基于电子预共振受激拉曼散射（epr-SRS）的彩虹样拉曼染料成像，是一种用于高重数基于表位的蛋白质成像的新平台。本文中，我们提供了一份实用指南，包括抗体准备、组织样本染色、SRS显微镜组装以及epr-SRS组织成像。
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本文内容
摘要
摘要
在组织中可视化大量特定生物标志物对于探索复杂生物系统的精细结构具有重要作用。因此，高通量成像技术日益受到重视。本文介绍一种新兴的高通量振动成像平台，该平台通过电子预共振受激拉曼散射（epr-SRS）成像技术，利用彩虹样拉曼染料实现对特定蛋白质的检测，其灵敏度可与标准免疫荧光技术相媲美。该方法突破了传统免疫荧光技术中光谱可分辨通道数量的限制，提供了一种单次光学成像即可在亚细胞分辨率下检测组织中多种标志物的方法。该技术普遍适用于标准组织样本制备方式，包括多聚甲醛固定的组织、冷冻组织以及福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的人体组织。我们预期该平台将为生物样本中的蛋白质相互作用提供更全面的图景，尤其适用于较厚的完整组织。本实验方案涵盖了从抗体制备、组织样本染色、SRS显微镜组装到epr-SRS组织成像的完整工作流程。
引言
复杂的组织系统由不同的细胞亚群组成，其空间位置和相互作用网络与其功能和功能障碍密切相关1,2。为了揭示组织结构并解析其复杂性，必须掌握单细胞分辨率下蛋白质的空间定位信息。因此，高通量多重蛋白质成像技术日益受到重视，有望成为研究组织生物学的核心工具3,4,5。目前常见的多重蛋白质成像方法可分为两大类：一类是依赖多轮组织染色与成像的连续免疫荧光成像，另一类是结合重金属标记抗体的成像质谱流式技术6,7,8,9,10,11,12。
本文介绍了一种基于抗体的多重蛋白质成像替代策略。与主流的荧光成像方式不同，拉曼显微镜具有更窄的....
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方案
该实验方案遵循哥伦比亚大学机构动物护理和使用委员会批准的动物实验方案（AC-AABD1552）进行。
1. 拉曼染料偶联抗体的制备
- 配制偶联缓冲液：在 PBS 缓冲液中加入约 0.1 M 的 NaHCO3，调节 pH 至 8.3，4 °C 保存。
- 将 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯功能化的 MARS 探针（补充材料）配制成 3 mM 的无水 DMSO 溶液。MARS 探针的合成方法可参考先前的文献报道13,17,18。
注意：为便于储存，染料 NHS 酯溶液必须避光保存，并置于 -20 °C。 - 将抗体固体溶解于偶联缓冲液中，使其浓度达到 2 mg/mL。对于溶解在其他缓冲液中的抗体，使用离心过滤器将其置换至偶联缓冲液中，浓度调整为 1–2 mg/mL。
注意：为减少交叉反应性，多重染色应优先选用高度交叉吸附的二抗。所用二抗列于 表 1 和 材料表 中。 - 进行偶联反应。
- 对于二抗，将染料溶液以 15 倍摩....
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结果
图3展示了epr-SRS在不同样本中的示例图像，包括固定细胞（图3A）、多聚甲醛（PFA）固定的鼠类组织（图3B）以及福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的人体标本（图3C）。SRS显微镜的空间分辨率受衍射极限限制，使用近红外光激发时，典型的横向分辨率为~300 nm，轴向分辨率为1–2 µm。因此，通过α-微管蛋白的免疫-eprSRS成像，可真实呈现HeLa细胞中微管等精细的亚细胞结构（图3A）。此外，epr-SRS通常适用于FFPE组织（图3C），而FFPE组织是临床诊断和病理学研究中常见的活检标本形式。与双光子荧光显微镜类似，作为一种非线性过程，epr-SRS具备光学切片能力，可实现具有亚细胞分辨率的三维结构成像（图3D–.......
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讨论
本文介绍了免疫-电子顺磁共振SRS（immuno-eprSRS）技术方案，该方法广泛适用于多种常见组织类型，包括新鲜保存的小鼠组织、福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的人体组织以及冷冻小鼠组织。该技术已在细胞和组织中针对一系列抗原表位进行了验证，具体如表1所列。这一单次检测平台特别适用于循环标记策略难以有效实施的应用场景。例如，在厚组织中进行循环荧光标记具有较高挑战性，因为多轮三维免疫标记过程在实际操作中耗时过长且难以实现17。此外，由于非线性的三维组织学形变，循环方法还极易引入图像配准误差11,17。免疫-epRSRS技术克服了此类情况下循环荧光方法的实际障碍，为在大体积样本中揭示蛋白质相互作用网络提供了新的可能17。
目前多重检测的主要限制因素是二抗的可用性。尽管本实验方案主要关注间接免疫标记（即MARS探针与二抗偶联），但直接免疫标记.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Ruth A. Singer 和 Richard K.P. Benninger 提供小鼠胰腺组织。W.M. 感谢美国国立卫生研究院（NIH）R01（GM128214）、R01（GM132860）、R01（EB029523）以及美国陆军（W911NF-19-1-0214）提供的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 16% 甲醛，电镜级 | 电子显微镜科学公司 | 15710 | |
| α-tubulin | Abcam | ab18251 | 一抗 |
| α-tubulin | BioLegend | 625902 | 一抗 |
| β-III-微管蛋白 | BioLegend | 657402 | 一抗 |
| β-III-微管蛋白 | Abcam | ab41489 | 一抗 |
| β-tubulin | Abcam | ab131205 | 一抗 |
| 低熔点琼脂糖 | Sigma Aldrich | A9414 | 用于脑组织包埋 |
| 兔源抗α-微管蛋白抗体（α-微管蛋白) | Abcam | ab52866 | 一抗 |
| 小鼠抗钙结合蛋白抗体（Calbindin） | Abcam | ab82812 | 一抗 |
| 抗GABA B受体R2 豚鼠来源的抗体（GABA B 受体 R2） | 默克生命科学 | AB2255 | 一抗 |
| 山羊抗GFAP抗体（GFAP） | 赛默飞世尔科技 | PA5-18598 | 一抗 |
| 抗胰高血糖素 小鼠产生的抗体（胰高血糖素） | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | 一抗 |
| 由豚鼠产生的抗胰岛素抗体（insulin） | DAKO | IR00261-2 | 一抗 |
| 大鼠源抗MBP抗体（MBP） | Abcam | ab7349 | 一抗 |
| 兔源抗 NeuN 抗体（NeuN） | 赛默飞世尔科技 | PA5-78639 | 一抗 |
| 抗胰多肽（PP）山羊源抗体 - 胰多肽（PP） | Sigma Aldrich | SAB2500747 | 一抗 |
| 兔源抗 Pdx1 抗体（Pdx1） | Millipore | 06-1379 | 一抗 |
| 抗生长抑素抗体（大鼠来源）（生长抑素） | Abcam | ab30788 | 一抗 |
| 鸡源抗波形蛋白抗体（Vimentin） | Abcam | ab24525 | 一抗 |
| 带通滤光片 | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
| BNC 50 欧姆终端电阻器 | Mini Circuits | STRM-50 | |
| BNC 电缆 | Thorlabs | 2249-C | 同轴电缆，BNC公对公 |
| 宽带介电镜 | Thorlabs | BB1-E03 | 750 - 1100 nm |
| C57BL/6J 小鼠 | 杰克逊实验室 | 000664 | |
| 离心 | |||
| 聚光镜 | Olympus | 油镜，1.4 数值孔径 | |
| 细胞角蛋白18 | Abcam | ab7797 | 一抗 |
| 细胞角蛋白18 | Abcam | ab24561 | 一抗 |
| 直流电源 | TopWard | 6302D | 偏置电压为 64 V |
| 二向色镜支架 | Thorlabs | KM100CL | 适用于最大1.3的运动学支架" （33 毫米）高矩形光学元件，左手型 |
| 驴抗鸡IgY（H+L） | 杰克逊免疫研究实验室 | 703-005-155 | 用于MARS偶联的二抗 |
| 驴抗山羊IgG（H+L） | Jackson ImmunoResearch | 705-005-147 | 用于MARS偶联的二抗 |
| 驴抗豚鼠IgG（H+L） | Jackson ImmunoResearch | 706-005-148 | 用于MARS偶联的二抗 |
| 驴抗小鼠IgG（H+L） | 杰克逊免疫研究实验室 | 715-005-151 | 用于MARS偶联的二抗 |
| 驴抗兔IgG（H+L） | 杰克逊免疫研究实验室 | 711-005-152 | 用于MARS偶联的二抗 |
| 驴抗大鼠IgG（H+L） | Jackson ImmunoResearch | 712-005-153 | 用于MARS偶联的二抗 |
| 驴抗羊IgG（H+L） | 杰克逊免疫研究实验室 | 713-005-147 | 用于MARS偶联的二抗 |
| DPBS | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
| EpCAM | Abcam | ab71916 | 一抗 |
| 乙醇 | Sigma Aldrich | 443611 | |
| 高速采样放大器 | 苏黎世仪器 | HF2LI | DC - 50 MHz |
| FFPE 肾脏样本 | USBiomax | HuFPT072 | |
| 纤维蛋白原 | Abcam | ab5821 | 一抗 |
| Giantin | Abcam | ab24586 | 一抗 |
| 胰高血糖素 | Santa Cruz Biotechnology | sc-514592 | 一抗 |
| H2B | Abcam | ab1790 | 一抗 |
| HeLa | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| 高光密度带通滤光片 | Chroma Technology | ET890/220m | 过滤斯托克斯光束并透射泵浦光束 |
| 疏水笔 | Fisher Scientific | NC1384846 | |
| 胰岛素 | 赛默飞世尔科技 | 701265 | 一抗 |
| 集成SRS激光系统 | 应用物理学 &安培电子有限公司 | picoEMERALD | picoEMERALD 在 1,064 nm 处提供脉宽为 6 ps、重复频率为 80 MHz 的输出脉冲序列，用作斯托克斯光束。532 nm 的倍频光用于同步泵浦一台皮秒光学参量振荡器（OPO），以产生脉宽为五至六皮秒的锁模脉冲序列（OPO 的闲频光通过干涉滤光片被阻断）。OPO 的输出波长可在 720 范围内调谐–950 nm，作为泵浦光束。1,064 nm的斯托克斯光束由picoEMERALD内置的电光调制器（EOM）以8 MHz频率进行正弦调制，调制深度超过90%。泵浦光束与斯托克斯光束通过picoEMERALD内部的二向色镜实现空间重叠。泵浦脉冲与斯托克斯脉冲之间的时间重叠通过内置延迟装置实现，并利用显微镜下纯D2O的受激拉曼散射（SRS）信号进行优化。 |
| 倒置激光扫描显微镜 | Olympus | FV1200MPE | |
| 运动学镜架 | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 个低剖面六角调节器 |
| 普通小麦（小麦）凝集素 | Sigma Aldrich | L0636-5 mg | |
| 长通二向色分光镜 | Semrock | Di02-R980-25x36 | 980 nm 激光 BrightLine 单刃激光平面二向色分光镜 |
| MAP2 | BioLegend | 801810 | 一抗 |
| 显微成像软件 | Olympus | FluoView | |
| NanoQuant板 | Tecan | 用于酶标仪上的基于吸光度的小体积分析。 | |
| 正常驴血清 | 杰克逊免疫研究实验室 | 017-000-121 | |
| NucBlue 固定细胞即用型探针试剂（DAPI） | 赛默飞世尔科技 | R37606 | |
| Nunc 4孔培养皿 | Fisher Scientific | 12-566-300 | |
| 物镜 | Olympus | XLPlan N | ×25，1.05 数值孔径，MP，工作距离 = 2 毫米 |
| 画笔 | |||
| 潜望镜组件 | Thorlabs | RS99 | 包括上部和下部组件， Ø1" 后部及夹持叉。 |
| pH计 | |||
| 酶标仪 | Tecan | Infinite 200 PRO | 一款易于使用的多功能酶标仪。可在230 nm的光谱范围内进行吸光度检测。–1000 nm |
| ProLong Gold 抗荧光淬灭试剂 | 赛默飞世尔科技 | P36930 | |
| PSD95 | Invitrogen | 51-6900 | 一抗 |
| Sephadex G-25 Medium | GE Life Sciences | 17-0033-01 | 用于脱盐和缓冲液置换的凝胶过滤树脂 |
| 带BNC接头的屏蔽箱 | Pomona Electronics | 2902 | 带盖铝盒，BNC 母/母 |
| 硅光电二极管 | Thorlabs | FDS1010 | 350–1100 纳米，10 毫米 × 10 毫米有效面积 |
| 突触素2 | 赛默飞世尔科技 | OSS00073G | 一抗 |
| 组织病理学 Superfrost Plus Gold 载玻片 | Fisher Scientific | 22-035813 | 黏附载玻片，用于吸引并化学结合新鲜或福尔马林固定的组织切片，使其牢固附着于载玻片表面（组织黏附玻璃载玻片） |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| 振动切片机 | Leica | VT1000 | |
| 波形蛋白 | Abcam | ab8069 | 一抗 |
| 二甲苯 | Sigma Aldrich | 214736 |
参考文献
- Goltsev, Y., et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
- Taube, J. M., et al.
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