本方案提供了在小鼠中建立主动脉瓣反流（AR）的手术实用指南。通过超声心动图和有创血流动力学测量对AR小鼠进行评估，可重现其由容量超负荷诱导的离心性心肌肥厚这一具有临床相关性的特征，表明该模型在心肌肥厚研究中具有良好的应用前景。
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本文内容
摘要
摘要
主动脉瓣反流（AR）是一种常见的心脏瓣膜病，可导致心脏容量负荷过重，是全球重要的公共卫生问题。尽管小鼠被广泛用于揭示心血管疾病的发病机制，但主动脉瓣反流的小鼠模型，尤其是手术诱导的模型，目前仍较为缺乏。本文详细描述了一种在高分辨率超声心动图引导下，通过破坏主动脉瓣而手术诱导建立的小鼠AR模型。该模型中，反流的血流导致小鼠心脏出现典型且具有临床相关性的容量负荷过重表型，表现为离心性心肌肥厚和心功能障碍，超声心动图及有创血流动力学评估结果均为此提供了证据。本研究以可靠且可重复的方式，为建立和评估主动脉瓣反流小鼠模型提供了实用指南，有助于未来对容量负荷型心肌病的分子机制及治疗靶点的深入研究。
引言
在容量负荷（前负荷）或压力负荷（后负荷）增加的情况下，心脏会发生增大，这种状况称为肥厚。尽管心肌肥厚是在心力衰竭前维持外周器官灌注的一种代偿性反应，但它也是主要心血管事件的独立危险因素1,2。容量负荷是机械应力增加的重要表现之一。容量负荷发生在心脏舒张期，并诱导离心性心肌肥厚，这不仅常见于瓣膜性疾病（如主动脉瓣反流和二尖瓣反流），也见于终末期高血压性心脏病、心肌梗死、扩张型心肌病以及过度运动等情况。此外，在临床实践中，一些对压力负荷引起的心肌肥厚具有良好减轻作用的药物，在治疗容量负荷引起的心肌肥厚时效果却不理想1。因此，揭示由容量负荷导致的离心性心脏重构的机制及干预方法具有重要意义。然而，长期以来，针对容量负荷的研究进展显著受限，这在很大程度上归因于缺乏操作简便、可高效定量且能稳定重复的小动物模型3。
至于小型动物物种，小鼠因其生命周期短、操作方便、基因组清晰以及易于进行基因改造，已成为心血管疾病研究的主流模式动物4在模型分类方面，与基因修饰模型和药物处理模型相比，手术模型具有显著的独特优势。手术模型可避免基因修饰模型所必需的繁杂小鼠繁育和基因鉴定过程，同时也能避免药物处理模型中难以控制的对心脏外组织和器官的非特异性影....
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方案
本方案已获得复旦大学附属中山医院动物护理与使用委员会的伦理批准，并遵循美国国立卫生研究院（NIH，贝塞斯达，马里兰州，美国）发布的《实验动物护理与使用指南》（第85-23号，2011年修订版）中的建议。
注意：动物实验使用年龄大于10周的雄性C57BL/6J小鼠。>在对小鼠进行主动脉瓣反流手术之前，操作者应熟练掌握小鼠超声心动图的操作技术。然而，在大多数研究机构中，小型啮齿类动物的超声心动图通常由核心设施的专业人员操作，因此若操作者本人不具备丰富的超声心动图经验，可与核心设施的专家密切合作。具备小鼠有创血流动力学测量经验者更佳。
1. 超声成像（必需）和有创血流动力学测量（可选）的准备工作
- 在使用75%酒精对键盘和30 MHz探头进行消毒后，启动超声波仪器。将温控超声动物平台调整至主动脉弓切面成像位置，使小鼠右侧身体抬高倾斜。用75%酒精喷洒超声耦合剂瓶外表面以进行消毒（超声耦合剂本身为无菌状态）。
注意：建议将超声动物平台的颅端朝向手术者。然而，颅端或尾端是否朝向手术者，应根据手术者感觉更舒适的方向来决定。 - 将微型压力计（压力导管）连接至数据采集装置和模数转换器。
注意：如果条件允许，也可以使用压力-容积导管。此处 使用压力导管是因为实验室中的压力数据采集设备仅能采集压力数据，无法采....
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结果
为确保主动脉瓣反流（AR）造模成功，我们采用彩色多普勒和脉冲波多普勒超声心动图验证了反流性血流。在AR小鼠中，主动脉弓的彩色多普勒频谱显示术后即刻存在反流血流（红色），而假手术小鼠则无此现象（舒张期无血流；图3A）。与此一致，脉冲波多普勒结果显示AR小鼠的反流血流显著升高（图3B、C）。通过有创血流动力学测量进一步证实，与假手术组动物相比，AR小鼠的主动脉舒张末压（AEDP）明显降低，脉压（PP）相应升高（图3D–F）。术后2小时内围手术期死亡率约为15%，术后4周内的死亡率约为20%（已排除围手术期死亡；图4A）。左心室流出道的大体照片显示，AR小鼠的主动脉瓣出现穿孔，而假手术小鼠的瓣膜保持完整（图4B）。这些结果表明，小鼠AR模型已成功建.......
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讨论
在小鼠中通过手术诱导主动脉瓣反流是一种技术上具有挑战性的新兴技术，但具有重要的转化研究意义。要掌握该技术，外科医生应事先至少熟悉小鼠的颈部和心脏解剖结构、小鼠操作技术以及超声心动图。具备有创血流动力学测量的操作经验将更有助益。为成功实施主动脉瓣反流手术，需特别关注若干关键步骤。
切开右侧颈总动脉（RCCA）是最关键的步骤。RCCA上的切口不宜过小，以免无法容纳塑料导管；也不宜过大，以防插入塑料导管时RCCA容易断裂。为满意地完成RCCA切开，应在剪切前将小型镊式剪刀略微张开。强烈建议在显微镜下进行此操作。
避免穿刺肾上腺中央动脉（RCCA）和升主动脉。当插入带有金属导丝的塑料导管时，容易穿破血管壁。 通过 右冠状动脉（RCCA）并送至主动脉口。RCCA和升主动脉穿孔将导致明显出血，大多数情况下动物会在术后1周内死亡。为避免此问题，应确保导丝前端不超过导管的开口端。此外，含导丝的导管在血管内推进时应极为轻柔。当遇到阻力时，术者应暂停前进，稍作回撤，然后再次轻柔推进。
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到国家自然科学基金（81941002、82170389、82170255、81730009、81670228 和 81500191）、上海市科学技术委员会实验动物科学基金（201409004300 和 21140904400）、上海市浦东新区卫生健康委员会卫生科技项目（PW2019A-13）以及"曙光"上海东方医院优秀青年医学 人才计划（2019xrrcjh03）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 铜板 | JD.com Inc. | 定制 | 建议尺寸为 20 × 15 cm 或更大 |
| 弯血管钳 | 66 Vision Tech | 53324A | 用于牵拉并分离肌肉、组织和血管 |
| 加热垫 | JD.com Inc. | 长治 55 | 用于加热铜板和小鼠 |
| 长柄弯血管钳 | MECHENIC | TS-15 | 用于牵拉血管 |
| 金属丝（不锈钢） | JD.com Inc. | 直径 0.18 mm | 与塑料导管配合使用，用于穿刺主动脉瓣 |
| 持针器 | 上海金钟 | 131110 | 用于皮肤缝合 |
| 塑料导管 | Anilab software & instruments | PE-0402 | 与金属丝配合使用，用于穿刺主动脉瓣 |
| 压力导管 | Millar Instruments | SPR 835 | 规格为 1.4F |
| 压力数据采集装置及模拟/数字转换器 | AD Instruments | Labchart 5 | 与压力导管连接 |
| 手术剪 | 苏州世强 | Stronger 13Cr | 用于剪开皮肤 |
| 小组织剪 | 上海金钟 | YBE030 | 用于剪切血管 |
| 体视显微镜 | 奥林巴斯公司 | SMZ845 | 用于血管切开和插管 |
| 直血管钳 | 66 Vision Tech | 53320A | 用于牵拉并分离肌肉、组织和血管 |
| Tergazyme 酶促清洗剂 | Alconox, Inc. | 13051.0 | 清除导管上的蛋白质物质、组织和血液 |
| 镊子 | 苏州世强 | 5307B | 用于夹持并牵拉皮肤和肌肉 |
| 超声耦合剂 | PARKER | Aquasonic-100 | 用于传递超声信号 |
| 超声成像系统 | VisualSonics | 2100 | 包含 B 模式、M 模式、彩色多普勒和脉冲波多普勒 |
| 麻醉蒸发器 | RWD Life Science | R540 | 用于麻醉 |
参考文献
- You, J., et al. Differential cardiac hypertrophy and signaling pathways in pressure versus volume overload. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 314 (3), 552-562 (2018).
- Wu, J., et al.
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