利用原子力显微镜研究活体表皮细胞的物理特性 拟南芥 根

摘要

原子力显微镜压痕实验方案能够解析在正常或受限生长条件下（例如，在水分亏缺情况下），组织或器官中特定细胞的细胞壁物理特性所起的作用。

摘要

本文介绍了一种利用原子力显微镜（AFM）结合倒置荧光光学显微镜，通过纳米压痕技术对活体拟南芥根表皮细胞细胞壁物理特性进行表征的方法。该方法通过对样品施加可控的力并同时测量其形变，可量化细胞壁在亚细胞分辨率下的表观杨氏模量等参数。实验需对样品进行精确的机械固定，并合理选择压头及压痕深度。尽管该方法仅适用于外部组织，但可用于表征植物细胞壁在发育过程中的力学变化，并实现这些微观力学变化与整个器官生长之间的关联分析。

引言

植物细胞被细胞壁包围，细胞壁是一种复杂的结构，由相互交织的多糖、蛋白质、代谢物和水构成的网络组成，其厚度从0.1到数个不等 µm 取决于细胞类型和生长阶段^1,2细胞壁的力学特性在植物生长过程中起着至关重要的作用。已有研究提出，细胞壁刚度值较低是细胞生长和细胞壁扩张的前提条件，且越来越多的证据表明，所有细胞均能感知机械力以执行其功能。然而，细胞壁物理性质的改变是否决定细胞命运，目前仍存在争议。^2,3,4由于植物细胞在发育过程中不会移动，器官的最终形态取决于细胞扩展的方向和程度。因此，拟南芥根是研究细胞壁物理特性对细胞扩展影响的理想模型，因为根的不同区域会发生不同类型的扩展。例如，各向异性扩展在伸长区尤为明显，特别是在表皮细胞中⁵.

本文所述方法利用原子力显微镜（AFM）结合倒置荧光相差显微镜，在纳米尺度上对活体拟南芥根部表皮细胞的细胞壁物理特性进行了表征⁶。有关原子力显微镜技术的全面综述，请参阅文献^7,<....

方案

1. 植物材料的准备与培养条件

1. 为获得所需的植物材料，对拟南芥野生型及目标突变体品系的种子进行灭菌。
   注意：本实验中使用了以下材料：ttl1：T-DNA插入系Salk_063943（对应基因TTL1；AT1G53300）—哥伦比亚-0（Col-0）野生型；Procuste1 (prc1-1) 突变体，该突变体在CESA6基因（AT5G64740）中具有敲除突变（Q720终止），如先前文献^10,11所述；以及ttl1 x prc1-1双突变体。
   1. 取约50 μL种子置于微量离心管中。加入500 μL室温的70%乙醇 + 0.01% Tween溶液，混匀后孵育7分钟。
   2. 倒去乙醇溶液，加入500 μL 20%次氯酸钠溶液，混匀后孵育7分钟。
   3. 倒去次氯酸钠溶液，用无菌水清洗种子三至四次。
2. 接种
   1. 提前配制基本Murashige和Skoog（MS）培养基¹² + 1.5%蔗糖 + 1%琼脂（pH 5.7）（见材料表）。将培养基高压灭菌....

结果

力-压痕实验
以下内容介绍了一项力-压痕实验执行后可能获得的一些结果，以展示当本方案被正确实施时可预期的典型输出数据。

力-位移曲线
在根伸长区细胞中心位置对活体样品进行压痕实验所获得的代表性力-压痕曲线如图2所示。当原子力显微镜（AFM）探针开始压入细胞壁表面时，由于细胞壁对形变具有抵抗作用，测得的力开始上升（如图2A中标记1所示）。随着载荷增加，力持续上升，直至达到最大力值（如图2A中标记2所示）；此后，压痕过程进入卸载阶段。

讨论

细胞和细胞壁力学在揭示力学如何影响生长过程方面正变得越来越重要。由于物理力在固体组织中可传播较远距离，因此研究细胞壁物理性质的变化及其感知、调控、调节方式，以及这些变化对植物生长的影响，已成为一个重要的研究领域^2,3,8。

本文介绍了一种研究拟南芥根伸长区细胞细胞壁物理特性的方法。原子力显微镜（AFM）技术可方便地与其他技术（如生长速率研究）相结合，以理解细胞壁物理特性在根生长中的作用。

其中最关键的实验步骤之一是样品的机械固定：必须将样品牢固地附着，以避免在压痕过程中发生移动。硅胶的涂层必须足够薄，以确保其能够快速干燥。操作硅胶和样品时应小心谨慎，确保硅胶不会覆盖到待测样品的区域。此外，制备过程应迅速完成（在一分钟内），以保持硅胶的粘附性能，并防止根部脱水。必须避免组织损伤；表皮组织的脱水和损伤会导致细胞壁力学性质发生不可逆的变化。其他方法.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 × 磷酸盐缓冲液（PBS）			包含氯化钠和磷酸盐缓冲体系，用于防止渗透压休克并维持活细胞内的水平衡。
AFM 软件	Bruker, Billerica, MA, USA
原子力显微镜（AFM）	BioScope Catalyst, Bruker, Billerica, MA, USA
Catalyst 探针支架-液体型	Bruker, Billerica, MA, USA	CAT-FCH	适用于 Bioscope Catalyst 的探针支架，专为液体环境中接触模式或轻敲模式操作设计。  也可兼容空气环境下的操作。
冰点渗透压计；型号 OSMOMAT 030	Gonotech, Berlin, Germany
Murashige & Skoog 培养基	Duchess Biochemie	M0221	原始浓度（1962年）
与原子力显微镜联用的倒置光学显微镜	Olympus IX81, Miami, FL, USA
PEGAMIL	ANAEROBICOS S.R.L., Buenos Aires, Argentina	100429	中性、非酸性硅胶
培养皿	Deltalab	200201.B	聚苯乙烯材质，55 × 14 mm，经辐射灭菌。
碘化丙啶	Sigma	P4170	用于根系活力检测。
氮化硅探针，DNP-10，悬臂 A	Bruker, Billerica, MA, USA	DNP-10/A	用于液体环境中力调制显微成像。探针尖端半径为 20–60 nm，175-μm 长的三角形悬臂，  弹性系数为 0.35 N/m。
镊子	Sigma	T4537