利用共聚焦显微镜测量肾上腺嗜铬细胞中融合孔动力学的三种模式

摘要

本方案描述了一种共聚焦成像技术，用于检测牛肾上腺嗜铬细胞中的三种融合模式。这些融合模式包括：1）闭合融合（也称为“亲吻即走”模式），涉及融合孔的开放与关闭；2）持续融合，涉及融合孔的开放并维持孔道的开放状态；3）收缩融合，涉及融合囊泡的收缩。

摘要

动态融合孔的开放与关闭介导了胞吐作用和胞吞作用，并决定了它们的动力学特征。本文详细展示了如何将共聚焦显微镜与膜片钳记录技术相结合，用于检测原代培养的牛肾上腺嗜铬细胞中的三种融合模式。这三种融合模式包括：1）闭合融合（也称为“亲吻即走”模式），涉及融合孔的开放与随后关闭；2）持续融合，涉及融合孔的开放并维持孔道的持续开放状态；3）收缩融合，涉及融合后形成的Ω形膜结构逐渐收缩，直至完全与质膜合并。

为了检测这些融合模式，通过过表达与磷脂酶C δ的PH结构域（PH-mNG）相连的mNeonGreen标记细胞质膜，该结构域能够结合细胞质侧质膜上的磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PtdIns(4,5)P₂）；同时将荧光假神经递质FFN511加载至囊泡中以检测囊泡内容物的释放；并在灌流液中加入Atto 655以检测融合孔的关闭。这三种荧光探针在活体嗜铬细胞中以每帧约20–90毫秒的速度同时成像，用于检测融合孔开放、内容物释放、融合孔关闭以及融合囊泡的尺寸变化。本文描述了通过这些荧光信号区分三种融合模式的分析方法。该方法原则上可应用于除嗜铬细胞外的多种分泌细胞。

引言

膜融合介导多种生物学功能，包括突触传递、血糖稳态、免疫应答以及病毒入侵^1,2,3。胞吐作用涉及囊泡与质膜的融合，释放神经递质和激素，从而实现许多重要功能，例如神经网络活动。融合过程会打开一个孔道以释放囊泡内容物，随后该孔道可能关闭，使融合的囊泡得以回收，这一过程称为“亲吻即走”（kiss-and-run）^1,4。不可逆和可逆的融合孔开放均可通过细胞贴附式电容记录结合单个囊泡融合的融合孔电导记录进行测量。

这一现象通常被解释为完全塌陷融合（即融合孔扩张直至融合囊泡完全扁平化）和“亲吻即走”式融合（即融合孔短暂开放后重新关闭）两种机制^{5,6,7,8,9,10,}

方案

注意：动物使用程序遵循美国国立卫生研究院（NIH）指南，并已获得 NIH 动物护理和使用委员会的批准。

1. 牛嗜铬细胞培养

1. 制备洛克氏溶液（Locke's solution）表1）并在嗜铬细胞培养前1天对工具进行高压灭菌。
2. 在培养当天从当地屠宰场获取牛肾上腺，并在解剖前将其浸没于冰冻的Locke's溶液中。
   注意：肾上腺来自21至27月龄、健康、黑白花安格斯牛（黑白花安格斯公牛为主），无论性别，体重约为1,400磅（约635 kg）。
3. 准备30 mL（用于3个肾上腺）含有胶原酶P、胰蛋白酶抑制剂和牛血清白蛋白（BSA）的新鲜酶溶液表1在解剖前将其置于室温下保存。
4. 选取3个表面无切割或出血的完整腺体，用剪刀去除脂肪组织（图1A). 用Locke's溶液灌注腺体直至无血液流出。为此，通过肾上腺静脉充盈腺体图1B使用带有0.22 µm滤器的30 mL注射器，根据需要反复操作²⁵.
   注意：通常清洗 3 个腺体需要约 150 mL 的 Locke 氏溶液。
5. 消化时，使用连接有0.....

结果

根据图1和图2所示的实验步骤，用PH-mNG转染牛肾上腺的嗜铬细胞以标记质膜；在灌流液中加入A655以检测融合孔的关闭；并用荧光假神经递质FFN511装载囊泡以检测释放事件。随后，在细胞底部（Z焦平面位于细胞膜上方约100-200 nm处）每20-90 ms进行一次FFN511、PH-mNG和A655的XY平面共聚焦时间序列成像。通过全细胞膜片钳记录，并施加从-80 mV到+10 mV、持续1 s的去极化刺激，以诱发胞吐和胞吞作用（图3A-C）。该去极化刺激引发内向钙电流、指示胞吐的膜电容跳跃，以及跳跃后指示胞吞的膜电容衰减（图3D，E）。

通过在细胞底部进行延时XY/Z_fixed成像，去极化后观察到大量单个融合事件

讨论

本文描述了一种共聚焦显微成像方法，用于检测牛肾上腺嗜铬细胞中融合孔的动力学变化、递质释放过程，以及三种融合模式：闭合融合、持续融合和收缩融合^4,24。同时介绍了一种电生理学方法，用于去极化细胞以诱发胞吐和胞吞作用。系统的共聚焦图像处理可提供有关融合与裂变事件中不同孔道行为模式的信息。

采用全细胞记录模式在同一细胞上同时监测钙电流和电容变化，可提供关于胞吐和胞吞过程的额外信息，反映出在任意给定时间点全细胞水平上孔道开放与关闭的比例。原则上，这些方法可应用于原代培养或细胞系中的其他可兴奋细胞以及非电兴奋细胞，只要其含有直径约为200-1,600 nm的囊泡¹⁵。除嗜铬细胞外，本文所述方法也已应用于大鼠胰腺β细胞系INS-1细胞⁴。

原则上，该方法也可应用于含有小于200 nm囊泡的分泌细胞。然而，随着囊泡尺寸减小，信噪比.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
腺苷-5'-三磷酸镁盐	Sigma	A9187-500MG	用于配制内液的ATP
Atto 655	ATTO-TEC GmbH	AD 655-21	用于标记灌流液的Atto染料
原代神经元基本核转染试剂盒	Lonza	VSPI-1003	电穿孔转染缓冲液及配套试剂盒
硼硅酸盐毛细玻璃移液管	Warner Instruments	64-0795	标准壁带丝，外径=2.0 mm，内径=1.16 mm，长度=7.5 cm
牛血清白蛋白	Sigma	A2153-50G	腺体消化用试剂
氯化钙 2 M	Quality Biological	351-130-721	用于配制灌流液的试剂
细胞筛，100 µm	Falcon	352360	用于过滤嗜铬细胞悬液的材料
氢氧化铯溶液	Sigma	232041	用于配制内液及Cs-谷氨酸/Cs-EGTA储备缓冲液的试剂
胶原酶P	Sigma	11213873001	用于腺体消化的酶
盖玻片	Neuvitro	GG-14-Laminin	GG-14-Laminin，直径14 mm，#1厚度，60片装，经层粘连蛋白包被的德国盖玻片
D-(+)-葡萄糖	Sigma	G8270-1KG	用于配制Locke’s溶液和灌流液的试剂
DMEM	ThermoFisher Scientific	11885092	用于配制培养基的试剂
EGTA	Sigma	324626-25GM	用于配制灌流液用Cs-EGTA储备缓冲液的试剂
电穿孔仪与核转染仪	Amaxa Biosystems	Nucleofector II	将质粒转染入细胞
胎牛血清	ThermoFisher Scientific	10082147	用于配制培养基的试剂
FFN511	Abcam	ab120331	荧光假性神经递质，用于标记囊泡
鸟苷-5'-三磷酸钠盐水合物	Sigma	G8877-250MG	用于配制内液的GTP
HEPES	Sigma	H3375-500G	用于配制Locke’s溶液的试剂
Igor Pro	WaveMetrics	Igor pro	用于膜片钳数据分析和成像数据展示的软件
Leica Application Suite X软件	Leica	LAS X软件	共聚焦成像数据采集与分析软件
Leica TCS SP5 共聚焦激光扫描显微镜	Leica	Leica TCS SP5	用于成像数据采集的共聚焦显微镜
L-谷氨酸	Sigma	49449-100G	用于配制灌流液用Cs-谷氨酸储备缓冲液的试剂
锁相放大器	Heka	Lock-in	用于电容记录的软件
氯化镁 1 M	Quality Biological	351-033-721EA	用于配制内液和灌流液的试剂
金属化血球计数板 Hausser Bright-Line	Hausser Scientific	3120	计数室
微电极抛光仪	Narishige	MF-830	抛光移液管以增强吉欧姆密封的形成与稳定性
Millex-GP 注射器滤器，0.22 µm	Millipore	SLGPR33RB	用于腺体清洗与消化的材料
mNG(mNeonGreen)	Allele Biotechnology	ABP-FP-MNEONSB	PH-mNeonGreen构建的模板
尼龙网过滤筛，100 微米	EIKO filtering co	03-100/32	用于过滤髓质悬液的材料
膜片钳EPC-10	Heka	EPC-10	用于膜片钳数据采集的放大器
PH-EGFP	Addgene	质粒 #51407	PH-mNeonGreen构建的骨架质粒
移液管拉制仪	Sutter Instrument	P-97	制备用于膜片钳记录的移液管
氯化钾	Sigma	P5404-500G	用于配制Locke’s溶液、灌流液和内液的试剂
Pulse软件	Heka	Pulse	用于膜片钳数据采集的软件
记录室	Warner Instruments	64-1943/QR-40LP	盖玻片用记录室，用于在活细胞上施加膜片钳移液管
氯化钠	Sigma	S7653-1KG	用于配制Locke’s溶液、灌流液和内液的试剂
氢氧化钠	Sigma	S5881-500G	用于配制Locke’s溶液的试剂
磷酸氢二钠	Sigma	S0876-500G	用于配制Locke’s溶液的试剂
磷酸二氢钠	Sigma	S8282-500G	用于配制Locke’s溶液的试剂
搅拌加热板	Barnsted/Thermolyne	type 10100	用于蜡涂层移液管加热的装置
注射器，30 mL	Becton Dickinson	302832	用于腺体清洗与消化的材料
四乙基氯化铵	Sigma	T2265-100G	用于配制灌流液的TEA
胰蛋白酶抑制剂	Sigma	T9253-5G	用于腺体消化的试剂
浸油F型	Leica	195371-10-9	Leica共聚焦显微镜用封片油