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方法文章

哺乳动物细胞裂解物中E3泛素连接酶介导底物泛素化修饰的评估

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DOI：

10.3791/63561

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2022年5月10日

 ,  ,  , 
1Department of Genetic and Evolution, Federal University of São Carlos, 2Department of Biochemistry and Immunology, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们提供了一种在哺乳动物细胞中针对特定底物和E3泛素连接酶的泛素化检测的详细实验方案。采用HEK293T细胞系进行蛋白过表达，通过免疫沉淀法从细胞裂解液中纯化多泛素化修饰的底物蛋白，并利用SDS-PAGE进行分离。通过免疫印迹技术检测该翻译后修饰。

摘要

泛素化是一种发生在真核细胞中的翻译后修饰，对多种生物学通路的调控至关重要，包括细胞存活、增殖和分化。该过程是可逆的，通过至少三种不同酶（E1（泛素激活酶）、E2（泛素结合酶）和E3（泛素连接酶））参与的级联反应，将泛素共价连接到底物蛋白上。其中E3复合物在底物识别和泛素化过程中发挥重要作用。本文描述了一种在哺乳动物细胞中评估底物泛素化水平的实验方案，通过瞬时共转染编码目标底物、E3泛素连接酶以及带标签泛素的质粒来实现。在细胞裂解前，用蛋白酶体抑制剂MG132（羧基苄氧基-亮氨酸-亮氨酸-亮氨酸醛）处理转染后的细胞，以防止底物经蛋白酶体降解。随后，对细胞裂解物进行小规模免疫沉淀（IP），以富集多泛素化底物，并利用针对泛素标签的特异性抗体通过蛋白质印迹（WB）进行检测。因此，本文提供了一种稳定且简便的哺乳动物细胞泛素化检测方法，有助于科研人员研究特定底物蛋白和E3泛素连接酶的泛素化过程。

引言

翻译后修饰（PTMs）是蛋白质调控的重要机制，对细胞稳态至关重要。蛋白质泛素化是一种动态且复杂的修饰过程，可在真核生物中产生多种不同的信号，导致多种细胞效应。泛素化是一个可逆过程，其特征是将含有76个氨基酸的泛素蛋白共价连接到底物蛋白上，该过程通过由三种不同反应组成的酶级联反应实现1。第一步是泛素的活化，依赖ATP水解，在泛素C末端与E1酶活性位点半胱氨酸残基之间形成高能硫酯键连接的泛素。随后，泛素被转移至E2酶，形成泛素与E2酶之间的硫酯键复合物。接着，泛素由E2酶或更常见的E3酶共价连接到底物蛋白上，其中E3酶负责识别并与底物相互作用2,3。在某些情况下，还需要E4酶（泛素链延伸因子）来促进多泛素链的组装3。

泛素含有七个赖氨酸残基（K6、K11、K27、K29、K33、K48 和 K63），可形成具有不同连接方式的多聚泛素链，从而产生不同的三维结构，这些结构可被多种效应蛋白识别4,5。因此，底物上形成的多聚泛素链类型对其细胞命运的决定至关重要6,7,8。此外，底物还可通过其N端残基（称为N-降解决定子）发生泛素化。特定的E3泛素连接酶负责识别N-降解决定子，从而介导邻近赖氨酸残基的多聚泛素化9。

目前，已有超过40种不同的SCF特异性底物被鉴定。其中包含多个生物学通路的关键调控因子，这些通路涉及细胞分化与发育，以及细胞存活与死亡10,11,12,13。因此，鉴定每种E3泛素连接酶的特异性底物对于构建各种生物学事件的完整图谱至关重要。尽管鉴定真实底物在生物化学上具有挑战性，但基于生物化学的方法非常适合评估泛素链的特异性以及单泛素化与多泛素化的区别14。本研究描述了一项完整的泛素化检测实验方案，使用过表达底物UXT-V2（普遍表达的类prefoldin分子伴侣异构体2）和E3泛素连接酶复合物SCF(Fbxo7)的哺乳动物细胞系HEK293T。UXT-V2是NF-κB信号通路的重要辅助因子，当该蛋白在细胞中被敲低后，会抑制TNF-α诱导的NF-κB激活11。因此，为了检测多泛素化的UXT-V2，实验中使用蛋白酶体抑制剂MG132，因其能够阻断蛋白酶体复合物26S亚基的蛋白水解活性15。此外，细胞裂解物经过小规模免疫沉淀（IP）以纯化底物，利用固定在琼脂糖树脂上的特异性抗体，随后通过选定的抗体进行蛋白质印迹（WB）检测。该方案对于在细胞环境中验证底物的泛素化非常有用，也可根据需要调整用于其他类型的哺乳动物细胞及其他E3泛素连接酶复合物。然而，还需通过体外（in vitro）泛素化实验对所测试的底物进行验证，因为这两种方案在鉴定真实底物方面互为补充。

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方案

注意：哺乳动物细胞中泛素化实验方案的概述如图所示。 图1.

蛋白质纯化流程图；转染设置、细胞培养、SDS-PAGE、免疫印迹。
图 1. 泛素化检测实验流程概览。请点击此处查看此图的放大版本。

1. 细胞培养

  1. 在100 mm经TC处理的培养皿中，使用生长培养基（高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），添加10%胎牛血清（FBS）以及青霉素（100单位）、链霉素（100 µg）和L-谷氨酰胺（0.292 mg/mL）），将HEK293T细胞系培养至80%–90%汇合度。将培养物置于37 °C、5% CO2的湿化细胞培养箱中孵育。
  2. 传代细胞时，使用移液管吸取培养皿中的培养基。用1 mL无菌的1×磷酸盐缓冲液（PBS 1×）清洗细胞一次。
  3. 加入1 mL胰蛋白酶/EDTA（乙二胺四乙酸）溶液使细胞脱离。将培养皿在37 °C孵育5分钟。使用移液管在2 mL生长培养基中重悬细胞。
  4. 将细胞悬液转移至新的15 mL离心管中，在室温（RT）下以500 × g离心5分钟。小心倾倒去除上清液。通过上下吹打，用3 mL生长培养基轻柔重悬细胞沉淀，获得均匀的细胞悬液。
  5. 取1 mL细胞悬液转移至含有9 mL生长培养基的100 mm经TC处理的培养皿中。
    注：若细胞状态良好，每个汇合度为80%–90%的HEK293T培养皿在传代后2天可扩增为三个汇合度达80%的培养皿。

2. 细胞转染

注意：如果细胞融合度低于80%，不建议进行细胞转染。

  1. 转染前，确认细胞无污染且处于适合瞬时转染的汇合度。
  2. 针对每个转染样本，按以下步骤制备DNA-聚乙烯亚胺（PEI，1 µg/µL，pH 7.2）复合物：
    1. 将每种质粒各3 µg溶于100 µL未添加补充物的Opti-MEM I低血清培养基中，通过上下吹打轻轻混匀。
      注意：本实验中，细胞转染每种质粒4 µg：空载体（pcDNA3）或FLAG-Fbxo7构建体，以及UXT-V2-HA，同时转染或不转染6xHis-myc-泛素。总DNA量为12 µg。
    2. 将PEI在室温下解冻，按每1 µg DNA加入3 µL PEI的比例加入上述溶液中，通过上下吹打混匀。室温孵育15分钟，以形成DNA-PEI复合物。
      注意：每种细胞系所需的PEI体积与DNA量的最佳比例可能不同。
  3. 将全部体积的DNA-PEI复合物加入含细胞培养物的培养皿中，轻轻前后摇动培养板以混匀。将细胞置于37 °C、5% CO2的加湿细胞培养箱中孵育。
  4. 5小时后更换培养基，因为长时间暴露于PEI可能对HEK293T细胞产生毒性。继续将细胞在37 °C、5% CO2的加湿细胞培养箱中孵育36小时。

3. 细胞裂解与免疫沉淀

  1. 孵育期结束后，在细胞裂解前6小时，用以下处理转染后的细胞： 10 µM 蛋白酶体抑制剂MG-132。再次将细胞置于培养箱中孵育 37 °C 在含5% CO₂的湿润化细胞培养箱中2.
  2. 使用移液管吸去每块培养皿中的培养基，加入 1 mL 1× PBS 洗涤一次。通过加入 1 mL 胰蛋白酶并将在培养皿中孵育以解离细胞 37 °C 孵育5分钟。用1 mL培养基重悬细胞。
  3. 将细胞悬液转移至一个新的洁净15 mL离心管中，以500 x g离心 g 室温下孵育5分钟。
  4. 小心倾倒去除上清液。轻柔地将细胞沉淀重悬于 200 µL 冰冷的NP-40裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.2，225 mM KCl，1% NP-40），添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物（10 mM NaF 和 1 mM Na3视频操作4），并将溶液转移至一支洁净的1.5 mL离心管中。
  5. 将细胞裂解液在冰上孵育 30 分钟。孵育结束后，于 16,900 x g 20 分钟 4 °C.
  6. 同时，用预冷的NP-40裂解缓冲液平衡琼脂糖-抗HA磁珠。使用 15 µL 每份样品使用琼脂糖-抗HA珠。用缓冲液洗涤珠子 200 µL NP-40裂解缓冲液，通过在微量离心管中以3,000 x g短时离心处理 g 1 分钟 4 °C用移液器小心吸取并弃去上清液，重复此操作三次。随后将磁珠置于冰上平衡，直至使用。
  7. 离心细胞裂解液后，收集上清。使用Bradford法测定总裂解液中的蛋白含量。16.
  8. 确保用于免疫沉淀的每个样品含有等量的蛋白质。将所需体积的细胞裂解液与平衡后的琼脂糖-抗HA珠子在旋转孵育仪中轻轻旋转孵育4小时，温度为 4 °C，从而使UXT-V2-HA能够结合到琼脂糖-抗HA珠上。
  9. 用微型离心机在3,000 x g下短时离心收集琼脂糖-抗HA珠子 g 1 分钟，于 4 °C小心吸除并弃去上清液。用预冷的NP-40细胞裂解缓冲液洗涤磁珠3次，再用预冷的FLAG/HA缓冲液（10 mM Hepes pH 7.9，15 mM MgCl₂，225 mM KCl，0.1% NP-40）洗涤2次。
  10. 最后一次洗涤后，用移液器小心吸除全部上清液，并使用HA肽洗脱多聚泛素化蛋白300 µg/mL) 在FLAG/HA缓冲液中稀释。将琼脂糖-抗HA珠与HA肽在4℃下孵育1小时 4 °C 在摇床平台上。
  11. 3,000 x g 离心 beads g 2 分钟 4 °C 小心吸取含有聚泛素化蛋白的上清液。如有需要，将洗脱液储存于干净的新微量离心管中，置于 -20 °C.
  12. 在10% SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）中分离洗脱液和细胞裂解物17 和免疫印迹。
  13. 本研究中进行了湿转法蛋白质印迹（WB）。对于此类转膜，将凝胶置于由滤纸-凝胶-膜-滤纸组成的转膜夹心中，加入垫片缓冲，并用支撑网压紧。将该体系垂直放入盛有转移缓冲液的转移槽中，并置于不锈钢/铂丝电极之间。在湿转缓冲液（甘氨酸 192 mM，Tris 碱 25 mM，0.025% SDS，20% 甲醇）中，150 V 恒压转移 90 分钟。
    注意：由于细胞提取物已在步骤 3.7 中完成定量，因此每个样本应加载等量蛋白质进行 SDS-PAGE 分析。此外，为充分分辨洗脱液，各样本应加载等体积。
  14. 使用选定的抗体探针检测免疫印迹膜 11确保在含有野生型E3连接酶、底物和myc-ub的样品中，通过免疫沉淀（IP）过程富集多聚泛素化底物后，使用抗myc抗体在洗脱液中检测到涂布状信号。在细胞裂解液（input）中，应检测到底物蛋白、Fbxo7蛋白、泛素化蛋白以及内参蛋白（如GAPDH和β-actin）的信号，以保证每泳道上样蛋白量一致。
    注：每种抗体的稀释比例均按照生产商说明书进行配制。

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结果

UXT（普遍表达转录本）是一种类似prefoldin的蛋白质，在小鼠和人类的心脏、脑、骨骼肌、胎盘、胰腺、肾脏及肝脏等组织中形成普遍表达的蛋白质折叠复合物18。已发现UXT存在两种剪接异构体，分别称为UXT-V1和UXT-V2，二者具有不同的功能和亚细胞定位。UXT-V1主要定位于细胞质及线粒体内部，参与TNF-α诱导的细胞凋亡以及抗病毒信号体的形成19,20。目前大多数研究集中于主要定位于细胞核的UXT-V2，其作为多种转录因子的共因子，参与调控细胞增殖、分化以及炎症通路。UXT-V2参与NF-κB信号通路，作为NF-κB增强子体（enhanceosome）中的关键共激活因子发挥作用21。已有研究证实，UXT-V2是E3泛素连接酶SCF(Fbxo7)的经典底物，可通过蛋白酶体介导其多聚泛素化和降解，从而抑制NF-κB信号通路的激活11。

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讨论

泛素化是一种重要的翻译后修饰，可调控多种蛋白质的水平，在众多信号通路和生物学过程中发挥关键作用，从而维持健康的细胞内环境。泛素-蛋白酶体系统（UPS）是近年来药物研究的主要焦点之一，为稳定肿瘤抑制因子或诱导致癌产物降解提供了可能22。例如，多发性骨髓瘤（MM）中负责单克隆免疫球蛋白分泌的浆细胞肿瘤异常增殖，会导致内质网（ER）中错误折叠和/或未折叠蛋白的积累，从而激活病理生理通路23。一旦发生内质网应激，便会激活包括泛素-蛋白酶体系统在内的多种细胞过程。使用蛋白酶体抑制剂（如硼替佐米、卡非佐米和伊沙佐米）诱导蛋白质积累并导致细胞死亡，在多发性骨髓瘤治疗中已显示出良好效果，作为抗肿瘤药物可减缓高危患者的疾病进展24,25。此外，其他针对蛋白质稳定性的研究也取得进展，例如靶向E3泛素连接酶MDM2的抑制剂，能够有效阻止p53的泛素化，从而避免其通过蛋白酶体途径被降解26。因此，一个以...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

F.R.T. 受 FAPESP 资助项目（编号 2020/15771-6）和 CNPq Universal（编号 405836/2018-0）支持。P.M.S.P. 和 V.S. 受 CAPES 资助。C.R.S.T.B.C. 受 FAPESP 奖学金（编号 2019/23466-1）支持。我们感谢 Sandra R. C. Maruyama（FAPESP 2016/20258-0）提供的材料支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 微量离心管AxygenPMI110-06A
100 mm 经组织培养处理的培养皿Corning430167
15 mL 离心管Corning430766
96 孔板Cralplast655111
琼脂糖-抗 HA 珠Sigma-AldrichE6779
抗小鼠抗体Seracare5220-0341山羊抗小鼠 IgG
抗兔抗体Seracare5220-0337山羊抗兔 IgG
抗肌动蛋白抗体Sigma-AldrichA3853使用稀释比例：1:2000
抗 Fbxo7 抗体Sigma-AldrichSAB1407251使用稀释比例：1:1000
抗 HA 抗体Sigma-AldrichH3663使用稀释比例：1:1000
抗 Myc 抗体Cell Signalling2272使用稀释比例：1:1000
考马斯亮蓝试剂Sigma-AldrichB6916-500ML
BSASigma-AldrichA9647-100G牛血清白蛋白
细胞培养箱NuaireNU-4850
离心机Eppendorf5804R500 × g 离心 5 分钟
ChemiDocBioRad
数字 pH 计KasviK39-2014B
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基Corning10-017-CRV高糖
胎牛血清GibcoF4135使用前过滤
HA 肽Sigma-AldrichI2149
HEK293T 细胞ATCCCRL-3216
HepesGibco15630080
KClVWR Life Science0365-500G
Kline 旋转仪Global Trade TechnologyGT-2OIBD
MG-132Boston BiochemI-130
微量离心机Eppendorf5418R
Na3VO4（正钒酸钠）
NaF
硝酸纤维素印迹膜GE Healthcare10600016
NP40（IGEPAL CA-630）Sigma-AldrichI8896-100ML
光学显微镜OPTIKA microscopesSN510768
Opti-MEMGibco31985-070
pcDNA3InvitrogenV79020用于哺乳动物表达
pcDNA3-2xFlag-Fbxo7 由 Marcelo Damário 博士惠赠标签：2xFlag（N 末端）。限制性内切酶：EcoRI 和 XhoI
pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-ΔF-box 由 Marcelo Damário 博士惠赠标签：2xFlag（N 末端）。限制性内切酶：EcoRI 和 XhoI。Δ335-367
pcDNA3-UXTV2-HA 由 Marcelo Damário 博士惠赠标签：HA（C 末端）。限制性内切酶：EcoRI 和 XhoI
pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin 由 Marcelo Damário 博士惠赠标签：6x-His-Myc（N 末端）。限制性内切酶：EcoRI 和 KpnI
青霉素-链霉素-谷氨酰胺 100 倍浓缩液Gibco10378-016
10 倍磷酸盐缓冲液（10x PBS）AccuGENE51226将 10x PBS 用超纯水稀释，可获得 1x PBS
聚乙烯亚胺（PEI）Sigma-Aldrich9002-98-6
丽春红 SVWR Life Science0860-50G
蛋白酶抑制剂混合物 SIGMAFASTSigma-AldrichS8820
摇床振荡器Kasvi19010005
SDS-PAGE 系统BioRad165-8004
溶液匀浆器Phoenix LufercoAP-22
Trizma 基础缓冲液Sigma-AldrichT6066-500G
胰蛋白酶（TrypLe Express）Gibco12605-028
Western 印迹发光试剂（Luminol）Santa Cruz BiotechnologySC-2048

参考文献

  1. Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
  2. Callis, J. The ubiquitination machinery of the ubiquitin system. The Arabidopsis Book. 12, 0174(2014).
  3. Koegl, M., et al. A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell. 96 (5), 635-644 (1999).
  4. French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. Emerging functions of branched ubiquitin chains. Cell Discovery. 7 (1), 6(2021).
  5. Komander, D., et al. Molecular discrimination of structurally equivalent Lys 63-linked and linear polyubiquitin chains. EMBO Reports. 10 (5), 466-473 (2009).
  6. Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143 (5), 682-685 (2010).
  7. Davies, B. A., et al. Vps9p CUE domain ubiquitin binding is required for efficient endocytic protein traffic. Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19826-19833 (2003).
  8. Raasi, S., Wolf, D. H. Ubiquitin receptors and ERAD: A network of pathways to the proteasome. Seminars in Cell and Developmental Biology. 18 (6), 780-791 (2007).
  9. Pan, M., et al. Structural insights into Ubr1-mediated N-degron polyubiquitination. Nature. 600 (7888), 334-338 (2021).
  10. Raducu, M., et al. SCF (Fbxl17) ubiquitylation of Sufu regulates Hedgehog signaling and medulloblastoma development. The EMBO Journal. 35 (13), 1400-1416 (2016).
  11. Spagnol, V., et al. The E3 ubiquitin ligase SCF(Fbxo7) mediates proteasomal degradation of UXT isoform 2 (UXT-V2) to inhibit the NF-κB signaling pathway. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1865 (1), 129754(2021).
  12. Teixeira, F. R., et al. Gsk3β and Tomm20 are substrates of the SCFFbxo7/PARK15 ubiquitin ligase associated with Parkinson's disease. Biochemical Journal. 473 (20), 3563-3580 (2016).
  13. Tan, M. K. M., Lim, H. J., Bennett, E. J., Shi, Y., Harper, J. W. Parallel SCF adaptor capture proteomics reveals a role for SCFFBXL17 in NRF2 activation via BACH1 repressor turnover. Molecular Cell. 52 (1), 9-24 (2013).
  14. van Wijk, S. J., Fulda, S., Dikic, I., Heilemann, M. Visualizing ubiquitination in mammalian cells. EMBO Reports. 20 (2), 1-18 (2019).
  15. Kisselev, A. F., Goldberg, A. L. Proteasome inhibitors: From research tools to drug candidates. Chemistry and Biology. 8 (8), 739-758 (2001).
  16. Bradford, M. A. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  17. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 228, 726-734 (1970).
  18. Schröer, A., Schneider, S., Ropers, H. -H., Nothwang, H. G. Cloning and characterization of UXT, a novel gene in human Xp11, which is widely and abundantly expressed in tumor tissue. Genomics. 56 (3), 340-343 (1999).
  19. Huang, Y., et al. UXT-V1 facilitates the formation of MAVS antiviral signalosome on mitochondria. The Journal of Immunology. 188 (1), 358-366 (2012).
  20. Huang, Y., et al. UXT-V1 protects cells against TNF-induced apoptosis through modulating complex II formation. Molecular Biology of the Cell. 22 (8), 1389-1397 (2011).
  21. Sun, S., et al. UXT is a novel and essential co-factor in the NF-κB transcriptional enhanceosome. The Journal of Cell Biology. 178 (2), 231-244 (2007).
  22. Huang, X., Dixit, V. M. Drugging the undruggables: Exploring the ubiquitin system for drug development. Cell Research. 26 (4), 484-498 (2016).
  23. Rajkumar, S. V. Multiple myeloma: 2020 update on diagnosis, risk-stratification and management. American Journal of Hematology. 95 (5), 548-567 (2020).
  24. Hideshima, T., et al. The proteasome inhibitor PS-341 inhibits growth, induces apoptosis, and overcomes drug resistance in human multiple myeloma cells. Cancer Research. 61 (7), 3071-3076 (2001).
  25. Tietsche, V., et al. New proteasome inhibitors in the treatment of multiple myeloma. Hematology, Transfusion and Cell Therapy. 41 (1), 76-83 (2018).
  26. Vassilev, L. T., et al. In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2. Science. 303 (5659), 844-848 (2004).
  27. Kuiken, H. J., et al. Identification of F-box only protein 7 as a negative regulator of NF-kappaB signalling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (9), 2140-2149 (2012).
  28. Yuan, N., et al. Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).
  29. Iconomou, M., Saunders, D. N. Systematic approaches to identify E3 ligase Substrates. Biochemical Journal. 473 (22), 4083-4101 (2016).
  30. Zhang, Z. R., Bonifacino, J. S., Hegde, R. S. Deubiquitinases sharpen substrate discrimination during membrane protein degradation from the ER. Cell. 154 (3), 609-622 (2013).
  31. Hunter, T. The age of crosstalk: Phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Molecular Cell. 28 (5), 730-738 (2007).

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免疫沉淀实验蛋白质印迹蛋白酶体抑制剂多聚泛素化蛋白瞬时转染细胞裂解F-box蛋白
哺乳动物细胞裂解物中E3泛素连接酶介导底物泛素化修饰的评估
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