标准膜饲法（SMFA）被认为是评估和鉴定潜在抗疟化合物的金标准。该人工饲喂系统用于感染蚊子，以进一步评价这些化合物对Plasmodium falciparum寄生虫感染强度和流行率的影响。
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摘要
摘要
疟疾仍然是全球最具破坏性的疾病之一，迄今为止，非洲地区仍占全球所有病例的94%。这种寄生虫病需要一种原生动物寄生虫和一个 按蚊属 蚊媒和脊椎动物宿主。 按蚊属 属包含500多个物种，其中60种已知为该寄生虫的传播媒介。 疟原虫 寄生虫属包含250个物种，其中48个参与疾病传播。此外， 恶性疟原虫 近年来，该寄生虫导致了撒哈拉以南非洲约99.7%的疟疾病例。
配子体是寄生虫有性阶段的一部分，当雌性蚊子叮咬受感染的人类宿主时会被摄入。在蚊子中肠内有利的环境条件下，寄生虫在蚊体内的进一步发育得以促进。在此过程中，雌雄配子发生融合，并形成可运动的动合子。动合子侵入蚊子中肠上皮，成熟的动合子发育为卵囊，卵囊进而产生可运动的子孢子。这些子孢子迁移至蚊子的唾液腺，并在蚊子吸食血液时被注入新的宿主体内。
为了药物发现的目的，在标准膜饲法（SMFA）中，蚊子被人工感染了含有配子体的血液。为了检测蚊体内的感染情况和/或评估抗疟化合物的效果，感染后取出雌蚊的中肠，并用汞溴红染色。该方法可增强在显微镜下对卵囊的可视化检测，从而准确测定卵囊的感染率和感染强度。
引言
疟疾是全球最具破坏性的疾病之一，至今仍对多个国家构成重大威胁，尤其是非洲地区的国家，其病例数约占全球总数的95%1该疾病由一种原生动物寄生虫引起，并与其共同导致 按蚊属 蚊媒，这些元凶可对人类宿主造成严重危害2更具体地说， falciparum 物种的 疟原虫 疟原虫属导致了撒哈拉以南非洲约99%的疟疾病例1此外，还有几个主要的 按蚊属 蚊媒（包括 An. gambiae Giles An. arabiensis Patton An. coluzzii Coetzee & Wilkerson 新种，以及 An. funestus Giles）在全球范围内可归因于超过95%的寄生虫传播3,4,5,6,7,8要建立理想的寄生虫-媒介共生关系，蚊媒必须对寄....
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方案
请参见图1以了解本方案的示意图。采集和使用人血的伦理许可已由比勒陀利亚大学健康科学伦理委员会（506/2018）批准。
1. 配子体培养
注意：在进行标准膜饲法（SMFA）之前，需在比勒陀利亚大学制备疟原虫配子体培养物（完整实验方案详见 Reader 等人22）。
- 准备含有 NF54 寄生虫株第 V 期配子体的配子体培养物。
- 确保培养物的配子体血症率为 1.5% 至 2.5%，红细胞比容为 50%，使用 A+ 男性血清，并添加新鲜红细胞。
- 将培养物分装至不同的烧瓶中，在进行 SMFA 前 48 小时，为每组相应处理分别加入 2 µM 的各化合物。对照组不作处理。
- 在进行 SMFA 前不久评估配子体培养物，以确认雄性配子的出丝现象，并确保雌雄比例为 3:1。
2. 通过 SMFA 对蚊子进行人工感染
注意：生物安全：感染的蚊子应饲养在具有受限访问权限的生物安全二级（BSL2）设施中。
- 使用口吸器将25只未吸血的雌性
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结果
共解剖了47个对照样本，平均卵囊流行率为89%，中肠内平均强度为每中肠9.5个卵囊（表1，此前已发表22）。对于化合物MMV1581558，样本量达到共42个样本，卵囊流行率为36%，平均强度为1.5个卵囊。这表明在全部三个生物学重复中，卵囊流行率降低了58%，传播抑制活性（TRA）达到82%（表1）。
MMV1581558 的 %TRA 和 %TBA 均高于 50%；因此，该化合物可被视为具有阻断和降低传播潜力的候选药物。在强度和流行率方面的统计分析均显示，对照组与 MMV1581558 组之间存在显著差异。p < 0.0001) (表1 和 图5).
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讨论
为了成功实施本方案，即使该过程可能繁琐且费力，也必须认真对待每一步骤。其中最重要的步骤之一是在开始SMFA之前，确保配子体培养物质量良好，并含有成熟的配子体，且雄雌比例适当23,24。在SMFA过程中，还需严格维持配子体培养物的适宜温度，以防止雄性配子在进入蚊体前过早出丝。另一个对建立成功人工感染至关重要的因素是确保雌蚊具有强烈的吸血欲望，因为蚊子的吸血行为会显著影响实验结果25。为了确保仅对完全吸血的蚊子进行卵囊发育后的解剖，关键是要仔细剔除每个饲养杯中所有未吸血的蚊子，否则将严重影响实验结果。中肠解剖是另一个重要步骤，以保证有足够数量的样本可用于后续分析。中肠组织较易撕裂，可能导致其内容物外溢。本方案中的另一个关键步骤是对中肠进行染色，这对于在显微镜下检测和计数卵囊至关重要。
该方法的一些局限性包括蚊虫样本量较小，这可能影响传播阻断活性（TRA）估计的准确性和变异性20
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者谨此感谢来自 比勒陀利亚大学生物化学、遗传学与微生物学系，可持续疟疾防控研究所，提供配子体培养物的培养与供应。寄生虫菌株由该部门提供（不属本出版物内容）。同时感谢南非科技部（DSI）与国家研究基金会（NRF）；南非研究讲席计划（UID 64763 至 LK，UID 84627 至 LMB）；NRF 实践社群计划（UID 110666 至 LMB 和 LK）；以及南非医学研究理事会战略健康创新合作伙伴关系（SHIP）提供的资金支持，资金来源于 DSI。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 牛肠道/ | 屠宰 | ||
| 化合物 MMV1581558 | MMV | 大流行应对试剂盒 | |
| 解剖针 | WRIM | 定制制作 | |
| falcon 管 | Lasec | ||
| 玻璃饲喂器 | Glastechniek Peter Coelen B.V. | ||
| Graphpad Prism (8.3.0) | Graphpad | ||
| 汞溴红 | Merck (Sigma-Aldrich) | 129-16-8 | |
| 显微镜载玻片 | Merch (Sigma-Aldrich) | S8902 | |
| Parafilm 封口膜 | Cleansafe | ||
| PBS 片剂 | ThermoFisher Scientific | BP2944 | |
| 有机玻璃生物安全柜 | 威特沃特斯兰德大学（Wits University） | 由威特大学承包商制作 | |
| 塑料杯（350 mL） | Plastic Land |
参考文献
- World Malaria Report. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240040496 (2021).
- Takken, W., Verhulst, N. O. Host preferences of blood feeding mosquitoes. Annual Review of Entomology. 58, 433-453 (2013).
- Gillies, M. T., Coetzee, M.
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重印与许可
