使用靶标下的超低输入切割在染色质上的单细胞因子定位，并使用核酸酶释放

Summary

CUT&RUN及其变体可用于确定染色质上的蛋白质占用率。该协议描述了如何使用单细胞uliCUT&RUN确定染色质上的蛋白质定位。

Abstract

确定蛋白质在染色质上的结合位置对于了解其功能和潜在的调节靶点至关重要。30多年来，染色质免疫沉淀（ChIP）一直是确定蛋白质定位的黄金标准，其定义是使用抗体从超声处理或酶消化染色质中提取出感兴趣的蛋白质。最近，由于抗体系留技术增加了敏感性，因此在评估染色质上的蛋白质定位方面变得流行起来。靶标下的裂解和核酸酶下的释放（CUT&RUN）是染色质免疫裂解（ChIC）的全基因组衍生物，并利用与微球菌核酸酶（pA-MNase）相连的重组蛋白A来鉴定靶向目标蛋白的抗体的IgG恒定区域，从而实现靶向目标蛋白侧面的DNA的位点特异性裂解。CUT&RUN可用于分析组蛋白修饰，转录因子和其他染色质结合蛋白，如核小体重塑因子。重要的是，CUT&RUN可用于评估真色素或异色相关蛋白质和组蛋白修饰的定位。由于这些原因，CUT&RUN是确定各种蛋白质结合谱的强大方法。最近，CUT&RUN已经针对低细胞群和单细胞的转录因子分析进行了优化，优化的方案被称为超低输入CUT&RUN（uliCUT&RUN）。在这里，以手动96孔格式提出了使用uliCUT&RUN进行单细胞因子分析的详细方案。

Introduction

许多核蛋白通过与染色质相互作用来促进或阻止DNA模板化活性。为了确定这些染色质相互作用蛋白的功能，重要的是要确定这些蛋白结合的基因组位置。自1985年开发以来，染色质免疫沉淀（ChIP）一直是鉴定蛋白质与染色质^1，2结合的黄金标准。传统的ChIP技术具有以下基本工作流程:收获细胞并交联（通常与甲醛），剪切染色质（通常使用苛刻的超声处理方法，需要交联），使用靶向蛋白质（或标记蛋白质）的抗体免疫沉淀，然后使用二抗（与琼脂糖或磁珠偶联），交联被逆转， 蛋白质和RNA被消化以纯化DNA，并且该ChIP富集DNA被用作分析模板（使用放射性标记的探针^1，2，qPCR³，微阵列^5，6或测序⁴）。随着微阵列和大规模并行深度测序的出现，ChIP-chip^5，6和ChIP-seq⁴最近被开发出来，并允许全基因组鉴定染色质上的蛋白质定位。交联ChIP自问世以来一直是一种强大而可靠的技术，ChIP-exo⁷和ChIP-nexus⁸在分辨率方面取得了重大进展。在开发 ChIP-seq 的同时，已经建立了用于 ChIP （N-ChIP） 的天然（非交联）方案，其利用核酸酶消化（通常使用微球菌核酸酶或 MNase）来片段化染色质，而不是在传统的交联 ChIP 技术中进行的超声处理⁹.然而，交联ChIP和N-ChIP技术的一个主要缺点是由于实验操作后的DNA产量低，因此对高细胞数量的需求。因此，近年来，许多努力都是为了优化ChIP技术以实现低电池输入。这些努力导致开发了许多强大的基于ChIP的技术，这些技术的适用性和输入要求^{10，11，12，13，14，15，16，17，18}各不相同。然而，基于单细胞ChIP-seq的技术一直缺乏，特别是对于非组蛋白。

2004年，开发了一种替代技术来确定染色质上的蛋白质占用率，称为染色质内源性裂解（ChEC）和染色质免疫裂解（ChIC）¹⁹。这些单位点技术利用MNase与目标蛋白（ChEC）或蛋白A（ChIC）的融合，以直接切割与目标蛋白相邻的DNA。近年来，ChEC和ChIC都针对染色质的全基因组蛋白质分析进行了优化（分别为ChEC-seq和CUT&RUN）^20，21。虽然ChEC-seq是确定因子定位的强大技术，但它需要为每个靶标开发MNase融合蛋白，而ChIC及其全基因组变异CUT&RUN依赖于针对目标蛋白（如ChIP）和重组蛋白A-MNase的抗体，其中蛋白A可以识别抗体的IgG恒定区域。作为替代方案，已经开发了融合蛋白A /蛋白G-MNase（pA / G-MNase），可以识别更广泛的抗体常数区域²²。CUT&RUN已迅速成为ChIP-seq的流行替代品，用于确定染色质全基因组上的蛋白质定位。

超低输入CUT&RUN（uliCUT&RUN）是CUT&RUN的一种变体，可以使用低和单单元输入，在2019年进行了描述²³。这里，描述了手动96孔格式单细胞应用的方法。值得注意的是，自uliCUT&RUN开发以来，已经开发了组蛋白分析的两种替代方案，CUT&Tag和iACT-seq，为组蛋白^24，25提供了稳健且高度平行的分析。此外，scCUT&Tag已经过优化，可以分析单个细胞中的多种因子（multiCUT&Tag）并应用于非组蛋白²⁶。总之，CUT&RUN为低输入ChIP-seq提供了一种有吸引力的替代方案，其中uliCUT&RUN可以在任何可以使用细胞分选机和标准设备的分子生物学实验室中进行。

Protocol

伦理声明:所有研究均获得匹兹堡大学研究保护机构生物安全办公室的批准。

1. 准备磁珠

注意:在细胞分选前进行，并保持在冰上直到使用。

1. 每次反应移液30μLConA共轭顺磁微球珠浆混合物到新鲜的1.5mL微量离心管中，并加入850μL结合缓冲液，轻轻移液以混合。
   注意:共轭顺磁微球是凝集素包被的磁珠，允许脂质膜结合。
2. 将管放在磁性架上，让磁珠磁化1-2分钟。一旦上清液清除，除去并丢弃上清液而不干扰磁珠。
3. 从磁性架上取出管子，并通过重悬于1 mL结合缓冲液中洗涤磁珠。
4. 重复步骤 1.2 和 1.3。
5. 磁化珠子2分钟，并除去上清液以丢弃。
6. 从磁性架上取出管子，并将磁珠重悬于每次反应的30μL结合缓冲液中。
7. 将洗涤的珠子混合物放在冰上，直到细胞被分类。

2. 收获细胞

注意:此步骤是为粘附细胞编写的，并针对小鼠E14胚胎干细胞进行了优化。细胞的培养和收获取决于细胞类型。

1. 从37°C培养箱中取出细胞，并在显微镜下检查以确保质量。
2. 从细胞板中吸出培养基，并用5毫升1x PBS冲洗。
3. 从平板中吸取PBS并收获细胞（使用传统的细胞收获方法，这些方法因细胞类型而异）。如有必要，通过用血清学移液管轻轻地上下移液到培养皿上以获得单细胞悬浮液。
4. 将细胞悬浮液转移到15mL锥形管中，并以200× g 旋转5分钟。
5. 吸出培养基以丢弃并用5mL PBS + 1%FBS洗涤细胞沉淀。
6. 以200× g 旋转细胞5分钟，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于5mL PBS + 1%FBS中。
7. 计数细胞并将1 mL 1 x 10⁶ 个细胞转移到新鲜的1.5 mL微量离心管中。
8. 加入5μL7-氨基放线菌素D（7-AAD），倒置管孔进行混合，然后将样品施用于细胞分选器以将活单细胞分选到96孔板的单个孔中。
   注意:7-AAD染料从活细胞中排除，因此可用于活细胞分选。

3. 细胞分选和裂解

1. 在细胞分选之前，在每个孔中制备具有100μL核萃取（NE）缓冲液的细胞分选器兼容的96孔板。
2. 按照制造商的说明将细胞分类到96孔板中。
3. 快速旋转板（600× g ，持续30秒），以确保细胞在孔内的缓冲液中。
   注意:值得在初步实验中测试所使用的细胞是否可靠地带到孔的底部。
4. 将样品在冰上保持15分钟。
5. 在4°C下以600× g 旋转样品5分钟，并小心移液以除去上清液（留下5μL）。
6. 将每个样品重悬于55μL NE缓冲液中，并向每个反应中加入30μL预洗的ConA共轭顺磁性微球（来自步骤1.7;在结合缓冲液中）。
7. 在室温下孵育10分钟。

4. 预封闭样品，防止MNase早期消化

1. 将板放在96孔磁性架上，让磁珠结合至少5分钟，然后取出并丢弃上清液。
2. 向细胞核结合的微球中加入100μL封闭缓冲液，并用温和移液混合。
3. 在室温下孵育5分钟。

5. 添加一抗

1. 将板放在96孔磁性架上，让上清液清除至少5分钟，然后除去并丢弃上清液而不干扰磁珠。
2. 从磁性架上取出板，并将磁珠重悬于每次反应的100μL洗涤缓冲液中，轻轻移液。
3. 将板放回96孔磁性架上，让上清液清除，然后取出并丢弃上清液。
4. 将微球重悬于每次反应的25μL洗涤缓冲液中，轻轻移液。
5. 制作一抗主混液:每次反应25μL洗涤缓冲液+ 0.5μL抗体。
6. 在轻轻涡旋核结合的磁珠的同时，向每个用靶向目标蛋白的抗体处理的样品中加入25μL一抗主混液（通常为1:100最终稀释）。如果进行对照，则加入25μL无抗体的洗涤缓冲液。
7. 在室温下孵育1小时。
8. 将样品放在96孔磁性架上，让上清液清除至少5分钟，然后除去并丢弃上清液而不干扰珠子。
9. 从磁性架上取出板，并用100μL洗涤缓冲液洗涤磁珠，通过移液重悬。

6. 添加 pA-MNase 或 pA/G-MNase

注意:蛋白A对来自某些物种（如兔子）的IgG分子具有高亲和力，但不适用于来自其他物种（如小鼠或大鼠）的IgG。或者，可以使用蛋白A / G-MNase。这种杂交结合兔，小鼠和大鼠IgG，避免了使用小鼠或大鼠一抗时对二抗的需求。

1. 将板放回96孔磁性架上，让上清液清除至少5分钟，然后除去并丢弃上清液而不干扰磁珠。
2. 从磁性架上取出板，并将每个样品重悬于25μL洗涤缓冲液中。
3. 制作pA-MNase预混液（每次反应25μL洗涤缓冲液+优化量的pA-MNase）。
4. 在轻轻涡旋的同时，向每个样品（包括对照样品）加入25μL pA-MNase预混液。
   注意:如果自制，pA-MNase的浓度因制备而异，应在每次独立纯化时使用前进行测试。对于 pA/G-MNase，应使用 20x 储备液中的 2.5 μL。
5. 将样品在室温下孵育30分钟。
6. 将板放在96孔磁性架上，让上清液清除至少5分钟，然后除去并丢弃上清液而不干扰磁珠。
7. 从磁性架上取出板，并用100μL洗涤缓冲液洗涤磁珠，通过轻柔移液重悬。

7. 定向DNA消化

1. 将板放在96孔磁性架上，让上清液清除至少5分钟，然后除去并丢弃上清液。
2. 从磁性架中取出样品，并通过温和移液将微球重悬于50μL洗涤缓冲液中。
3. 将样品在冰/水混合物中平衡至0°C5分钟。
4. 从0°C冰/水浴中取出样品，并使用多通道移液器加入1μL100mM CaCl₂ 。使用较大体积的多通道移液器轻轻移液充分混合（3-5次），然后将样品返回到0°C。
   注意:在这里充分混合是必不可少的。加入CaCl₂ 以激活目标蛋白质两侧DNA的MNase消化。
5. 一旦板回到冰/水浴中，立即启动10分钟的计时器。
6. 通过将50μL2XRSTOP +缓冲液移液到每个孔中来停止反应，其顺序与加入CaCl₂ 的顺序相同。
   注意:在10分钟消化结束之前制作2XRSTOP +缓冲液，以防止过度消化。

8. 样品分馏

1. 将样品在37°C下孵育20分钟。
2. 在4°C下以16，000× g 旋转板5分钟。
3. 将板放在96孔磁架上，让上清液澄清至少5分钟，然后将上清液转移到新鲜的96孔板上。丢弃珠子。

9. DNA提取

1. 向每个样品中加入1μL10%十二烷基硫酸钠（SDS）和0.83μL20mg / mL蛋白酶K。
   注意:SDS 粉末如果吸入是有害的。用户应在通风良好的空间使用，戴上护目镜，手套和N95级呼吸器，小心处理。
2. 通过轻柔移液混合样品。
3. 将样品在70°C下孵育10分钟。
4. 将板返回到室温，并加入46.6μL的5M NaCl和90μL的50%PEG 4000。通过轻柔移液混合。
5. 向每个样品中加入33μL聚苯乙烯 - 磁铁矿珠，并在室温下孵育10分钟。
   注意:请务必将聚苯乙烯 - 磁铁矿珠带到室温（约30分钟）并在使用前充分混合。
6. 将板放在磁性架上，让上清液清除约5分钟，然后小心地丢弃上清液而不干扰珠子。
7. 用150μL80%乙醇冲洗2x，而不会干扰珠子。
   注意:乙醇高度易燃，会引起皮肤、眼睛和肺部刺激。使用适当的实验室服装和通风罩执行此步骤。
8. 将板以1000× g 短暂旋转30秒。将板放回96孔磁性架上，并在不干扰磁珠的情况下去除所有残留的EtOH。
9. 将样品风干约2-5分钟。
   注意:不要将珠子干燥超过5分钟。如果勤于去除EtOH，2-3分钟的干燥就足够了。
10. 用37.5μL的10mM Tris-HCl（pH 8）重悬珠子，并在室温下孵育5分钟。
11. 将板放在磁性架上，让磁珠粘合5分钟。
12. 将36.5μL上清液转移到与新鲜热循环仪兼容的96孔板中。丢弃珠子。
    注意:通过将样品储存在-20°C或可以继续进行文库构建（步骤10-15），可以在此处停止实验。

10.末端修复，磷酸化，腺苷化

注:试剂的来源见 材料表中。以下方案遵循与商业试剂盒类似的方法，例如NEBNext Ultra DNA II试剂盒。

1. 在1x T4 DNA连接酶缓冲液中稀释5 U / μL的T4 DNA聚合酶1:20。
2. 制备终末修复/ 3'A预混液:2μL 10x T4 DNA连接酶缓冲液，2.5μL 10mM dNTPs，1.25μL 10mM ATP，3.13μL 40%PEG 4000，0.63μL 10 U / μL T4 PNK，0.5μL稀释的T4 DNA聚合酶，0.5μL 5U / μL Taq DNA聚合酶，每次反应总体积为13.5μL。
   注意:移液前一定要将40%PEG 4000带到室温。
3. 向 36.5 μL DNA 中加入 13.5 μL 终末修复/3'A 预混液。
4. 通过快速涡旋混合反应，然后快速旋转（500× g 持续10秒）。
5. 使用以下反应条件在预冷的热循环仪中用加热的盖子孵育，温度为>20°C。 使用反应条件:12°C15分钟，37°C15分钟，72°C20分钟，保持在4°C。

11. 适配器结扎

注意:在设置以下反应时将样品保持在冰上。在移液前让连接酶缓冲液达到室温。将适配器（见 材料表）稀释在含有10mM NaCl（pH 7.5）的10mM Tris-HCl溶液中。由于产量低，不要预先量化富含CUT&RUN的DNA。相反，使用0.6μM的最终工作适配器浓度产生25倍稀释的适配器。

1. 制作连接预混液:55μL连接酶缓冲液（2x），5μLT4 DNA连接酶和5μL稀释的适配器，每次反应的总体积为65μL。
2. 从步骤10.5中加入65μL主连接混合物到50μLDNA中。
3. 通过快速涡旋混合，然后快速旋转（500 x g ，持续10秒）。
4. 在20°C的热循环仪（没有加热的盖子）中孵育15分钟。
   注意:立即继续执行以下步骤。

12. 用户消化

1. 向每个样品中加入3μLUSER酶，涡旋和旋转（500× g 持续10秒）。
2. 在37°C的热循环仪中孵育15分钟（加热的盖子设置为50°C）。

13. 结扎反应后聚苯乙烯-磁铁矿珠的清理

注意:让聚苯乙烯磁铁矿珠在室温（约30分钟）下平衡。涡旋以在使用前使珠子溶液均质化。在室温下执行以下步骤。

1. 向每个含有接插件连接DNA的孔中加入39μL（0.33x）聚苯乙烯 - 磁铁矿珠溶液。
2. 通过移液彻底混合，然后将样品在室温下孵育15分钟，以使DNA与磁珠结合。
3. 将样品放在96孔磁架上，孵育5分钟，直到上清液清澈。
4. 将板放在磁架上，小心地取出并丢弃上清液，而不会干扰磁珠。
5. 用200μL80%EtOH冲洗珠子，而不会干扰磁珠。
6. 在 96 孔磁性支架上孵育 30 秒，以使溶液透明。
7. 去除并丢弃上清液，而不会干扰珠子。
8. 重复步骤 13.5-13.7，总共进行两次洗涤。
9. 将板以500 x g 短暂旋转10秒，将板放回96孔磁性架上，并在不干扰磁珠的情况下除去残留的EtOH。
10. 将板放在磁性架上，并将样品风干2分钟。
    注意:请勿过度干燥珠子。
11. 从磁性架上取下板，并将磁珠重悬于28.5μL的10 mM Tris-HCl（pH 8）中。
    注意:盐酸具有很强的腐蚀性。用户应穿着护目镜，手套和实验室外套在化学通风橱中小心处理。
12. 通过移液彻底重悬珠子，注意不要产生气泡。
13. 在室温下孵育5分钟。
14. 将板放在96孔磁性架上，让溶液清除5分钟。
15. 将27.5μL上清液转移到新的PCR板上并丢弃磁珠。

14. 库丰富

注意:引物用与适配器相同的溶液稀释。对于此文库构建，请使用0.6μM的最终工作引物浓度。

1. 向每个样品中加入5μL稀释的索引引物（参见 材料表）。
   注意:测序后，每个样品都需要不同的指数来识别。
2. 制备PCR预混液:10 μL 5x高保真PCR缓冲液，1.5 μL 10 mM dNTPs，5 μL稀释的通用引物，1 μL 1 U热启动高保真聚合酶，每个样品的总预混液体积为17.5 μL。
3. 将17.5μL pf PCR混合物加入32.5μL纯化的接合子连接DNA中（该体积中包括5μL索引引物）。
4. 通过移液混合溶液。
5. 使用以下反应条件在热循环仪中孵育，最大升降温速率为3°C / s:98°C45 s，98°C45 s，60°C10 s，重复第二和第三步21次，72°C1分钟，保持在4°C。
   注意:样品可以保存在4°C进行短期储存，或-20°C长期储存。

15. 聚苯乙烯磁铁矿珠清理

1. 向每个样品中加入60μL（1.2x）聚苯乙烯磁铁矿珠。
2. 通过移液重悬珠子，并在室温下孵育15分钟。
3. 将板放在磁性架上5分钟，直到溶液变清。
4. 弃去上清液并用200μL80%EtOH冲洗珠子而不干扰磁珠。
5. 重复洗涤步骤，总共进行两次80%的EtOH洗涤。
6. 将板以500× g 旋转10秒，将板放在96孔磁性架上，让磁珠结合5分钟。
7. 移液器在不干扰磁珠的情况下除去多余的EtOH，并使磁珠风干2分钟。
   注意:请勿过度干燥珠子。
8. 将磁珠重悬于21μL无核酸酶的水中，并在室温下孵育5分钟。
9. 将板放在磁性架上，让溶液澄清5分钟。
10. 将20μL上清液转移到新板上。
    注意:通过将样品储存在-20°C，可以在此处停止实验。
11. 使用荧光计定量文库浓度（参见 材料表），使用1x HS试剂。
12. 如果浓度允许，在具有低分子量分子量标的1.5%琼脂糖凝胶上电泳30ng样品以进行可视化。或者，在片段分析器或相关仪器上进行可视化。
13. Illumina平台上的序列库，以获得约50，000-100，000个唯一映射的读取。

Results

在这里，提出了一个详细的方案，用于使用96孔手动格式uliCUT&RUN对染色质进行单细胞蛋白质分析。虽然结果会根据所分析的蛋白质（由于蛋白质丰度和抗体质量），细胞类型和其他影响因素而有所不同，但本文将讨论该技术的预期结果。细胞质量（细胞外观和活细胞百分比）和单细胞分选应在活细胞分选到NE缓冲液之前或期间进行评估。ES细胞集落和细胞分选的示例如图2A，B所示。具体而言，不应使用低质量细胞，如果质量有问题，应注意遵循特定细胞类型的指南。此外，在实验之前，应评估细胞分选仪器对细胞分选的准确性。例如，可以使用Hoechst 33342染色对测试细胞进行分类和染色，并进行计数以确保在每个孔中发现0或1个细胞。如果未找到单个单元格，则必须优化排序条件。文库制备后，可以在测序前在琼脂糖凝胶（如果浓度允许上样30ng或更高，因为琼脂糖凝胶上的DNA可视化有下限）或片段分析仪（或类似设备，如Tapestation或生物分析仪）上评估样品，示例结果如图2C所示，D

Discussion

CUT&RUN是确定染色质上蛋白质定位的有效方案。与其他协议相比，它具有许多优点，包括:1）高信噪比，2）快速协议，以及3）所需的低排序读取覆盖率，从而节省了成本。使用蛋白A-或蛋白A / G-MNase使CUT&RUN能够与任何可用的抗体一起使用;因此，它有可能快速，轻松地分析许多蛋白质。然而，对于染色质上的任何蛋白质分析，适应单细胞是困难的，特别是与单细胞转录组学（即scRNA-seq）相比，由于DNA相对于RNA的拷贝数低（两到四个DNA拷贝与可能的数千个RNA拷贝相比）。

在上面详述的协议中，应考虑几个关键步骤。首先，细胞的适当分类取决于细胞（或组织）类型，应注意准确分类。建议在任何实验之前使用仪器测试单细胞分选的有效性。其次，有效的抗体选择至关重要。在进行单细胞应用之前，建议在高细胞数实验中测试抗体（以及其他标准抗体测试，例如在敲低后使用蛋白质印迹确认特异性，在CUT&RUN实验中滴定抗体等）。第三，使用阴性对照，如IgG或无一抗，因为与实验样品的适当比较对于解释数据质量和生物学结果至关重要。当将单细胞实验结果与高细胞数数据集进行比较时，阴性对照单细胞实验对高细胞实验中鉴...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL 透明微量离心管	ThermoFisher Scientific	90410
1.5 mL 试管磁力架	ThermoFisher Scientific	12321D
1.5 mL 试管兼容冷离心机	Eppendorf	5404000537
10 cm 无菌组织培养板	ThermoFisher Scientific	150464
10X T4 DNA 连接酶缓冲液	新England Biolabs	B0202S
15 mL 锥形管	VWR	89039-656
1X TE 缓冲液	ThermoFisher Scientific	12090015
200 µL PCR 管	Eppendorf	951010022
2X 快速连接酶缓冲液	New England Biolabs	M2200	连接酶缓冲液
5X KAPA HiFi 缓冲液	Roche	7958889001	5X 高保真 PCR 缓冲液
7-氨基放线菌素 D （7-AAD）	Fisher Scientific	BDB559925
96 孔磁力架	ThermoFisher Scientific	12027 或 12331D
96 孔板	VWR	82006-636
AMPure XP 珠子	Beckman Coulter	A63881	聚苯乙烯磁铁矿珠子;由于 AMPure XP 微珠批次之间存在潜在差异，建议您校准 AMPure 微珠溶液。查看制造商s 说明
目标蛋白质	的抗体变化
ATP	ThermoFisher Scientific	R0441
BioMag Plus 伴刀豆球蛋白 A 珠	Polysciences	86057-10	ConA 偶联顺磁性微球
BSA
氯化钙 （CaCl2）	Fisher Scientific	AAJ62905AP
细胞分选仪	BD FACSAria II 细胞分选仪		需要培训
用于细胞培养的细胞特异性培养基	变化
氯仿	ThermoFisher Scientific	C298-500	氯仿对皮肤有刺激性，吞咽有害;使用手套、实验服和护目镜在化学通风橱中处理
带有 64 位处理器的计算机，可访问超级计算集群			用于对结果测序数据集进行计算分析
DNA 离心柱	Epoch Life Sciences	1920-250
dNTP 套装	New England Biolabs	N0446S
EGTA	Sigma Aldrich	E3889
电泳设备	变化
乙醇	Fisher Scientific	22032601	100% vol/vol 乙醇高度易燃;使用手套、实验室外套、和护目
乙二胺四乙酸 （乙二胺四乙酸）	Fisher Scientific	BP2482100
FBS	Sigma Aldrich	F2442
甘油	Fisher Scientific	BP229-1
糖原	VWR	97063-256
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
异源酿酒酵母 DNA 加标	自制		由交联、MNase 消化和琼脂糖凝胶提取的基因组 DNA（纯化蛋白质/RNA）并稀释至 10 ng/mL 制备。我们推荐使用酵母基因组 DNA，但如果需要，也可以使用其他生物体。
盐酸 （盐酸）	Fisher Scientific	A144-212	盐酸具有很强的腐蚀性;使用手套、实验服和护目镜在化学通风橱中处理
冰桶	Illumina
测序平台（例如 NextSeq500）	Illumina
	Scientific	51030284
含 5X KAPA HiFi 缓冲液的 KAPA 热启动 HiFi DNA 聚合酶	Roche	7958889001	热启动高保真聚合酶
层流罩	Bakery Company	SG404
氯化锰 （MnCl2）	Sigma Aldrich	244589
微量移液器套装	Rainin	30386597
Minifuge	Benchmark Scientific	C1012
NEB 适配器	New England Biolabs	E6612AVIAL	适配器
NEB 通用引物	New England Biolabs	E6611AVIAL	通用引物
NEBNext 多重寡核苷酸 for Illumina 试剂盒	New England Biolabs	E7335S/L、E7500S/L、E7710S/L、E7730S/L	索引引物
阴性对照抗体	抗体-在线	ABIN101961
无核酸酶水	New England Biolabs	B1500S
PCR 热循环仪	Eppendorf	2231000666
锁相管	Qiagen	129046
苯酚/氯仿/异戊醇 （PCI）	ThermoFisher Scientific	15593049	苯酚吞咽或皮肤接触有害;使用手套、实验服和护目镜
在化学通风橱中处理磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	ThermoFisher Scientific	10814010
移液器辅助	Drummond Scientific	# 4-000-100
聚乙二醇 （PEG） 4000	VWR	A16151
氯化钾 （KCl）	Sigma Aldrich	P3911
氢氧化钾 （KOH）	Fisher Scientific	P250-1	注意：KOH 是一种固体和腐蚀性溶液，对眼睛/皮肤有刺激性。使用手套、实验室外套和护目镜在化学通风橱中处理
蛋白酶抑制剂	ThermoFisher Scientific	78430
ProteinA/G-MNase	Epicypher	15-1016	pA/G-MNase
ProteinA-MNase，从 pK19pA-MN 中纯化	Addgene	86973
蛋白酶 K	New England Biolabs	P8107S
Qubit 1X dsDNA HS 检测试剂盒	ThermoFisher Scientific	Q33230
Qubit 检测管	ThermoFisher Scientific	Q32856
Qubit 荧光计	ThermoFisher Scientific	Q33238
快速连接酶，含 2X 快速连接酶缓冲液	New England Biolabs	M2200S
RNase A	New England Biolabs	T3010
乙酸钠 （NaOAc）	ThermoFisher Scientific	BP333-500
氯化钠 （NaCl）	Sigma Aldrich	S5150-1L
十二烷基硫酸钠 （SDS）	ThermoFisher Scientific	BP166-500	SDS 吸入有毒;处理氢氧化钠 （NaOH） 时，使用手套、护目镜和 N95 级呼吸器在通风良好的空间小心处理
Fisher	Scientific	S318-1	NaOH 是一种固体和腐蚀性溶液，对眼睛/皮肤有刺激性。使用手套、实验服和护目镜在化学通风橱中作
亚精胺	Sigma Aldrich	S2626
标准倒置光学显微镜	Leica	11526213
标准实验室琼脂糖凝胶材料	多种
标准实验室材料，如血清移液器和移液器吸头	不同 T4
DNA 连接酶	新英格兰 Biolabs	M0202S
T4 DNA 聚合酶	New England Biolabs	M0203S
T4 PNK	New England Biolabs	M0201S
台式涡旋仪	Fisher Scientific	2215414
Taq DNA 聚合酶	New England Biolabs	M0273S
Thermomixer	Eppendorf	5384000020	替代，可以使用水浴
Tris 碱	Fisher Scientific	BP152-5
Triton X-100	Sigma Aldrich	9002-93-1	Triton X-100 是危险的;处理胰蛋白酶时请使用实验服、手套和护目镜
Trypsin	Fisher Scientific	MT25052
Tube 旋转器	VWR	10136084
USER 酶	New England Biolabs	M5505S