我们提供了一种在哺乳动物细胞中针对特定底物和E3泛素连接酶的泛素化检测的详细实验方案。采用HEK293T细胞系进行蛋白过表达，通过免疫沉淀法从细胞裂解液中纯化多泛素化修饰的底物蛋白，并利用SDS-PAGE进行分离。通过免疫印迹技术检测该翻译后修饰。
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方法文章
哺乳动物细胞裂解物中E3泛素连接酶介导底物泛素化修饰的评估
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
泛素化是一种发生在真核细胞中的翻译后修饰，对多种生物学通路的调控至关重要，包括细胞存活、增殖和分化。该过程是可逆的，通过至少三种不同酶（E1（泛素激活酶）、E2（泛素结合酶）和E3（泛素连接酶））参与的级联反应，将泛素共价连接到底物蛋白上。其中E3复合物在底物识别和泛素化过程中发挥重要作用。本文描述了一种在哺乳动物细胞中评估底物泛素化水平的实验方案，通过瞬时共转染编码目标底物、E3泛素连接酶以及带标签泛素的质粒来实现。在细胞裂解前，用蛋白酶体抑制剂MG132（羧基苄氧基-亮氨酸-亮氨酸-亮氨酸醛）处理转染后的细胞，以防止底物经蛋白酶体降解。随后，对细胞裂解物进行小规模免疫沉淀（IP），以富集多泛素化底物，并利用针对泛素标签的特异性抗体通过蛋白质印迹（WB）进行检测。因此，本文提供了一种稳定且简便的哺乳动物细胞泛素化检测方法，有助于科研人员研究特定底物蛋白和E3泛素连接酶的泛素化过程。
引言
翻译后修饰（PTMs）是蛋白质调控的重要机制，对细胞稳态至关重要。蛋白质泛素化是一种动态且复杂的修饰过程，可在真核生物中产生多种不同的信号，导致多种细胞效应。泛素化是一个可逆过程，其特征是将含有76个氨基酸的泛素蛋白共价连接到底物蛋白上，该过程通过由三种不同反应组成的酶级联反应实现1。第一步是泛素的活化，依赖ATP水解，在泛素C末端与E1酶活性位点半胱氨酸残基之间形成高能硫酯键连接的泛素。随后，泛素被转移至E2酶，形成泛素与E2酶之间的硫酯键复合物。接着，泛素由E2酶或更常见的E3酶共价连接到底物蛋白上，其中E3酶负责识别并与底物相互作用2,3。在某些情况下，还需要E4酶（泛素链延伸因子）来促进多泛素链的组装3。
泛素含有七个赖氨酸残基（K6、K11、K27、K29、K33、K48 和 K63），可形成具有不同连接方式的多聚泛素链，从而产生不同的三维结构，这些结构可被多种效应蛋白识别4,5。因此，底物上形成的多聚泛素链类型对其细胞命运的决定至关重要6,
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方案
注意：哺乳动物细胞中泛素化实验方案的概述如图所示。 图1.
图 1. 泛素化检测实验流程概览。请点击此处查看此图的放大版本。
1. 细胞培养
- 在100 mm经TC处理的培养皿中，使用生长培养基（高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），添加10%胎牛血清（FBS）以及青霉素（100单位）、链霉素（100 µg）和L-谷氨酰胺（0.292 mg/mL）），将HEK293....
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结果
UXT（普遍表达转录本）是一种类似prefoldin的蛋白质，在小鼠和人类的心脏、脑、骨骼肌、胎盘、胰腺、肾脏及肝脏等组织中形成普遍表达的蛋白质折叠复合物18。已发现UXT存在两种剪接异构体，分别称为UXT-V1和UXT-V2，二者具有不同的功能和亚细胞定位。UXT-V1主要定位于细胞质及线粒体内部，参与TNF-α诱导的细胞凋亡以及抗病毒信号体的形成19,20。目前大多数研究集中于主要定位于细胞核的UXT-V2，其作为多种转录因子的共因子，参与调控细胞增殖、分化以及炎症通路。UXT-V2参与NF-κB信号通路，作为NF-κB增强子体（enhanceosome）中的关键共激活因子发挥作用21。已有研究证实，UXT-V2是E3泛素连接酶SCF(Fbxo7)的经典底物，可通过蛋白酶体介导其多聚泛素化和降解，从而抑制NF-κB信号通路的激活11。
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讨论
泛素化是一种重要的翻译后修饰，可调控多种蛋白质的水平，在众多信号通路和生物学过程中发挥关键作用，从而维持健康的细胞内环境。泛素-蛋白酶体系统（UPS）是近年来药物研究的主要焦点之一，为稳定肿瘤抑制因子或诱导致癌产物降解提供了可能22。例如，多发性骨髓瘤（MM）中负责单克隆免疫球蛋白分泌的浆细胞肿瘤异常增殖，会导致内质网（ER）中错误折叠和/或未折叠蛋白的积累，从而激活病理生理通路23。一旦发生内质网应激，便会激活包括泛素-蛋白酶体系统在内的多种细胞过程。使用蛋白酶体抑制剂（如硼替佐米、卡非佐米和伊沙佐米）诱导蛋白质积累并导致细胞死亡，在多发性骨髓瘤治疗中已显示出良好效果，作为抗肿瘤药物可减缓高危患者的疾病进展24,25。此外，其他针对蛋白质稳定性的研究也取得进展，例如靶向E3泛素连接酶MDM2的抑制剂，能够有效阻止p53的泛素化，从而避免其通过蛋白酶体途径被降解26。因此，一个以.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
F.R.T. 受 FAPESP 资助项目（编号 2020/15771-6）和 CNPq Universal（编号 405836/2018-0）支持。P.M.S.P. 和 V.S. 受 CAPES 资助。C.R.S.T.B.C. 受 FAPESP 奖学金（编号 2019/23466-1）支持。我们感谢 Sandra R. C. Maruyama（FAPESP 2016/20258-0）提供的材料支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 微量离心管 | Axygen | PMI110-06A | |
| 100 mm 经组织培养处理的培养皿 | Corning | 430167 | |
| 15 mL 离心管 | Corning | 430766 | |
| 96 孔板 | Cralplast | 655111 | |
| 琼脂糖-抗 HA 珠 | Sigma-Aldrich | E6779 | |
| 抗小鼠抗体 | Seracare | 5220-0341 | 山羊抗小鼠 IgG |
| 抗兔抗体 | Seracare | 5220-0337 | 山羊抗兔 IgG |
| 抗肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | A3853 | 使用稀释比例：1:2000 |
| 抗 Fbxo7 抗体 | Sigma-Aldrich | SAB1407251 | 使用稀释比例：1:1000 |
| 抗 HA 抗体 | Sigma-Aldrich | H3663 | 使用稀释比例：1:1000 |
| 抗 Myc 抗体 | Cell Signalling | 2272 | 使用稀释比例：1:1000 |
| 考马斯亮蓝试剂 | Sigma-Aldrich | B6916-500ML | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647-100G | 牛血清白蛋白 |
| 细胞培养箱 | Nuaire | NU-4850 | |
| 离心机 | Eppendorf | 5804R | 500 × g 离心 5 分钟 |
| ChemiDoc | BioRad | ||
| 数字 pH 计 | Kasvi | K39-2014B | |
| Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基 | Corning | 10-017-CRV | 高糖 |
| 胎牛血清 | Gibco | F4135 | 使用前过滤 |
| HA 肽 | Sigma-Aldrich | I2149 | |
| HEK293T 细胞 | ATCC | CRL-3216 | |
| Hepes | Gibco | 15630080 | |
| KCl | VWR Life Science | 0365-500G | |
| Kline 旋转仪 | Global Trade Technology | GT-2OIBD | |
| MG-132 | Boston Biochem | I-130 | |
| 微量离心机 | Eppendorf | 5418R | |
| Na3VO4（正钒酸钠） | |||
| NaF | |||
| 硝酸纤维素印迹膜 | GE Healthcare | 10600016 | |
| NP40（IGEPAL CA-630） | Sigma-Aldrich | I8896-100ML | |
| 光学显微镜 | OPTIKA microscopes | SN510768 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | V79020 | 用于哺乳动物表达 |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7 | 由 Marcelo Damário 博士惠赠 | 标签：2xFlag（N 末端）。限制性内切酶：EcoRI 和 XhoI | |
| pcDNA3-2xFlag-Fbxo7-ΔF-box | 由 Marcelo Damário 博士惠赠 | 标签：2xFlag（N 末端）。限制性内切酶：EcoRI 和 XhoI。Δ335-367 | |
| pcDNA3-UXTV2-HA | 由 Marcelo Damário 博士惠赠 | 标签：HA（C 末端）。限制性内切酶：EcoRI 和 XhoI | |
| pCMV-6xHis-Myc-Ubiquitin | 由 Marcelo Damário 博士惠赠 | 标签：6x-His-Myc（N 末端）。限制性内切酶：EcoRI 和 KpnI | |
| 青霉素-链霉素-谷氨酰胺 100 倍浓缩液 | Gibco | 10378-016 | |
| 10 倍磷酸盐缓冲液（10x PBS） | AccuGENE | 51226 | 将 10x PBS 用超纯水稀释，可获得 1x PBS |
| 聚乙烯亚胺（PEI） | Sigma-Aldrich | 9002-98-6 | |
| 丽春红 S | VWR Life Science | 0860-50G | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 SIGMAFAST | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| 摇床振荡器 | Kasvi | 19010005 | |
| SDS-PAGE 系统 | BioRad | 165-8004 | |
| 溶液匀浆器 | Phoenix Luferco | AP-22 | |
| Trizma 基础缓冲液 | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
| 胰蛋白酶（TrypLe Express） | Gibco | 12605-028 | |
| Western 印迹发光试剂（Luminol） | Santa Cruz Biotechnology | SC-2048 |
参考文献
- Popovic, D., Vucic, D., Dikic, I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment. Nature Medicine. 20 (11), 1242-1253 (2014).
- Callis, J. The ubiquitination machinery of the ubiquitin system. The Arabidopsis Book. 12, 0174(2014).
- Koegl, M., et al. <....
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重印与许可
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