在受控条件下萌发后培养5天的幼苗，以确保根尖分生组织大小已基本建立13。此外，也可在发育的各个阶段进行分析，以确定渗透胁迫对发育过程的影响。
3. 原子力显微镜（AFM）纳米压痕实验
- 纳米压痕实验样品的制备
注意：此步骤对于将原子力显微镜（AFM）应用于活体生物样品的研究至关重要。样品必须牢固地附着在基底上，以确保在压痕测量过程中具有足够的机械稳定性。同时，应保持样品的结构特性。稳定大尺寸样品用于AFM的一种有效策略是使用粘合剂。粘合剂必须快速干燥，且对周围介质无毒或不发生反应。在本方案中，使用聚苯乙烯培养皿作为基底，并使用非酸性硅胶（材料表）将拟南芥幼苗固定。- 用盖玻片在培养皿内均匀涂抹一层薄薄的硅胶。将胶水暴露在空气中45秒。
- 使用镊子将幼苗放置在胶水上，调整方向以避免幼苗突出部分与悬臂探针接触。然后轻轻按压根部，使其牢固地贴附于硅胶层上。在进行后续步骤前，让幼苗与胶水接触45秒。
- 将固定好的幼苗在避光条件下用2 μg/mL碘化丙啶（PI；材料表）孵育5分钟，并用1×磷酸盐缓冲液（PBS）溶液（材料表）小心清洗三次。
- 将经PI孵育的幼苗置于倒置荧光显微镜联用的AFM系统中。观察荧光时，激发波长设为572 nm，发射波长设为617 nm。表皮细胞内部无荧光信号表明根部具有活性。
- 用1×磷酸盐缓冲液（PBS）溶液覆盖幼苗。
- 压痕实验方案
注意：所有AFM测量应在样品固定后1小时内于室温下完成。AFM所在房间应通过空调维持在25 °C，PBS溶液也应保持相同温度。- 将带有锥形尖端的标准氮化硅悬臂探针（见材料表）安装至AFM探针夹持器（液体用，材料表）中。
- 调整激光束，使其照射在悬臂靠近尖端的位置。随后移动光电二极管，使激光光斑位于探测器中心。
- 为校准偏转灵敏度，将盛有1×PBS的聚苯乙烯培养皿置于AFM下方。
注意：此步骤用于计算压痕深度。当在硬质表面上进行力测量时，表面不会发生形变，因此z轴扫描器位移的任何变化均对应于悬臂的偏转。因此，在硬质表面上校准偏转灵敏度极为重要。若使用软质表面，会导致偏转灵敏度被高估，从而造成弹簧常数偏低。 - 调节光电探测器，使非接触状态下的偏转接近0 V。通过执行一次压痕（力-距离曲线），设置行程大小为3 μm、压入-回撤速率为0.6 μm/s、触发阈值为0.5 V，来校准偏转灵敏度。
- 为校准悬臂的弹簧常数，使用AFM软件推荐的Thermal Tune功能（材料表），适用于弹簧常数小于约5 N/m的探针；或采用参考文献14中描述的方法。在软件中启动Thermal Tune之前，确保探针未与样品发生相互作用。
- 输入悬臂温度。点击Calibrate > Thermal Tune，或点击NanoScope工具栏中的Thermal Tune图标。选择频率范围（1–100 Hz）。
- 在Thermal Tune面板中点击Acquire Data。等待AFM采集数据后，点击Simple Harmonic Oscillator (Fluid)按钮。
- 将Median Filter Width设为3。调整PSD Bin Width以通过对数据取平均来降低噪声。围绕第一共振峰设置拟合边界。
- 点击Calculate Spring Constant k，然后在弹出窗口询问是否使用该值时点击Yes。
- 重复上述步骤三次，并手动计算弹簧常数的平均值。将该平均值填入PicoForce界面中Ramp参数列表的Spring Constant输入框中。至此完成校准。
- 利用倒置光学显微镜，分别在10×、20×和40×目镜放大倍数下，将AFM探针定位至主根第四个伸长区表皮细胞的表面，并确保探针位于细胞中央。
- 根据已计算的弹簧常数值（步骤3.2.5.5），在选定位置获取力-距离曲线，设置行程大小为3 µm、触发阈值为11 nN、压入-回撤速率为0.6 μm/s。
注意：先前研究15,16表明，较低频率的压入-回撤有助于最小化滞后效应和拖曳力。 - 每种处理条件下，从每条根的三个细胞中获取力-距离曲线（每种处理使用三个生物学重复）。每条根至少采集150条力-距离曲线。
4. 测量表观杨氏模量
- 将每个力曲线拟合至以下适用于锥形压头的模型17:
，其中 E 是样品的表观杨氏模量， 
是样品的泊松模量，以及 α 为顶点的半角。舍弃相关系数（r2) < 0.99。考虑完全不可压缩材料的泊松比： = 0.5 以及制造商提供的压头几何参数。
注意：为尽可能提高对细胞壁力学特性的敏感性，并减少膨压对表观杨氏模量值的影响，应使用力-位移曲线中接触点后前100 nm的范围进行拟合8使用一个定制的 MATLAB 程序（可通过向 J. C. B 发送个人请求获取）进行拟合，该程序允许从加载曲线的接触点设置特定的压痕深度。 - 使用表观杨氏模量数据绘制归一化直方图，并用高斯分布进行拟合。剔除95%置信区间以外的数据点，重新计算直方图和高斯拟合。计算并报告表观杨氏模量的均值和标准差。
- 通过ANOVA等多重比较检验确定组间比较的显著性。
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结果
力-压痕实验
以下文本展示了进行力-压痕实验时可能获得的一些结果，以说明在实验方案执行得当的情况下可预期的典型输出。
力-位移曲线
在根伸长区细胞中心位置对活体样品进行压痕实验所获得的代表性力-压痕图如图2所示。当原子力显微镜（AFM）探针开始压入细胞壁表面时，由于细胞壁抵抗形变，作用力开始上升（如图2A中标记1所示）。随着加载过程的进行，作用力持续增加，直至达到最大作用力值（如图2A中标记2所示）；此后，压痕过程进入卸载阶段。
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讨论
细胞和细胞壁力学在揭示力学如何影响生长过程方面正变得越来越重要。由于物理力在固体组织中可传播较远距离，因此研究细胞壁物理性质的变化及其感知、调控、调节方式，以及这些变化对植物生长的影响，已成为一个重要的研究领域2,3,8。
本文介绍了一种研究拟南芥根伸长区细胞细胞壁物理特性的方法。原子力显微镜（AFM）技术可方便地与其他技术（如生长速率研究）相结合，以理解细胞壁物理特性在根生长中的作用。
其中最关键的实验步骤之一是样品的机械固定：必须将样品牢固地附着，以避免在压痕过程中发生移动。硅胶的涂层必须足够薄，以确保其能够快速干燥。操作硅胶和样品时应小心谨慎，确保硅胶不会覆盖到待测样品的区域。此外，制备过程应迅速完成（在一分钟内），以保持硅胶的粘附性能，并防止根部脱水。必须避免组织损伤；表皮组织的脱水和损伤会导致细胞壁力学性质发生不可逆的变化。其他方法...
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披露
作者无利益冲突。用于拟合数据的 MATLAB 脚本可根据个人请求，通过向 J. C. B. 发送邮件获取。
致谢
本研究由CSIC I+D 2018（资助号：95，Mariana Sotelo Silveira）；CSIC研究组（Omar Borsani）和PEDECIBA资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 × 磷酸盐缓冲液（PBS） | 包含氯化钠和磷酸盐缓冲体系，用于防止渗透压休克并维持活细胞内的水平衡。 | ||
| AFM 软件 | Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| 原子力显微镜（AFM） | BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA | ||
| Catalyst 探针支架-液体型 | Bruker, Billerica, MA, USA | CAT-FCH | 适用于 Bioscope Catalyst 的探针支架，专为液体环境中接触模式或轻敲模式操作设计。 也可兼容空气环境下的操作。 |
| 冰点渗透压计；型号 OSMOMAT 030 | Gonotech, Berlin, Germany | ||
| Murashige & Skoog 培养基 | Duchess Biochemie | M0221 | 原始浓度（1962年） |
| 与原子力显微镜联用的倒置光学显微镜 | Olympus IX81, Miami, FL, USA | ||
| PEGAMIL | ANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, Argentina | 100429 | 中性、非酸性硅胶 |
| 培养皿 | Deltalab | 200201.B | 聚苯乙烯材质，55 × 14 mm，经辐射灭菌。 |
| 碘化丙啶 | Sigma | P4170 | 用于根系活力检测。 |
| 氮化硅探针，DNP-10，悬臂 A | Bruker, Billerica, MA, USA | DNP-10/A | 用于液体环境中力调制显微成像。探针尖端半径为 20–60 nm，175-μm 长的三角形悬臂， 弹性系数为 0.35 N/m。 |
| 镊子 | Sigma | T4537 |
参考文献
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