本文介绍了一种使用微型焚烧炉替代明火来对线虫挑针、刮刀和手术刀进行灭菌的方法。
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摘要
摘要
秀丽隐杆线虫（C. elegans） 是本科院校科研与教学的理想模式生物。本科生能够快速掌握维持其培养所需的无菌技术 秀丽隐杆线虫 培养。传统上，用于将线虫从一个培养皿转移到另一个培养皿的铂金接种针的灭菌，是通过将其置于本生灯或乙醇灯的火焰中完成的。然而，本生灯需要气源，且这两种设备均存在因明火引发意外火灾的风险。本文演示了一种使用红外细菌环微型焚化器对线虫接种针、刮刀和手术刀进行灭菌的技术。该设备仅需电源插座，可最大限度减少潜在的火灾隐患。由于降低了安全风险和对气体供应的需求，该技术非常适用于本科教学和科研环境。
引言
模式生物 C. elegans 因其成本低廉、易于维护且应用范围广泛，非常适合主要以本科生教育为主的院校（PUIs）开展科研与教学1,2,3,4。为了操作线虫——例如将线虫从一个培养皿转移到另一个培养皿，实验人员可以使用线虫挑针。多种类型的挑针均可自行制作或购买，用于 C. elegans 实验。挑针通常由铂金或铂铱合金制成的针尖，安装在玻璃、金属或木质手柄上而成。玻璃手柄可在实验室内自制，方法是将铂丝缠绕于巴斯德吸管周围并加热熔化，直至铂丝牢固固定。有关 C. elegans 的饲养方法，包括如何培养和维持线虫及其食物来源的更多信息，可参见 WormBook5 及其他资料来源6,7,8。
在操作 C. elegans 时，通常采用无菌技术以防止微生物和真菌污染。无菌技术的示例包括器械灭菌、试剂高压灭菌以及在无菌环境中进行操作。线虫挑针通常使用明火进行灭菌9。此外，对线虫挑针进行灭菌的同时可焚毁残留的线虫，从而在处理多种线虫品系时避免品系间的意外混淆。目前常用的线虫挑针灭菌方法包括使用本生灯、乙醇灯或普通打火机产生的明火（Table 1）。当一名本科生在为乙醇灯添加乙醇时无意中发生泄漏，并在点燃灯时意外引发小范围火灾后，我们开始寻求实验室现有方法中更安全的替代方案。不幸的是，已有大量关于使用乙醇灯导致事故的报道10,11,12。幸运的是，微生物学领域已验证了多种替代性灭菌方法，本文的目的即在于演示如何使用此类设备对用于 C. elegans 操作的器械进行灭菌。
在微生物学实验室中，无菌技术也至关重要。用于微生物操作的血清学接种环和铂金丝通常通过明火13或微型焚烧器14,15,16进行灭菌。微型焚烧器的其他名称包括微型灭菌器或细菌焚烧器。与传统的火焰灭菌方法相比，微型焚烧器的优点包括降低火灾风险、避免焚烧材料飞溅，以及可在层流罩或生物安全柜内操作16,17,18。事实上，美国微生物学会和世界卫生组织均建议使用微型焚烧器替代明火灭菌17,19,20。与本生灯相比，微型焚烧器无需连接燃气管道，而某些实验室可能不具备燃气管线，或未在每个实验台配备供学生使用的燃气接口。受这些优势启发，已开发出一种实验方案，用于在秀丽隐杆线虫（C. elegans）实验室中以微型焚烧器替代火焰，对常用的工具如接种针、刮刀和手术刀进行灭菌。该方法可能适用于希望在操作C. elegans时提高安全性或灵活性的教师和研究人员。
方案
1. 准备微型焚化器
- 通过将环形支架附件导板夹在微燃烧器的外筒上，将其安装到微燃烧器上。
- 根据需要将微燃烧器插入标准的 120 V 或 230 V 电源插座。
注意：此步骤可在实验台或层流罩内进行。 - 将微燃烧器调至高温档，并根据制造商的说明预热 10–20 分钟，使其达到 800–825 oC 的最佳工作温度。
注意：若微燃烧器连续使用超过 3 小时，可使用较低温度档（500 oC）作为待机温度。根据制造商的用户手册，这有助于延长设备的使用寿命。
2. 对接种针、刮刀或手术刀进行灭菌
- 沿导轨滑动，将器械插入圆柱形灭菌区域，避免触碰管壁21。
注意：若灭菌手术刀，务必避免刀片接触陶瓷壁。刮擦陶瓷壁可能损坏加热单元的完整性。 - 将器械在灭菌区域内保持 5–7 秒。
- 沿导轨向后滑动，取出器械时避免触碰管壁。
- 对于接种针，需等待器械冷却 3–5 秒后再接触线虫，以免烫伤线虫。
注意：若手术刀或刮刀未充分冷却，会烧焦琼脂。 - 挑取线虫后，将接种针重新插入灭菌腔内 5–7 秒，以焚毁针上残留的任何线虫。
3. 对照方法——使用本生灯对器械进行灭菌
- 使用橡胶管将本生灯连接到燃气管线上。确保橡胶管连接牢固，并将本生灯放置在远离上方物体的位置。
- 旋转燃气管线上的旋钮，打开燃气。
- 使用点火器或打火机点燃本生灯。
- 调节燃气旋钮和进气口，直至火焰中出现蓝色锥形区域。
- 将接种针、刮铲或手术刀置于火焰中，加热至其发红。
- 对于接种针，需等待仪器冷却3-5秒后再接触线虫，以避免烫伤线虫。
注意：若手术刀或刮铲未充分冷却，会烧焦琼脂。 - 挑取线虫后，将接种针重新插入火焰中，以焚毁针上残留的任何线虫。
4. 实验
- 在37 oC摇床中，于Luria肉汤22中过夜培养OP50 Escherichia coli (E. coli)细菌。
- 过夜培养后，用无菌水按1:100的比例稀释培养物。
注意：选择此稀释倍数是为了确保涂板后菌落分离。 - 将经本生灯灭菌的线虫挑针浸入细菌溶液中，再次用本生灯灭菌，然后在100 mL无菌水中旋转冲洗。
- 取100 µL水样接种至10 cm LB琼脂22,23培养皿中，使用无菌涂布棒均匀涂布，并盖上皿盖，在室温下孵育24小时。
- 使用经微型灼烧器灭菌的线虫挑针重复步骤4.3–4.4。
- 作为阳性对照，执行步骤4.3–4.4但不进行再次灭菌。
- 作为阴性对照，以无菌水代替细菌溶液执行步骤4.3–4.4。
- 孵育结束后人工计数菌落。
结果
设计了一个简单的实验（第4节），用于演示使用微型焚菌器与火焰灭菌时的相对污染率（图1，表2）。尽管这些结果反映了不同方法间的污染率，但使用微型焚菌器技术时无需重复此实验方法。该实验设置了三个重复。阴性对照为不含细菌的无菌水。阳性对照不使用任何灭菌技术：将接种针浸入稀释的OP50菌液后，直接转移至无菌水中。所有重复组和实验条件均在同一天平行进行。在全部三个阴性对照平板中，菌落数均为零。使用本生灯灭菌接种针时，平均获得4.7（±0.3 SEM）个菌落。在微型焚菌器条件下，平均菌落数为3.3（±1.2 SEM）。然而，在阳性对照条件下，平均菌落数达到298.3（±17.9 SEM）。对本生灯与微型焚菌器条件进行假设方差相等的双尾t检验，结果显示无统计学显著差异（p = 0.35）。因此，微型焚菌器所达到的无菌效果与本生灯同样有效。
图1：不同灭菌方法下的细菌计数结果。接种环浸入含1:100稀释的OP50菌液（溶于无菌水）中，随后使用本生灯或微型焚烧器进行灭菌。灭菌后，将接种环再次浸入无菌水中，取样涂布于LB琼脂平板22,23，室温培养24小时，随后人工计数菌落。阳性对照组未进行灭菌处理，阴性对照组使用不含细菌的无菌水。每种条件重复3次（n = 3）。注意：y轴采用断点坐标，以便在图表相关区域清晰显示数据点。请点击此处查看该图的放大版本。
| 灭菌方法 | 成本 | 实验室要求 | 优点 | 缺点 | |||
| 微型焚烧器 | $365–530 | 120 V 或 230 V 电源插座 | • 便携 • 无明火或裸露加热元件 • 可在层流罩和生物安全柜中使用 | • 需预热时间 • 成本较高 | |||
| 本生灯 | $24–169 | 燃气管线 | • 安装快速 • 成本低 | • 明火 • 不建议在层流罩或生物安全柜中使用 | |||
| 乙醇灯 | $11 | 无 | • 安装快速 • 成本低 • 可重复加注 | • 明火 • 加注时存在安全隐患 • 不建议在层流罩或生物安全柜中使用 • 某些机构禁止使用 | |||
| 打火机 | $5–8 | 无 | • 成本低 • 易获取 • 一次性使用 • 可重复加注 | • 明火 • 需手动操作 • 不建议在层流罩或生物安全柜中使用 | |||
表1：器械灭菌方法的比较。 根据优势、劣势、成本及实验室要求，对四种器械灭菌方法进行了比较。
| 重复 | 条件 | |||
| 微型焚化炉 | 本生灯 | 阴性对照 | 阳性对照 | |
| 1 | 1 | 5 | 0 | 278 |
| 2 | 4 | 4 | 0 | 334 |
| 3 | 5 | 5 | 0 | 283 |
| 平均值 | 3.3 | 4.7 | 0.0 | 298.3 |
| 标准误 | 1.2 | 0.3 | 0.0 | 17.9 |
表2：不同灭菌方法下细菌计数的原始数据。接种针浸入1:100的OP50菌液（溶于无菌水中）后，使用本生灯或微型焚烧器进行灭菌。随后将接种针浸入无菌水中，涂布于LB琼脂平板22,23，室温下培养24小时，人工计数菌落。阳性对照未进行灭菌处理，阴性对照使用不含细菌的无菌水。每种条件重复3次（n = 3）。各重复计数值下方列出均值与标准误（SEM）。
讨论
C. elegans 是一种非常适合用于本科教学实验课程的模式生物。使用微型焚化器替代明火，可为科研实验室和教学实验室带来诸多优势。事实上，由于教室内存在大量初次接受培训的科研人员，本科实验课程发生意外火灾的风险可能更高。此外，当使用乙醇对靠近火源的器械进行消毒时，火灾风险会进一步增加，因为乙醇蒸气具有可燃性。微型焚化器的便携性也使其在未于每个实验台安装燃气管道的教室环境中更具优势。本方法已在本机构的教学与科研实验室中应用，自2016年引入以来，未出现污染增加的情况，且未发生任何实验室安全事故。
为确保与微型焚化器的兼容性，测试了多种具有不同安装方式、金属丝成分和金属丝规格的接种环。金属丝成分包括100%铂以及90%铂/10%铱，金属丝直径为30–32 G。无论金属丝粗细或成分如何，加热方法均未影响金属丝的完整性。安装方式包括两种 commercially available 接种环手柄，以及使用巴斯德移液管自制的玻璃安装装置。需要注意的是，接种环在加热时不会像火焰灭菌那样发红。然而，只要灭菌器已达到适当温度，仍可实现充分灭菌。因此，必须按照制造商说明，让微型焚化器预热10至20分钟。将器械在加热腔内保持至少5秒以完成灭菌也至关重要。将器械留在腔内超过7秒不会对其造成损害，但并无必要。尽管该操作步骤相对简单，通常无需故障排查，但可能需要一定练习才能掌握如何在不触碰管壁的情况下稳定地持握器械。
为了替代明火，一种灭菌方法必须涵盖实验室中使用的所有应用场景。除了灭菌实验器具外，C. elegans 实验室还可能使用本生灯来创建无菌区域，以执行其他操作，例如倒平板或接种培养物13。然而，这种方法是否真正能够形成无菌区域，或是否会吸入仍具活性的污染物，目前仍存在争议14。尽管并非所有机构都具备该条件，但生物安全柜或层流罩可用于实现上述目的，从而使实验室无需使用明火即可运行。大多数微型焚烧器的使用说明书均不建议将其用于手术刀片的灭菌，因为刮擦内壁会损坏灭菌设备。然而，若谨慎使用导向装置，可在不接触内壁的情况下对手术刀片或刮刀进行灭菌。这扩展了该技术的应用范围，使得无需明火即可进行组织块接种操作，并使 C. elegans 实验室在对不同物品进行灭菌时无需切换灭菌方法。
如表1所述，微型电热灭菌器相比火焰灭菌法具有更高的安全性、更好的超净工作台兼容性以及更强的便携性，但也存在局限性。其成本高于其他方法，且在达到灭菌温度前需要一定的预热时间。总之，该方法目前在许多微生物学实验室中常规使用，可能适用于某些希望在不牺牲无菌条件的前提下提高实验室安全性的C. elegans研究与教学实验室。
披露
未披露任何利益冲突。
致谢
作者谨此感谢Suzanne Howard和Justin Finne。本研究由韦尔斯利学院神经科学系资助。N2线虫由CGC提供，CGC由美国国立卫生研究院研究基础设施项目办公室（P40 OD010440）资助。 本文的出版费用由韦尔斯利学院图书馆与技术服务开放获取基金支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 90% 铂 10% 铱丝 | Tritech | PT-9010 | 可使用其他来源和成分的金属丝。 |
| 琼脂糖 | Sigma Aldrich | A6013 | LB 琼脂成分 |
| 本生灯 | Fisher Scientific | 50-110-1225 | 可使用其他类型的本生灯 |
| 乙醇灯 | Carolina | 706604 | 此处列出以作为对表 1 的参考 |
| 点火器 | Carolina | 706636 | 此处列出以作为对表 1 的参考 |
| 接种环支架附件 | Fisher | 22-630-002 | 文中称为 "导引装置" |
| 微型焚烧器 | Thomas Scientific | 1154J15 | 多家公司销售类似设备。Benchmark Scientific (B1001)、 Fisher Scientific (22-630-001)、Carolina (703400) 和 BT Lab Systems (BT1702) 也销售类似型号。 |
| N2 线虫 | CGC | N2 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | LB 培养基成分 |
| OP50 大肠杆菌 | CGC | OP50 | |
| 培养皿 | Fisher | 08-772B | |
| 挑菌针手柄 | Tritech | TWPH1 | |
| 手术刀片 | Fisher | 12-000-161 | |
| 手术刀柄 | Fisher | 12-000-164 | |
| 刮勺 | Fisher | 14-374 | 其他类型的刮勺也可使用 |
| 无菌涂布棒 | VWR | 76206-438 | 只要保持无菌，可使用其他类型的涂布工具 |
| 胰蛋白胨 | Sigma Aldrich | T7293 | LB 培养基成分 |
| 酵母提取物 | Sigma Aldrich | Y1625 | LB 培养基成分 |
参考文献
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