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方法文章

使用拉曼染料进行高重组织成像

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DOI：

10.3791/63547

⸱

2022年4月21日

 ,  , 
1Department of Chemistry, Columbia University, 2Kavli Institute for Brain Science, Columbia University

本文内容

摘要

基于电子预共振受激拉曼散射（epr-SRS）的彩虹样拉曼染料成像，是一种用于高重数基于表位的蛋白质成像的新平台。本文中，我们提供了一份实用指南，包括抗体准备、组织样本染色、SRS显微镜组装以及epr-SRS组织成像。

摘要

在组织中可视化大量特定生物标志物对于探索复杂生物系统的精细结构具有重要作用。因此，高通量成像技术日益受到重视。本文介绍一种新兴的高通量振动成像平台，该平台通过电子预共振受激拉曼散射（epr-SRS）成像技术，利用彩虹样拉曼染料实现对特定蛋白质的检测，其灵敏度可与标准免疫荧光技术相媲美。该方法突破了传统免疫荧光技术中光谱可分辨通道数量的限制，提供了一种单次光学成像即可在亚细胞分辨率下检测组织中多种标志物的方法。该技术普遍适用于标准组织样本制备方式，包括多聚甲醛固定的组织、冷冻组织以及福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的人体组织。我们预期该平台将为生物样本中的蛋白质相互作用提供更全面的图景，尤其适用于较厚的完整组织。本实验方案涵盖了从抗体制备、组织样本染色、SRS显微镜组装到epr-SRS组织成像的完整工作流程。

引言

复杂的组织系统由不同的细胞亚群组成，其空间位置和相互作用网络与其功能和功能障碍密切相关1,2。为了揭示组织结构并解析其复杂性，必须掌握单细胞分辨率下蛋白质的空间定位信息。因此，高通量多重蛋白质成像技术日益受到重视，有望成为研究组织生物学的核心工具3,4,5。目前常见的多重蛋白质成像方法可分为两大类：一类是依赖多轮组织染色与成像的连续免疫荧光成像，另一类是结合重金属标记抗体的成像质谱流式技术6,7,8,9,10,11,12。

本文介绍了一种基于抗体的多重蛋白质成像替代策略。与主流的荧光成像方式不同，拉曼显微镜具有更窄的光谱线宽（半高全宽（FWHM）约10 cm-1），而荧光成像由于其较宽的激发和发射光谱（半高全宽（FWHM）约500 cm-1），通常只能同时可视化4至5个通道，因此拉曼显微镜可实现更高通量的多重检测。近年来，利用其窄谱特性，发展出一种名为电子预共振受激拉曼散射（epr-SRS）显微镜的新型拉曼成像方法，为多重成像提供了有力的技术手段13。通过探测拉曼染料中电子耦合的振动模式，epr-SRS可使拉曼截面产生高达1013倍的显著增强效应，从而克服了传统拉曼显微镜的灵敏度瓶颈（图1A）13,14,15。因此，epr-SRS的检测限已达到亚微摩尔（sub-µM）水平，使得对细胞内特定蛋白质和细胞器等重要分子标志物的拉曼检测成为可能13,16。特别是，通过使用拉曼染料标记的抗体，已实现了对细胞和组织中特定蛋白质的epr-SRS成像（称为免疫-eprSRS），其灵敏度可与标准免疫荧光方法相媲美（图1B）13,17。仅需将泵浦光波长调节2 nm，epr-SRS信号即可完全消失（图1B），显示出极高的振动对比度。

在探针方面，已开发出一组彩虹般的拉曼探针，称为曼哈顿拉曼散射（Manhattan Raman scattering, MARS）染料，用于抗体偶联13,18,19,20。这一独特的拉曼调色板包含一系列具有π-共轭三键的新型染料（补充材料），每种染料在生物正交拉曼光谱范围内均表现出单一且窄的增强型受激拉曼散射（epr-SRS）峰（图1C）。通过修饰核心发色团结构并对三键的两个原子进行同位素编辑（补充材料），已开发出光谱上相互分离的拉曼探针。利用其可扩展的多重检测能力，epr-SRS显微技术结合MARS染料调色板为细胞和组织中的单次多重蛋白质成像提供了一种光学策略。

免疫-增强型受激拉曼散射（immuno-eprSRS）为当前多重蛋白成像方法提供了一种具有独特优势的替代策略。与需要循环进行染色、成像和信号清除的荧光方法相比，这种基于拉曼的技术实现了单轮染色和成像，从而避免了循环操作中的实际复杂性，显著简化了实验流程，开辟了多重蛋白成像的新领域。例如，通过结合专为拉曼染料定制的组织透明化方案，免疫-epRSRS 已被拓展至三维空间，可在厚而完整的组织中实现高度多重的蛋白定位17。已有研究在毫米级厚度的小鼠脑组织中实现了超过10种蛋白靶标的可视化17。最近，将免疫-epRSRS 与优化的生物分子保留型膨胀显微镜（ExM）方案相结合21，还实现了多靶标的一次性纳米级成像22。与成像质谱技术4,9相比，epRSRS 具有非破坏性，并具备固有的光学切片能力。此外，epRSRS 在组织扫描中具有更高的时间效率。通常，对一个面积为 0.25 mm2、像素尺寸为 0.5 µm 的组织区域，单个 epr-SRS 通道的成像仅需几分钟。例如，图4中四个 SRS 通道加四个荧光通道的总成像时间约为 10 分钟。

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方案

该实验方案遵循哥伦比亚大学机构动物护理和使用委员会批准的动物实验方案（AC-AABD1552）进行。

1. 拉曼染料偶联抗体的制备

  1. 配制偶联缓冲液：在 PBS 缓冲液中加入约 0.1 M 的 NaHCO3，调节 pH 至 8.3，4 °C 保存。
  2. 将 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯功能化的 MARS 探针（补充材料）配制成 3 mM 的无水 DMSO 溶液。MARS 探针的合成方法可参考先前的文献报道13,17,18。
    注意：为便于储存，染料 NHS 酯溶液必须避光保存，并置于 -20 °C。
  3. 将抗体固体溶解于偶联缓冲液中，使其浓度达到 2 mg/mL。对于溶解在其他缓冲液中的抗体，使用离心过滤器将其置换至偶联缓冲液中，浓度调整为 1–2 mg/mL。
    注意：为减少交叉反应性，多重染色应优先选用高度交叉吸附的二抗。所用二抗列于 表 1 和 材料表 中。
  4. 进行偶联反应。
    1. 对于二抗，将染料溶液以 15 倍摩尔过量的比例缓慢加入玻璃小瓶中的抗体溶液中，同时搅拌。例如，在 0.5 mL 浓度为 2 mg/mL 的抗体溶液中，加入 35 µL 的 3 mM 染料溶液。
    2. 室温（RT）下搅拌孵育反应混合物 1 小时，反应过程需避光。
  5. 纯化。
    1. 按照步骤 1.5.2–1.5.4，在 PBS 缓冲液中配制凝胶过滤树脂（材料表）的悬浮液。
    2. 在 50 mL 离心管中，将 10 mL 凝胶过滤树脂粉末加入 40 mL PBS 缓冲液中。
    3. 将溶液置于 90 °C 水浴中保温 1 小时。
    4. 倾去上清液，重新加入 PBS 至 40 mL。将悬浮液于 4 °C 保存。
    5. 用上述悬浮液装填尺寸排阻层析柱（直径 1 cm，重力流层析柱），装填高度为 10–15 cm。
    6. 用约 10 mL PBS 缓冲液冲洗并洗涤层析柱，进一步压实树脂。
    7. 将偶联反应混合物（约 0.5 mL）用移液器加至层析柱上。待全部样品加载后，立即加入 1 mL PBS 缓冲液作为洗脱液。持续补充洗脱液（PBS）至层析柱中。
    8. 通过观察层析柱上颜色（MARS 染料呈浅绿色至蓝色）或测定 280 nm 处的吸光度（A280），收集偶联产物的洗脱液。
  6. 使用离心过滤器将收集的溶液浓缩至 1–2 mg/mL。
  7. 使用 Nano 微孔板读板仪测定偶联产物溶液的紫外-可见（UV-Vis）吸收光谱，以确定其浓度和平均标记度（DOL，染料与蛋白的摩尔比）。
    ​注意：补充材料 提供了用于计算的 MARS 染料 NHS 酯的性质参数。二抗的典型 DOL 约为 3。

2. 组织样本制备

  1. 多聚甲醛固定的 小鼠脑组织。
    1. 使用异氟烷麻醉小鼠（C57BL/6J，雌性，出生后25天）。通过脚趾夹捏试验评估麻醉是否充分。
    2. 通过颈椎脱位处死小鼠。立即经心脏灌注4%多聚甲醛（PFA）磷酸盐缓冲液（PBS）。
    3. 收集小鼠脑组织，参照步骤2.1.4–2.1.5进行操作。
    4. 从脑干开始沿矢状缝向上剪开颅骨，将颅骨两侧掀开，用镊子取出脑组织。
    5. 将收集的脑组织在4% PFA PBS溶液中4 °C固定24小时。随后在4 °C PBS缓冲液中洗涤24小时以去除多余的PFA。
    6. 将固体琼脂糖加入水中，配制成终浓度为7%（w/v）的溶液，置于烧杯中并盖上松动的盖子。用玻璃搅拌棒搅拌溶液，并在微波炉中加热至溶液澄清。
    7. 让琼脂糖冷却至45–55 °C。
    8. 将液态琼脂糖倒入小模具中，然后将脑组织从PBS转移至液态琼脂糖中，用刮勺调整其方向以完成包埋。等待组织-琼脂糖块完全凝固。
    9. 使用振动切片机将组织-琼脂糖块切成40 µm厚的冠状切片。
    10. 将切片转移至4孔板中用于后续染色。用镊子去除琼脂糖，并用1 mL PBS洗涤组织三次。
  2. 固定并冷冻的小鼠胰腺组织。
    1. 将小鼠胰腺组织在4% PFA PBS溶液中4 °C条件下振荡固定16–20小时。
    2. 用1 mL PBS（4 °C）洗涤样本三次，以去除PFA。
    3. 将样本（大小约0.3–0.5 cm）包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中。在塑料冷冻模具中加入两滴OCT，将组织置于正确方向后，继续加入OCT直至完全覆盖组织，无暴露部分。
    4. 将胰腺组织切成8 µm厚的切片，并将其固定在组织粘附载玻片上，于-80 °C保存。
    5. 染色前将样本平衡至室温。用PBS洗涤组织以去除OCT包埋剂。
  3. 石蜡包埋组织样本（FFPE）。
    1. 将FFPE组织切片在60 °C烘箱中烘烤10分钟。
    2. 脱蜡和复水：将样本依次置于50 mL离心管中的以下溶液中，室温下轻度振荡，每次3分钟：
      二甲苯两次，
      乙醇两次，
      95% （vol/vol）乙醇水溶液两次，
      70% （vol/vol）乙醇水溶液两次，
      50% （vol/vol）乙醇水溶液一次，
      去离子水一次。
    3. 将样本转移至玻璃瓶中的20 mM柠檬酸钠溶液（pH 8.0），于100 °C加热。确保组织完全浸没于溶液中。
    4. 将玻璃瓶置于60 °C水浴中孵育45分钟。
    5. 用去离子水在室温下洗涤样本5分钟。

3. 组织免疫-表面增强拉曼散射染色

  1. 使用疏水性笔在载玻片上的组织切片周围画出边界。
    注意：后续孵育步骤中，载玻片上的组织使用切片染色缸进行处理。漂浮组织（40 µm 厚的小鼠脑切片）则在孔板中染色。
  2. 将组织与 0.3–0.5% PBST（PBS 中含 Triton X-100）在室温下孵育 10 分钟。
  3. 将组织与封闭缓冲液（PBS 中含 5% 驴血清和 0.5% Triton X-100）在室温下孵育 30 分钟。
  4. 配制一抗染色液：将所有一抗按所需浓度加入 200–500 µL 染色缓冲液（PBS 中含 2% 驴血清和 0.5% Triton X-100）中。将一抗染色液在 13,000 × g 离心 5 分钟。若出现沉淀，则仅使用上清液。
  5. 将组织在 4 °C 下与一抗溶液孵育 1–2 天。
    注意：对载玻片上的组织切片染色时，应将样本置于染色盒中，并放入湿巾以维持湿度。
  6. 用 0.3–0.5% PBST 在室温下洗涤载玻片三次，每次 5 分钟。漂浮组织使用 1 mL PBST 进行洗涤。对于载玻片上的组织，应在切片染色缸中洗涤，并确保所有组织完全浸入溶液中。
  7. 将组织在 200–500 µL 封闭缓冲液中孵育 30 分钟。
  8. 配制二抗染色液：将所有二抗（如需要，还包括凝集素）按所需浓度加入 200–500 µL 染色缓冲液中（通常为 10 µg/mL）。将二抗染色液在 13,000 × g 离心 5 分钟。若出现沉淀，则仅使用上清液。
  9. 将组织在 200–500 µL 二抗溶液中于 4 °C 孵育 1–2 天。
  10. 用 0.3–0.5% PBST 在室温下洗涤载玻片两次，每次 5 分钟。
  11. 加入 200–500 µL DAPI 溶液，孵育 30 分钟。
  12. 用 PBS 在室温下洗涤载玻片三次，每次 5 分钟。
  13. 对于漂浮的组织切片，使用玻璃移液管将其转移至玻璃载玻片上。用组织刷将组织铺展，必要时用擦拭纸清洁周围区域。
  14. 在抗荧光淬灭试剂中滴加一滴，覆盖盖玻片，并用指甲油封固。

4. SRS 显微镜组装

注意：在串联SRS-荧光成像中使用商用共聚焦荧光系统。更多描述可参见先前的报告17。本方案将重点介绍使用窄带激发的SRS成像部分。

  1. 在具有温度控制的房间内准备一个隔振光学平台。
  2. 将一套同步双激光系统（泵浦光和斯托克斯光）放置在光学平台上（图2A），并连接冷却器。
    注意：该双激光系统的基频激光器输出脉冲序列，波长为1064 nm，脉宽为6 ps，重复频率为80 MHz。斯托克斯光束来自该基频激光器，其强度通过内置的电光幅度调制器（EOM）以8 MHz正弦方式调制，调制深度超过90%。基频激光器的另一部分被倍频至532 nm，用于同步泵浦一个皮秒光学参量振荡器（OPO），产生脉宽为5–6 ps的锁模脉冲序列（OPO的闲频光束通过干涉滤光片被阻断）。OPO的输出波长可在720–950 nm范围内调节，作为泵浦光束。
  3. 将反射镜（波长范围：750–1100 nm）、二向色分束镜（DBS，980 nm长通滤光片，矩形）和透镜（消色差，650–1050 nm增透镀膜）安装至各自的镜架上。反射镜和二向色分束镜应使用高度稳定的运动学镜架。
  4. 测量激光输出高度以及泵浦光和斯托克斯光束的光斑尺寸。调节反射镜和透镜的高度，确保光束照射到所有光学元件的中心位置。
  5. 将反射镜M1放置在光学平台上，使其与激光输出方向成约45°角（图2B）。利用运动学镜架上的调节旋钮进行俯仰和倾斜调整，确保光束沿平台长度方向保持相同高度并沿直线传播。
  6. 放置并调整二向色分束镜（980 nm长通滤光片）和反射镜，以分离泵浦光和斯托克斯光束（图2A-B）。
  7. 在每条光路中放置并调整透镜对（L1、L2 和 L3、L4），以准直光束并将光束直径扩展至与物镜后瞳相匹配（图2A-B）。
  8. 使用M7和M8反射镜将合并后的激光束导入显微镜（图2C）。先将一束光对准显微镜，再利用另一束光的反射镜对，确保两束光在空间上完全重叠。
  9. 搭建检测部分。
    1. 安装一个镀有红外涂层的油浸聚光镜（1.4 NA），用于收集穿过样品后的前向传播的泵浦光和斯托克斯光束（图2C）。
    2. 将大面积硅光电二极管安装至带BNC接头的屏蔽盒内（图2E）。为安装好的光电二极管提供64 V直流电源，以提高其饱和阈值和响应带宽。
    3. 使用一个2英寸反射镜将前向传播的光束反射，并在经过光学滤光片（用于阻断调制的斯托克斯光束）后重新聚焦到光电二极管上（图2D）。
    4. 将光电二极管的输出电流送入一个以50 Ω终端匹配的高速锁相放大器进行信号解调。同时将8 MHz触发信号作为参考信号输入锁相放大器。
    5. 将锁相放大器的同相X分量输出送入显微镜的模拟接口盒。
  10. 通过在显微镜下测量纯D2O液体的SRS信号，利用内置的电动延迟台优化两束激光的时间重叠。

5. 图像采集与分析

  1. 通过顺序调节泵浦波长进行多通道 epr-SRS 成像。
    1. 在激光控制面板上将激光功率设置为 Ppump = 10–40 mW 和 PStokes = 40–80 mW。
    2. 将像素驻留时间设为 2–4 µs，并在显微镜软件中使用多帧平均，通常为 10–20 帧。
      注意：应避免高激光功率（Ppump> 40 mW，PStokes> 80 mW）与小像素尺寸（<0.2 µm）的组合使用，这可能因多光子激发导致拉曼染料出现“漂白效应”。
    3. 将锁相放大器的时间常数设置为像素驻留时间的一半。
  2. 线性光谱解混。
    注意：epr-SRS 在整个浓度范围内具有严格的信号与浓度线性依赖关系；因此，线性光谱解混可有效消除通道间的潜在串扰。对于使用 N 种 MARS 探针的 N 通道 epr-SRS 测量，测得的信号（S）可表示为 S = MC，其中 C 为 MARS 探针的浓度，M 为由 MARS 探针拉曼截面决定的 N × N 矩阵。
    1. 在用不同 MARS 探针标记的单色免疫 epr-SRS 样本上测量矩阵 M。
    2. 利用公式 C = M−1·S，根据多路复用样本信号测量值 S 确定 MARS 探针的浓度矩阵。

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结果

图3展示了epr-SRS在不同样本中的示例图像，包括固定细胞（图3A）、多聚甲醛（PFA）固定的鼠类组织（图3B）以及福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的人体标本（图3C）。SRS显微镜的空间分辨率受衍射极限限制，使用近红外光激发时，典型的横向分辨率为~300 nm，轴向分辨率为1–2 µm。因此，通过α-微管蛋白的免疫-eprSRS成像，可真实呈现HeLa细胞中微管等精细的亚细胞结构（图3A）。此外，epr-SRS通常适用于FFPE组织（图3C），而FFPE组织是临床诊断和病理学研究中常见的活检标本形式。与双光子荧光显微镜类似，作为一种非线性过程，epr-SRS具备光学切片能力，可实现具有亚细胞分辨率的三维结构成像（图3D–...

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讨论

本文介绍了免疫-电子顺磁共振SRS（immuno-eprSRS）技术方案，该方法广泛适用于多种常见组织类型，包括新鲜保存的小鼠组织、福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的人体组织以及冷冻小鼠组织。该技术已在细胞和组织中针对一系列抗原表位进行了验证，具体如表1所列。这一单次检测平台特别适用于循环标记策略难以有效实施的应用场景。例如，在厚组织中进行循环荧光标记具有较高挑战性，因为多轮三维免疫标记过程在实际操作中耗时过长且难以实现17。此外，由于非线性的三维组织学形变，循环方法还极易引入图像配准误差11,17。免疫-epRSRS技术克服了此类情况下循环荧光方法的实际障碍，为在大体积样本中揭示蛋白质相互作用网络提供了新的可能17。

目前多重检测的主要限制因素是二抗的可用性。尽管本实验方案主要关注间接免疫标记（即MARS探针与二抗偶联），但直接免疫标记...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Ruth A. Singer 和 Richard K.P. Benninger 提供小鼠胰腺组织。W.M. 感谢美国国立卫生研究院（NIH）R01（GM128214）、R01（GM132860）、R01（EB029523）以及美国陆军（W911NF-19-1-0214）提供的资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
16% 甲醛，电镜级电子显微镜科学公司15710
α-tubulinAbcamab18251一抗
α-tubulinBioLegend625902一抗
β-III-微管蛋白BioLegend657402一抗
β-III-微管蛋白Abcamab41489一抗
β-tubulinAbcamab131205一抗
低熔点琼脂糖Sigma AldrichA9414用于脑组织包埋
兔源抗α-微管蛋白抗体（α-微管蛋白)Abcamab52866一抗
小鼠抗钙结合蛋白抗体（Calbindin）Abcamab82812一抗
抗GABA B受体R2  豚鼠来源的抗体（GABA B 受体 R2）默克生命科学AB2255一抗
山羊抗GFAP抗体（GFAP）赛默飞世尔科技PA5-18598一抗
抗胰高血糖素  小鼠产生的抗体（胰高血糖素）Santa Cruz Biotechnologysc-514592一抗
由豚鼠产生的抗胰岛素抗体（insulin）DAKOIR00261-2一抗
大鼠源抗MBP抗体（MBP）Abcamab7349一抗
兔源抗 NeuN 抗体（NeuN）赛默飞世尔科技PA5-78639一抗
抗胰多肽（PP）山羊源抗体 - 胰多肽（PP）Sigma AldrichSAB2500747一抗
兔源抗 Pdx1 抗体（Pdx1）Millipore06-1379一抗
抗生长抑素抗体（大鼠来源）（生长抑素）Abcamab30788一抗
鸡源抗波形蛋白抗体（Vimentin）Abcamab24525一抗
带通滤光片KR ElectronicsKR27248 MHz
BNC 50 欧姆终端电阻器Mini CircuitsSTRM-50
BNC 电缆Thorlabs2249-C同轴电缆，BNC公对公
宽带介电镜ThorlabsBB1-E03750 - 1100 nm
C57BL/6J 小鼠杰克逊实验室000664
离心
聚光镜Olympus油镜，1.4 数值孔径
细胞角蛋白18Abcamab7797一抗
细胞角蛋白18Abcamab24561一抗
直流电源TopWard6302D偏置电压为 64 V
二向色镜支架ThorlabsKM100CL适用于最大1.3的运动学支架" （33 毫米）高矩形光学元件，左手型
驴抗鸡IgY（H+L）杰克逊免疫研究实验室703-005-155用于MARS偶联的二抗
驴抗山羊IgG（H+L）Jackson ImmunoResearch705-005-147用于MARS偶联的二抗
驴抗豚鼠IgG（H+L）Jackson ImmunoResearch706-005-148用于MARS偶联的二抗
驴抗小鼠IgG（H+L）杰克逊免疫研究实验室715-005-151用于MARS偶联的二抗
驴抗兔IgG（H+L）杰克逊免疫研究实验室711-005-152用于MARS偶联的二抗
驴抗大鼠IgG（H+L）Jackson ImmunoResearch712-005-153用于MARS偶联的二抗
驴抗羊IgG（H+L）杰克逊免疫研究实验室713-005-147用于MARS偶联的二抗
DPBSFisher Scientific14-190-250
EpCAMAbcamab71916一抗
乙醇Sigma Aldrich443611
高速采样放大器苏黎世仪器HF2LIDC - 50 MHz
FFPE 肾脏样本USBiomaxHuFPT072
纤维蛋白原Abcamab5821一抗
GiantinAbcamab24586一抗
胰高血糖素Santa Cruz Biotechnologysc-514592一抗
H2BAbcamab1790一抗
HeLaATCCATCC CCL-2
高光密度带通滤光片Chroma TechnologyET890/220m过滤斯托克斯光束并透射泵浦光束
疏水笔Fisher ScientificNC1384846
胰岛素赛默飞世尔科技701265一抗
集成SRS激光系统应用物理学 &安培电子有限公司picoEMERALDpicoEMERALD 在 1,064 nm 处提供脉宽为 6 ps、重复频率为 80 MHz 的输出脉冲序列，用作斯托克斯光束。532 nm 的倍频光用于同步泵浦一台皮秒光学参量振荡器（OPO），以产生脉宽为五至六皮秒的锁模脉冲序列（OPO 的闲频光通过干涉滤光片被阻断）。OPO 的输出波长可在 720 范围内调谐–950 nm，作为泵浦光束。1,064 nm的斯托克斯光束由picoEMERALD内置的电光调制器（EOM）以8 MHz频率进行正弦调制，调制深度超过90%。泵浦光束与斯托克斯光束通过picoEMERALD内部的二向色镜实现空间重叠。泵浦脉冲与斯托克斯脉冲之间的时间重叠通过内置延迟装置实现，并利用显微镜下纯D2O的受激拉曼散射（SRS）信号进行优化。
倒置激光扫描显微镜OlympusFV1200MPE
运动学镜架ThorlabsPOLARIS-K1-2AH2 个低剖面六角调节器
普通小麦（小麦）凝集素Sigma AldrichL0636-5 mg
长通二向色分光镜SemrockDi02-R980-25x36980 nm 激光 BrightLine 单刃激光平面二向色分光镜
MAP2BioLegend801810一抗
显微成像软件OlympusFluoView
NanoQuant板Tecan用于酶标仪上的基于吸光度的小体积分析。
正常驴血清杰克逊免疫研究实验室017-000-121
NucBlue 固定细胞即用型探针试剂（DAPI）赛默飞世尔科技R37606
Nunc 4孔培养皿Fisher Scientific12-566-300
物镜OlympusXLPlan N×25，1.05 数值孔径，MP，工作距离 = 2 毫米
画笔
潜望镜组件ThorlabsRS99包括上部和下部组件， Ø1" 后部及夹持叉。
pH计
酶标仪TecanInfinite 200 PRO一款易于使用的多功能酶标仪。可在230 nm的光谱范围内进行吸光度检测。–1000 nm
ProLong Gold 抗荧光淬灭试剂赛默飞世尔科技P36930
PSD95Invitrogen51-6900一抗
Sephadex G-25 MediumGE Life Sciences17-0033-01用于脱盐和缓冲液置换的凝胶过滤树脂
带BNC接头的屏蔽箱Pomona Electronics2902带盖铝盒，BNC 母/母
硅光电二极管ThorlabsFDS1010350–1100 纳米，10 毫米 × 10 毫米有效面积
突触素2赛默飞世尔科技OSS00073G一抗
组织病理学 Superfrost Plus Gold 载玻片Fisher Scientific22-035813黏附载玻片，用于吸引并化学结合新鲜或福尔马林固定的组织切片，使其牢固附着于载玻片表面（组织黏附玻璃载玻片）
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
振动切片机LeicaVT1000
波形蛋白Abcamab8069一抗
二甲苯Sigma Aldrich214736

参考文献

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