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方法文章

使用超低输入量靶向切割与核酸酶释放技术进行染色质上单细胞因子定位

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DOI：

10.3791/63536

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2022年2月1日

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Pittsburgh

本文内容

摘要

CUT&RUN 及其变体可用于确定蛋白质在染色质上的占据情况。本实验方案描述了如何利用单细胞 uliCUT&RUN 技术来确定蛋白质在染色质上的定位。

摘要

确定蛋白质在染色质上的结合位点对于理解其功能及潜在的调控靶标至关重要。染色质免疫沉淀（ChIP）作为确定蛋白质定位的金标准已有30多年历史，其原理是利用特异性抗体从超声处理或酶切消化的染色质中富集目标蛋白质。近年来，由于灵敏度更高，抗体锚定技术在染色质蛋白定位研究中日益受到青睐。靶点下方切割与核酸酶释放技术（Cleavage Under Targets & Release Under Nuclease，CUT&RUN）是染色质免疫切割（ChIC）的全基因组扩展方法，该技术利用与微球菌核酸酶融合的重组蛋白A（pA-MNase），识别靶向目标蛋白的抗体的IgG恒定区，从而实现对目标蛋白周围DNA的特异性切割。CUT&RUN可用于分析组蛋白修饰、转录因子以及其他染色质结合蛋白（如核小体重塑因子）的定位。重要的是，CUT&RUN能够用于检测常染色质或异染色质相关蛋白及组蛋白修饰的定位。因此，CUT&RUN是一种强大的方法，可用于广泛蛋白质结合图谱的测定。近期，CUT&RUN已针对低细胞数量乃至单细胞中的转录因子分析进行了优化，优化后的方案被称为超低起始量CUT&RUN（uliCUT&RUN）。本文提供了一种在手动96孔板体系中利用uliCUT&RUN进行单细胞因子图谱分析的详细实验方案。

引言

许多核蛋白通过与染色质相互作用来促进或抑制以DNA为模板的生物学活动。为了确定这些染色质结合蛋白的功能，明确它们在基因组上的结合位点至关重要。自1985年发展以来，染色质免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP）一直是鉴定蛋白在染色质上结合位置的金标准1,2。传统的ChIP技术基本流程如下：收集细胞并进行交联（通常使用甲醛），通过剪切使染色质片段化（通常采用强烈的超声处理，因此需要交联），利用靶向目标蛋白（或带标签蛋白）的特异性抗体进行免疫沉淀，并结合偶联有琼脂糖或磁珠的二抗，随后逆转交联，消化蛋白质和RNA以纯化DNA，最终将富集的ChIP-DNA作为分析模板（通过放射性标记探针1,2、qPCR3、微阵列5,6或测序4进行检测）。随着微阵列技术和大规模并行深度测序的发展，ChIP-chip5,6和ChIP-seq4相继被开发出来，实现了全基因组范围内蛋白在染色质上定位的高通量鉴定。交联ChIP自问世以来一直是一种强大且可靠的技术，其分辨率在ChIP-exo7和ChIP-nexus8技术的推动下得到了显著提升。与此同时，与ChIP-seq并行发展的还有非交联（即天然状态）的ChIP实验方案（N-ChIP），该方法采用核酸酶消化（通常使用 微球菌核酸酶，MNase）对染色质进行片段化，而非传统交联ChIP中所使用的超声处理9。然而，无论是交联ChIP还是N-ChIP技术，一个主要的局限性在于实验操作后DNA得率较低，因而需要大量的起始细胞。因此，在近年来的研究中，许多工作致力于优化适用于低细胞投入量的ChIP技术。这些努力催生了多种功能强大、适用范围和起始量需求各异的基于ChIP的技术10,11,12,13,14,15,16,17,18。然而，针对单细胞的ChIP-seq相关技术仍较为缺乏，尤其是针对非组蛋白蛋白的单细胞检测方法。

2004年，一种用于测定染色质上蛋白质占据情况的替代技术被开发出来，称为染色质内源性切割（Chromatin Endogenous Cleavage, ChEC）和染色质免疫切割（Chromatin Immunocleavage, ChIC）19。这些单一位点技术利用MNase与目标蛋白质（ChEC）或蛋白A（ChIC）的融合蛋白，直接切割目标蛋白质附近的DNA。近年来，ChEC和ChIC均已优化，可用于全基因组范围内的染色质蛋白质分析（分别为ChEC-seq和CUT&RUN）20,21。尽管ChEC-seq是一种确定因子定位的有力技术，但它需要为每个靶标构建MNase融合蛋白；而ChIC及其全基因组版本CUT&RUN则依赖于针对目标蛋白的抗体（与ChIP类似）以及重组蛋白A-MNase，其中蛋白A可识别抗体的IgG恒定区。作为一种改进，已开发出蛋白A/蛋白G-MNase融合蛋白（pA/G-MNase），能够识别更广泛的抗体恒定区22。CUT&RUN已迅速成为全基因组范围内测定染色质上蛋白质定位的ChIP-seq的一种流行替代方法。

超低输入量的CUT&RUN（uliCUT&RUN）是CUT&RUN的一种变体，可在极低细胞量甚至单细胞水平上进行实验，该方法于2019年被报道23。本文描述了手动操作的96孔板格式单细胞应用方案。需要注意的是，自uliCUT&RUN发展以来，已有两种用于组蛋白分析的替代方法——CUT&Tag和iACT-seq被开发出来，可实现对组蛋白蛋白的稳健且高度并行的分析24,25。此外，单细胞CUT&Tag（scCUT&Tag）已被优化用于在单个细胞中同时分析多个因子（multiCUT&Tag），并可应用于非组蛋白蛋白的检测26。综上所述，CUT&RUN为低输入量的ChIP-seq提供了一种极具吸引力的替代方案，其中uliCUT&RUN可在任何配备细胞分选仪和常规设备的分子生物学实验室中开展。

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方案

伦理声明：所有研究均经匹兹堡大学研究保护机构生物安全办公室批准。

1. 准备磁珠

注意：在细胞分选前进行操作，并在使用前置于冰上保存。

  1. 向新的1.5 mL离心管中每反应加入30 µL ConA偶联的顺磁性微球悬浮液，再加入850 µL结合缓冲液，轻轻吹打混匀。
    注意：ConA偶联的顺磁性微球是经凝集素包被的磁珠，可实现脂质膜结合。
  2. 将试管置于磁力架上，静置1-2分钟使磁珠充分磁化。待上清液澄清后，移除上清 弃去上清液，注意不要扰动珠子。
  3. 从磁力架上取下离心管，加入1 mL结合缓冲液重悬磁珠以洗涤。
  4. 重复步骤 1.2 和 1.3。
  5. 将磁珠磁力吸附2分钟，移除上清液并弃去。
  6. 从磁力架上取下离心管，每反应加入30 µL结合缓冲液重悬磁珠。
  7. 将洗涤后的磁珠混合物置于冰上，直至细胞分选完成。

2. 收集细胞

注意：此步骤针对贴壁细胞编写，并针对小鼠 E14 胚胎干细胞进行了优化。细胞的培养和收集取决于细胞类型。

  1. 将细胞从 37 °C 培养箱中取出，在显微镜下观察以确保细胞质量。
  2. 吸去细胞培养板中的培养基，并用 5 mL 的 1× PBS 清洗。
  3. 吸去培养板中的 PBS，收集细胞（采用因细胞类型而异的传统细胞收获方法）。如有必要，使用移液管轻轻吹打培养皿表面，获得单细胞悬液。
  4. 将细胞悬液转移至 15 mL 圆锥形离心管中，在 200 × g 条件下离心 5 分钟。
  5. 吸去上清液并弃去，用 5 mL PBS + 1% FBS 重悬细胞沉淀进行洗涤。
  6. 在 200 × g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 5 mL PBS + 1% FBS 中。
  7. 计数细胞，并将 1 mL 含 1 × 106 个细胞的悬液转移至新的 1.5 mL 微量离心管中。
  8. 加入 5 µL 7-氨基放线菌素 D（7-AAD），轻轻颠倒混匀，然后将样品加入细胞分选仪，将活单细胞分选至 96 孔板的各个孔中。
    注意：7-AAD 染料不能进入活细胞，因此可用于活细胞分选。

3. 细胞分选与裂解

  1. 在细胞分选前，准备适用于细胞分选的96孔板，每孔加入100 µL核提取（NE）缓冲液。
  2. 按照制造商的说明，将细胞分选至96孔板中。
  3. 短暂离心板（600 × g，30 s），确保细胞进入各孔中的缓冲液内。
    注意：建议在预实验中验证所用细胞是否能可靠地沉降至孔底。
  4. 将样品置于冰上孵育15分钟。
  5. 在4 °C下以600 × g离心5分钟，然后小心吸除上清液（每孔残留5 µL）。
  6. 用55 µL NE缓冲液重悬每个样品，并向每孔反应体系中加入30 µL预洗涤的刀豆球蛋白A（ConA）偶联顺磁性微珠（来自步骤1.7，溶于结合缓冲液中）。
  7. 室温孵育10分钟。

4. 预封闭样品以防止 MNase 过早消化

  1. 将平板置于96孔磁力架上，静置至少5分钟使磁珠充分结合，然后移除并弃去上清液。
  2. 向结合有细胞核的磁珠中加入100 µL封闭缓冲液，轻轻吹打混匀。
  3. 室温孵育5分钟。

5. 一抗的添加

  1. 将平板置于96孔磁力架上，静置至少5分钟使上清澄清，然后小心移除并弃去上清液，切勿扰动磁珠。
  2. 从磁力架上取下平板，每反应加入100 µL洗涤缓冲液，通过轻柔吹打重悬磁珠。
  3. 将平板重新放回96孔磁力架上，静置使上清澄清后，小心移除并弃去上清液。
  4. 每反应加入25 µL洗涤缓冲液，通过轻柔吹打重悬磁珠。
  5. 配制一抗预混液：每反应含25 µL洗涤缓冲液加0.5 µL抗体。
  6. 在轻柔涡旋振荡固定有细胞核的磁珠的同时，向每份需加入抗体的样本中加入25 µL一抗预混液（通常终稀释比例为1:100）；若为对照组，则加入不含抗体的25 µL洗涤缓冲液。
  7. 室温孵育1小时。
  8. 将样本置于96孔磁力架上，静置至少5分钟使上清澄清，然后小心移除并弃去上清液，切勿扰动磁珠。
  9. 从磁力架上取下平板，每孔加入100 µL洗涤缓冲液洗涤磁珠，并通过吹打重悬磁珠。

6. 添加 pA-MNase 或 pA/G-MNase

注意：蛋白A对某些物种（如兔）的IgG分子具有高亲和力，但不适用于其他物种（如小鼠或大鼠）的IgG。 alternatively，可使用蛋白A/G-MN酶。这种杂合蛋白可结合兔、小鼠和大鼠的IgG，因而在使用小鼠或大鼠来源的一抗时，无需使用二抗。

  1. 将培养板放回96孔磁力架上，静置至少5分钟使上清澄清，然后小心移除并弃去上清，勿扰动磁珠。
  2. 从磁力架上取下培养板，将每份样本重悬于25 µL洗涤缓冲液中。
  3. 配制 pA-MNase 主混合液（每反应加入 25 µL 洗涤缓冲液 + 优化量的 pA-MNase）。
  4. 在轻轻涡旋的同时，向每个样本（包括对照样本）中加入25 µL pA-MNase主混合液。
    注意：pA-MNase 的浓度因制备方法不同而有所差异，若为自行制备，应予以注意。 每次独立纯化前均需进行测试。对于pA/G-MNase，应使用2.5 µL的20倍浓缩储存液。
  5. 将样品在室温下孵育30分钟。
  6. 将培养板置于96孔磁力架上，静置至少5分钟使上清澄清，然后小心移除并弃去上清，勿扰动磁珠。
  7. 从磁力架上取下孔板，加入100 µL洗涤缓冲液洗涤磁珠，通过轻柔吹打重悬磁珠。

7. 定向DNA消化

  1. 将平板置于96孔磁力架上，静置至少5分钟使上清澄清，然后移除并弃去上清液。
  2. 从磁力架上取下样品，用移液器轻轻吹打，将磁珠重悬于50 µL洗涤缓冲液中。
  3. 将样品置于冰水混合物中，在0 °C条件下平衡5分钟。
  4. 从0 °C的冰水浴中取出样品，使用多通道移液器加入1 µL 100 mM CaCl2。用较大体积的多通道移液器轻柔吹打3–5次充分混匀，然后将样品放回0 °C环境中。
    注意：此步骤充分混匀至关重要。加入CaCl2是为了激活MNase对目标蛋白周围DNA的消化作用。
  5. 当平板重新放回冰水浴后，立即启动10分钟计时。
  6. 按照之前加入CaCl2的相同顺序，向每孔中加入50 µL 2XRSTOP+缓冲液以终止反应。
    注意：应在10分钟消化结束前预先配制好2XRSTOP+缓冲液，以防止过度消化。

8. 样品分馏

  1. 将样品在 37 °C 下孵育 20 分钟。
  2. 在 4 °C 下以 16,000 × g 离心 5 分钟。
  3. 将板置于 96 孔磁力架上，静置至少 5 分钟使上清液澄清，然后将上清液转移至新的 96 孔板中。弃去磁珠。

9. DNA 提取

  1. 向每个样品中加入 1 µL 的 10% 十二烷基硫酸钠（SDS）和 0.83 µL 的 20 mg/mL 蛋白酶 K。
    警告：SDS 粉末吸入有害。操作时应在通风良好的环境中进行，并佩戴护目镜、手套和 N95 级别呼吸器，小心操作。
  2. 通过轻柔吹打混匀样品。
  3. 将样品在 70 °C 下孵育 10 分钟。
  4. 将反应板恢复至室温，加入 46.6 µL 的 5 M NaCl 和 90 µL 的 50% 聚乙二醇 4000（PEG 4000），并通过轻柔吹打混匀。
  5. 向每个样品中加入 33 µL 聚苯乙烯-磁铁矿珠，室温孵育 10 分钟。
    注意：使用前请确保聚苯乙烯-磁铁矿珠已恢复至室温（约 30 分钟），并充分混匀。
  6. 将反应板置于磁力架上，静置约 5 分钟使上清澄清，然后小心弃去上清液，避免扰动磁珠。
  7. 用 150 µL 的 80% 乙醇洗涤 2 次，避免扰动磁珠。
    警告：乙醇高度易燃，可引起皮肤、眼睛和肺部刺激。操作时应穿戴适当的实验服，并在通风橱内进行。
  8. 短暂离心（1000 × g，30 秒）。将反应板重新置于 96 孔磁力架上，彻底去除残留的乙醇，避免扰动磁珠。
  9. 将样品在空气中干燥约 2–5 分钟。
    注意：干燥时间不得超过 5 分钟。若能彻底去除乙醇，干燥 2–3 分钟已足够。
  10. 用 37.5 µL 的 10 mM Tris-HCl（pH 8）重悬磁珠，并在室温下孵育 5 分钟。
  11. 将反应板置于磁力架上 ，静置 5 分钟使磁珠充分结合。
  12. 将 36.5 µL 上清液转移至新的适用于 PCR 仪的 96 孔板中，弃去磁珠。
    注意：此时可将样品在 -20 °C 保存以暂停实验，或继续进行文库构建（步骤 10–15）。

10. 末端修复、磷酸化、腺苷化

注意：试剂来源参见材料表。以下实验步骤参照了商品化试剂盒的方法，例如 NEBNext Ultra DNA II 试剂盒。

  1. 将5 U/µL的T4 DNA聚合酶用1x T4 DNA连接酶缓冲液按1:20稀释。
  2. 配制末端修复/3'A主混合液：每反应体系中加入2 µL 10x T4 DNA连接酶缓冲液、2.5 µL 10 mM dNTPs、1.25 µL 10 mM ATP、3.13 µL 40% PEG 4000、0.63 µL 10 U/µL T4多核苷酸激酶（T4 PNK）、0.5 µL稀释后的T4 DNA聚合酶、0.5 µL 5 U/µL Taq DNA聚合酶，总体积为13.5 µL。
    注意：使用前请务必将40% PEG 4000升至室温。
  3. 将13.5 µL末端修复/3'A主混合液加入36.5 µL DNA中。
  4. 短暂涡旋混匀反应体系，然后短暂离心（500 x g，10秒）。
  5. 在预冷的带有加热盖的PCR仪中孵育，对于温度>20 °C的步骤请使用加热盖。反应条件如下：12 °C孵育15分钟，37 °C孵育15分钟，72 °C孵育20分钟，最后置于4 °C保存。

11. 接头连接

注意：在配制以下反应体系时，需将样品置于冰上。连接酶缓冲液在移液前应恢复至室温。将接头（见材料表）用含有10 mM NaCl的10 mM Tris-HCl溶液（pH 7.5）进行稀释。由于CUT&RUN富集的DNA产量较低，不要预先定量。应制备接头的25倍稀释液，最终工作浓度为0.6 µM。

  1. 配制连接反应预混液：每反应体系为 55 µL 连接酶缓冲液（2×）、5 µL T4 DNA 连接酶和 5 µL 稀释后的接头，总体积为 65 µL。
  2. 将 65 µL 连接预混液加入到 50 µL 来自步骤 10.5 的 DNA 中。
  3. 短暂涡旋混匀，随后短暂离心（500 × g，10 秒）。
  4. 在无加热盖的热循环仪中于 20 °C 孵育 15 分钟。
    注意：请立即进行下一步操作。

12. USER 酶消化

  1. 向每个样品中加入 3 µL USER 酶，涡旋混匀，离心（500 × g，10 秒）。
  2. 在 PCR 仪中 37 °C 孵育 15 分钟（加热盖温度设为 50 °C）。

13. 连接反应后的聚苯乙烯-磁铁矿珠纯化

注意：将聚苯乙烯-磁铁矿珠在室温下平衡（约 30 分钟）。使用前涡旋振荡以混匀珠溶液。以下步骤均在室温下进行。

  1. 向每个含有接头连接DNA的孔中加入39 µL（0.33倍体积）的聚苯乙烯-磁铁矿珠溶液。
  2. 用移液器充分混匀，然后在室温下孵育15分钟，使DNA结合到磁珠上。
  3. 将样品置于96孔磁力架上，孵育5分钟，直至上清液变澄清。
  4. 保持反应板在磁力架上，小心移除并弃去上清液，避免扰动磁珠。
  5. 用200 µL的80%乙醇冲洗磁珠，避免扰动磁珠。
  6. 在96孔磁力架上孵育30秒，使溶液澄清。
  7. 移除并弃去上清液，避免扰动磁珠。
  8. 重复步骤13.5–13.7，共进行两次洗涤。
  9. 将反应板短暂离心（500 × g，10秒），然后放回96孔磁力架，小心去除残留乙醇，避免扰动磁珠。
  10. 保持反应板在磁力架上，将样品在空气中干燥2分钟。
    注意：切勿过度干燥磁珠。
  11. 从磁力架上取下反应板，将磁珠重悬于28.5 µL的10 mM Tris-HCl（pH 8）中。
    警告：盐酸具有强腐蚀性。操作时应在通风橱内佩戴护目镜、手套和实验服，小心处理。
  12. 通过移液充分重悬磁珠，注意避免产生气泡。
  13. 在室温下孵育5分钟。
  14. 将反应板置于96孔磁力架上，静置5分钟使溶液澄清。
  15. 将27.5 µL上清液转移至新的PCR板中，弃去磁珠。

14. 文库扩增

注意：引物需使用与接头相同的溶液进行稀释。在本测序文库构建中，引物的工作浓度应为 0.6 µM。

  1. 加入5 µL稀释后的带索引引物（参见 材料表) 加入每个样品中。
    注意：每个样本在后续识别时都需要使用不同的索引 测序
  2. 配制PCR主混合液：每份样品的主混合液总体积为17.5 µL，包含10 µL 5x高保真PCR缓冲液、1.5 µL 10 mM dNTPs、5 µL稀释的通用引物和1 µL 1 U热启动高保真聚合酶。
  3. 向32.5 µL纯化的接头连接DNA（其中包含5 µL带索引的引物）中加入17.5 µL的PCR混合液。
  4. 用移液器吹打混合溶液。
  5. 在热循环仪中孵育，反应条件如下，升降温速率最大为 3 °C/s：98 °C 预变性 45 s，98 °C 变性 45 s，60 °C 退火 10 s，重复第二步和第三步 21 次，72 °C 延伸 1 min，4 °C 保存。
    注意：样品可于4 °C短期保存，或于-20 °C长期保存。

15. 聚苯乙烯-磁铁矿微珠纯化

  1. 向每个样品中加入 60 µL（1.2 倍体积）的聚苯乙烯-磁铁矿珠。
  2. 通过移液重悬珠子，并在室温下孵育 15 分钟。
  3. 将板置于磁力架上 5 分钟，直至溶液变澄清。
  4. 弃去上清液，用 200 µL 80% EtOH 冲洗珠子，注意不要扰动珠子。
  5. 重复洗涤步骤，共进行两次 80% EtOH 洗涤。
  6. 以 500 × g 离心 10 秒，将板置于 96 孔磁力架上，让珠子结合 5 分钟。
  7. 用移液器去除多余的 EtOH，不要扰动珠子，并让珠子在空气中干燥 2 分钟。
    注意：切勿过度干燥珠子。
  8. 将珠子重悬于 21 µL 无核酸酶水之中，并在室温下孵育 5 分钟。
  9. 将板置于磁力架上，静置 5 分钟使溶液澄清。
  10. 将 20 µL 上清液转移至新板中。
    注意：可通过将样品在 -20 °C 下保存，暂停实验。
  11. 使用 1× HS 试剂，通过荧光计（参见材料表）测定文库浓度。
  12. 若浓度允许，取 30 ng 样品在 1.5% 琼脂糖凝胶上电泳，使用低分子量 DNA 标记物进行可视化检测；或使用 Fragment Analyzer 或类似仪器进行检测。
  13. 在 Illumina 平台上对文库进行测序，以获得约 50,000–100,000 条唯一比对的读长。

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结果

本文介绍了一种采用96孔手动格式uliCUT&RUN技术对染色质上单个细胞进行蛋白质分析的详细实验方案。尽管实验结果会因被检测蛋白的种类（受蛋白丰度和抗体质量影响）、细胞类型及其他因素而有所差异，但本文仍对本技术预期获得的结果进行了讨论。在将活细胞分选至NE缓冲液之前或同时，应评估细胞质量（包括细胞形态和活细胞百分比）以及单细胞分选效果。图2A、B展示了胚胎干细胞（ES细胞）集落及细胞分选的示例。具体而言，不应使用低质量的细胞；若细胞质量存在问题，应严格遵循特定细胞类型的培养与处理指南。此外，应在实验前确认细胞分选仪器的分选准确性。例如，可先对测试细胞进行分选，使用Hoechst 33342染料染色后计数，以确保每个孔中仅含有0个或1个细胞。若未实现单细胞分选，则必须优化分选条件。文库构建完成后，在测序前可通过琼脂糖凝胶电泳（若样品浓度允许上样30 ng或更高，因琼脂糖凝胶对DNA的检测存在下限）或片段分析仪（Fragment Analyzer，或类似设备如Tapestation或Bioanalyzer）对样品进行评估，示例结果见

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讨论

CUT&RUN 是一种用于确定蛋白质在染色质上定位的有效实验方案。与其他方法相比，该技术具有多项优势：1）信噪比高；2）实验流程快速；3）所需测序读段覆盖度低，因而可节省成本。通过使用蛋白A或蛋白A/G-微球菌核酸酶（MNase），CUT&RUN 可与任何现有抗体联用，因此有望快速、简便地对多种蛋白质进行分析。然而，相较于单细胞转录组学（例如 scRNA-seq），将该技术应用于染色质上任意蛋白质的单细胞检测一直面临挑战，主要原因在于DNA拷贝数远低于RNA（DNA为两到四个拷贝，而RNA可能达到数千拷贝）。

在上述方案中，有几个关键步骤需要特别注意。首先，细胞的正确分选依赖于细胞（或组织）类型，应谨慎操作以确保分选准确。建议在正式实验前，预先测试所用仪器进行单细胞分选的有效性。其次，有效选择抗体至关重要。在开展单细胞实验之前，建议先在细胞数量较多的实验中测试抗体效果（同时也应进行其他标准抗体验证实验，例如通过敲低后使用Western blot确认特异性、在CUT&RUN实验中进行抗体滴定等）。第三，应使用阴性对照，例如IgG或不加一抗，因为与实验样...

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披露

作者声明本项目不存在任何竞争利益。

致谢

感谢Hainer实验室成员阅读本文的早期版本并提出意见。本项目使用了位于匹兹堡大学医学中心匹兹堡儿童医院匹兹堡大学健康科学测序中心的NextSeq500进行测序，特别感谢该中心负责人William MacDonald。本研究部分得到了匹兹堡大学研究计算中心提供的计算机资源支持。本研究工作获得了美国国立卫生研究院资助R35GM133732（资助对象：S.J.H.）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 透明微量离心管赛默飞世尔科技90410
1.5 mL 离心管磁力架赛默飞世尔科技12321D
可兼容1.5 mL离心管的低温离心机Eppendorf5404000537
10 cm 无菌组织培养板赛默飞世尔科技150464
10X T4 DNA连接酶缓冲液New England BiolabsB0202S
15 mL 离心管VWR89039-656
1X TE 缓冲液赛默飞世尔科技12090015
200 µL PCR管Eppendorf951010022
2X快速连接酶缓冲液New England BiolabsM2200连接酶缓冲液
5X KAPA HiFi 缓冲液罗氏79588890015X 高保真 PCR 缓冲液
7-氨基放线菌素D（7-AAD）Fisher ScientificBDB559925
96孔磁力架赛默飞世尔科技12027 或 12331D
96孔板VWR82006-636
AMPure XP 磁珠贝克曼库尔特A63881聚苯乙烯-磁铁矿珠；由于AMPure XP磁珠不同批次间可能存在差异，建议对您的AMPure磁珠溶液进行校准。参见生产商说明’s 指令
目的蛋白抗体有所不同
ATP赛默飞世尔科技R0441
BioMag Plus 刀豆蛋白A磁珠Polysciences86057-10ConA偶联的顺磁性微球
BSA
氯化钙（CaCl₂）Fisher ScientificAAJ62905AP
细胞分选仪BD FACSAria II 细胞分选仪需要培训
细胞培养的细胞特异性培养基不固定
氯仿赛默飞世尔科技C298-500氯仿对皮肤有刺激性，吞食有害；应在通风橱中操作，并佩戴手套、实验服和护目镜
配备64位处理器的计算机及超级计算集群访问权限对获得的测序数据集进行计算分析
DNA 离心柱Epoch生命科学1920-250
dNTP 混合物New England BiolabsN0446S
EGTASigma AldrichE3889
电泳设备有所不同
乙醇Fisher Scientific22032601100% 体积比乙醇高度易燃；应在通风橱中操作，并佩戴手套、实验服和护目镜
乙二胺四乙酸  (EDTA)Fisher ScientificBP2482100
FBSSigma AldrichF2442
甘油Fisher ScientificBP229-1
糖原VWR97063-256
HEPESFisher ScientificBP310-500
外源性酿酒酵母DNA内参自制的由交联、MNase 消化并经琼脂糖凝胶提取的基因组 DNA 制备而成，去除蛋白质/RNA 后稀释至 10 ng/mL。推荐使用酵母基因组 DNA，但如有需要也可使用其他生物来源的基因组 DNA。
盐酸  (HCl)Fisher ScientificA144-212盐酸具有强腐蚀性；操作时应在化学通风橱中进行，并佩戴手套、实验服和护目镜
冰桶有所不同
Illumina 测序平台（例如 NextSeq500）Illumina
具有温度和气氛控制功能的培养箱赛默飞世尔科技51030284
KAPA HotStart HiFi DNA 聚合酶与 5X KAPA HiFi 缓冲液罗氏7958889001热启动高保真聚合酶
层流罩烘焙公司SG404
氯化锰（MnCl2）Sigma Aldrich244589
微量移液器套装Rainin30386597
迷你离心机Benchmark ScientificC1012
NEB 接头New England BiolabsE6612AVIAL适配器
NEB 通用引物New England BiolabsE6611AVIAL通用引物
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina 试剂盒New England BiolabsE7335S/L，E7500S/L，E7710S/L，E7730S/L索引引物
阴性对照抗体Antibodies-OnlineABIN101961
无核酸酶水New England BiolabsB1500S
PCR扩增仪Eppendorf2231000666
相位锁定管Qiagen129046
苯酚/氯仿/异戊醇（PCI）赛默飞世尔科技15593049苯酚若吞食或接触皮肤有害；应在通风橱中操作，并佩戴手套、实验服和护目镜
磷酸盐缓冲液（PBS）赛默飞世尔科技10814010
移液器辅助器Drummond Scientific# 4-000-100
聚乙二醇（PEG）4000VWRA16151
氯化钾（KCl）Sigma AldrichP3911
氢氧化钾（KOH）Fisher ScientificP250-1注意：KOH 固体对眼睛和皮肤有刺激性，其溶液具有腐蚀性。应在化学通风橱中操作，并佩戴手套、实验服和护目镜。
蛋白酶抑制剂赛默飞世尔科技78430
ProteinA/G-MNaseEpicypher15-1016pA/G-MNase
ProteinA-MNase（源自pK19pA-MN的纯化蛋白）Addgene86973
蛋白酶KNew England BiolabsP8107S
Qubit 1X dsDNA HS 检测试剂盒赛默飞世尔科技Q33230
Qubit 检测管赛默飞世尔科技Q32856
Qubit 荧光仪赛默飞世尔科技Q33238
快速连接酶与2×快速连接酶缓冲液New England BiolabsM2200S
RNase ANew England BiolabsT3010
乙酸钠  (NaOAc)赛默飞世尔科技BP333-500
氯化钠（NaCl）Sigma AldrichS5150-1L
十二烷基硫酸钠（SDS）赛默飞世尔科技BP166-500SDS 若吸入有毒；操作时应戴手套、护目镜，并佩戴 N95 级别呼吸器，在通风良好的空间中谨慎操作
氢氧化钠（NaOH）Fisher ScientificS318-1NaOH 固体对眼睛和皮肤具有刺激性，其溶液具有腐蚀性。应在通风橱中操作，并佩戴手套、实验服和护目镜。
亚精胺Sigma AldrichS2626
标准倒置光学显微镜Leica11526213
标准实验室琼脂糖凝胶材料不固定
标准实验室耗材，如血清移液管和移液器吸头不固定
T4 DNA连接酶New England BiolabsM0202S
T4 DNA聚合酶New England BiolabsM0203S
T4 PNKNew England BiolabsM0201S
台式涡旋振荡器Fisher Scientific2215414
Taq DNA聚合酶New England BiolabsM0273S
恒温混匀仪Eppendorf5384000020或者，可使用水浴
Tris 碱Fisher ScientificBP152-5
Triton X-100Sigma Aldrich9002-93-1Triton X-100 具有危害性；操作时应穿戴实验服、手套和护目镜
胰蛋白酶Fisher ScientificMT25052
试管旋转仪VWR10136084
USER酶New England BiolabsM5505S

参考文献

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