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方法文章

通过主动脉瓣反流在小鼠中诱导的心脏容量超负荷手术

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DOI：

10.3791/63579

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2022年8月30日

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1Shanghai Institute of Cardiovascular Diseases, Zhongshan Hospital and Institutes of Biomedical Sciences, Fudan University, 2Department of Cardiovascular Medicine, Shanghai East Hospital, School of Medicine, Tongji University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案提供了在小鼠中建立主动脉瓣反流（AR）的手术实用指南。通过超声心动图和有创血流动力学测量对AR小鼠进行评估，可重现其由容量超负荷诱导的离心性心肌肥厚这一具有临床相关性的特征，表明该模型在心肌肥厚研究中具有良好的应用前景。

摘要

主动脉瓣反流（AR）是一种常见的心脏瓣膜病，可导致心脏容量负荷过重，是全球重要的公共卫生问题。尽管小鼠被广泛用于揭示心血管疾病的发病机制，但主动脉瓣反流的小鼠模型，尤其是手术诱导的模型，目前仍较为缺乏。本文详细描述了一种在高分辨率超声心动图引导下，通过破坏主动脉瓣而手术诱导建立的小鼠AR模型。该模型中，反流的血流导致小鼠心脏出现典型且具有临床相关性的容量负荷过重表型，表现为离心性心肌肥厚和心功能障碍，超声心动图及有创血流动力学评估结果均为此提供了证据。本研究以可靠且可重复的方式，为建立和评估主动脉瓣反流小鼠模型提供了实用指南，有助于未来对容量负荷型心肌病的分子机制及治疗靶点的深入研究。

引言

在容量负荷（前负荷）或压力负荷（后负荷）增加的情况下，心脏会发生增大，这种状况称为肥厚。尽管心肌肥厚是在心力衰竭前维持外周器官灌注的一种代偿性反应，但它也是主要心血管事件的独立危险因素1,2。容量负荷是机械应力增加的重要表现之一。容量负荷发生在心脏舒张期，并诱导离心性心肌肥厚，这不仅常见于瓣膜性疾病（如主动脉瓣反流和二尖瓣反流），也见于终末期高血压性心脏病、心肌梗死、扩张型心肌病以及过度运动等情况。此外，在临床实践中，一些对压力负荷引起的心肌肥厚具有良好减轻作用的药物，在治疗容量负荷引起的心肌肥厚时效果却不理想1。因此，揭示由容量负荷导致的离心性心脏重构的机制及干预方法具有重要意义。然而，长期以来，针对容量负荷的研究进展显著受限，这在很大程度上归因于缺乏操作简便、可高效定量且能稳定重复的小动物模型3。

至于小型动物物种，小鼠因其生命周期短、操作方便、基因组清晰以及易于进行基因改造，已成为心血管疾病研究的主流模式动物4在模型分类方面，与基因修饰模型和药物处理模型相比，手术模型具有显著的独特优势。手术模型可避免基因修饰模型所必需的繁杂小鼠繁育和基因鉴定过程，同时也能避免药物处理模型中难以控制的对心脏外组织和器官的非特异性影响。既往文献已证实，主动脉-下腔静脉分流小鼠模型可诱导心脏容量超负荷。5然而，主动脉-下腔静脉分流在临床上仅占心脏离心性肥厚的一小部分，并可引起双心室超负荷5，使其在左心室离心性肥厚研究中的转化意义较小。然而，瓣膜性心脏病是全球范围内重大的公共卫生问题；据估计，约有15%的人口受到该病影响 >75岁年龄具有显著的心脏瓣膜功能障碍6尽管主动脉瓣反流（AR）在瓣膜性心脏病中占有一席之地，但它因反流血液导致容量负荷增加，会独特地引起左心室（LV）离心性肥厚7,8考虑到右侧颈总动脉（RCCA）可作为到达主动脉瓣位置的通路，从概念上讲，通过该路径破坏主动脉瓣具有研究意义 通过 通过RCCA引起小鼠血液反流。该方法受到创建振荡性主动脉血流技术的启发9，我们实验室近期建立了一种主动脉瓣反流（AR）的小鼠模型，通过手术诱导容量超负荷7该AR小鼠表现出明显的心室离心性肥厚，这是一种具有临床转化意义的方法，在研究心脏超负荷表型及其潜在机制方面展现出良好的转化潜力。本文详细描述了在小鼠中实施AR手术的逐步操作流程，并通过高频超声心动图和有创血流动力学检测进行验证，以确保手术成功。图1).

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方案

本方案已获得复旦大学附属中山医院动物护理与使用委员会的伦理批准，并遵循美国国立卫生研究院（NIH，贝塞斯达，马里兰州，美国）发布的《实验动物护理与使用指南》（第85-23号，2011年修订版）中的建议。

注意：动物实验使用年龄大于10周的雄性C57BL/6J小鼠。>在对小鼠进行主动脉瓣反流手术之前，操作者应熟练掌握小鼠超声心动图的操作技术。然而，在大多数研究机构中，小型啮齿类动物的超声心动图通常由核心设施的专业人员操作，因此若操作者本人不具备丰富的超声心动图经验，可与核心设施的专家密切合作。具备小鼠有创血流动力学测量经验者更佳。

1. 超声成像（必需）和有创血流动力学测量（可选）的准备工作

  1. 在使用75%酒精对键盘和30 MHz探头进行消毒后，启动超声波仪器。将温控超声动物平台调整至主动脉弓切面成像位置，使小鼠右侧身体抬高倾斜。用75%酒精喷洒超声耦合剂瓶外表面以进行消毒（超声耦合剂本身为无菌状态）。
    注意：建议将超声动物平台的颅端朝向手术者。然而，颅端或尾端是否朝向手术者，应根据手术者感觉更舒适的方向来决定。
  2. 将微型压力计（压力导管）连接至数据采集装置和模数转换器。
    ​注意：如果条件允许，也可以使用压力-容积导管。此处 使用压力导管是因为实验室中的压力数据采集设备仅能采集压力数据，无法采集与容积相关的信息，尽管本研究中的超声心动图结果也可描绘左心室容积。清洁时，先将导管尖端在1%酶类清洁剂中预浸泡，随后保持其在生理盐水中浸泡。

2. 小鼠麻醉、手术器械准备及颈外动脉分离

注意：手术器械在使用前必须进行灭菌和高压灭菌处理。建议所有步骤均在无菌条件下进行。建议在成像操作前一天进行脱毛，以节省成像过程中的时间，尽量减少小鼠可能产生的不良应激反应，并保持胸部和四肢的清洁与干燥。

  1. 将小鼠放入诱导室中进行麻醉，诱导室连接至设定为4%异氟烷与0.8 L/min氧气混合的蒸发器。当小鼠入睡或尾夹反射消失后，将其从诱导室中取出。
  2. 将动物仰卧位放置在由加热垫加热的铜板上。将其鼻部连接至鼻罩，通过鼻罩输送1.5%异氟烷与0.8 L/min氧气的混合气体，以维持稳定的麻醉水平。
    注意：推荐使用铜板，因其易于清洁且防锈，但也可替换为其他类型的金属板。
  3. 在眼睛上涂抹眼用软膏，以防止麻醉期间角膜干燥，并用胶带将四肢固定在铜板上。使用脱毛膏去除颈部和胸部的毛发。用浸有聚维酮碘的棉签以画圈方式擦拭脱毛区域三次，随后用浸有75%酒精的棉签重复三次，以实现手术区域的充分无菌。然后，用无菌手术巾覆盖 动物身体，仅留出一个窗口以便接触手术区域。
  4. 准备必要的手术器械，包括各种镊子和剪刀（图2A；参见材料表）。
  5. 使用手术刀在颈部下颌与胸骨之间做一条长约1 cm的纵向正中切口。
  6. 使用两对镊子钝性分离左右两侧甲状腺组织。用弯头精细镊子分离右侧气管旁区域的胸骨舌骨肌及脂肪组织，尽可能充分暴露颈总动脉（RCCA）。操作过程中应始终避免损伤迷走神经，以免引起低血压、心动过缓甚至死亡（图2B）。

3. 在超声引导下经右颈总动脉和升主动脉插管

  1. 将两根约5 cm长的6-0丝线穿过血管下方。用其中一根丝线在右侧颈总动脉（RCCA）远端打一个紧结进行结扎，并将紧结的两端固定在动物头部附近，以保持RCCA的轻微张力。此操作有助于后续步骤中的插管。
  2. 用第二根丝线在RCCA近端打一个松结。此举可使RCCA的封闭段充满血液，便于切开。
  3. 使用小型镊剪在紧结近端1-2 mm处剪出一个楔形开口，以打开RCCA。确保切口大小适中，既不过小而难以插入导管，也不过大导致插入时血管破裂。
    注意：强烈建议在显微镜下进行切开。用26 G针头在血管上刺一个小孔是另一种可选方法。
  4. 准备一根内含金属导丝的塑料导管（图2C）。用长柄弯头结扎钳撑开切口，将带有金属导丝的塑料导管插入RCCA，并向前推进至松结处。
  5. 松开松结，继续推进导管和导丝约2 cm。将放置动物的铜板转移至超声动物平台，于小鼠颈部和胸部涂抹超声耦合剂，然后在超声引导下小心地将导管和导丝经RCCA推进至升主动脉。
    注意：在超声检测过程中，应使用无菌敷料保护开放的切口。

4. 在超声引导下穿刺主动脉瓣

  1. 在塑料导管和金属导丝到达主动脉口之前，以彩色多普勒模式和脉冲波多普勒模式采集基础超声数据。
  2. 在超声同时清晰显示升主动脉、左心室流出道、导管和导丝的情况下，当导管和导丝到达主动脉口时，将导丝尖端从导管中伸出，并穿刺主动脉瓣。图1).
    注意：当主动脉瓣穿孔时，外科医生应能感知到这一破裂。
  3. 稍将导管和导丝从主动脉口回撤，并在穿刺主动脉瓣后，以彩色多普勒模式和脉冲波多普勒模式采集穿孔后的超声数据。反流血流 在彩色多普勒模式下，主动脉弓处的血流于心脏舒张期呈红色，可通过脉冲波多普勒模式进行定量确认。
  4. 将主动脉血流的舒张期峰值流速（PSVa）在300-500 mm/s之间视为满意。若血流反流程度不满意，则重复步骤4.2。
  5. 可选：在主动脉瓣穿孔前和穿孔后立即使用微型压力计，以进一步确认反流的存在。检测时可见主动脉舒张末期压力（AEDP）降低，且主动脉脉压增加约20 mmHg。
    ​注意：关于如何使用微型压力计导管进行有创左心室血流动力学测量的详细描述，已在其他文献中得到精辟阐述。10,11.

5. 撤出塑料导管和金属导丝，以及围手术期护理

  1. 确认主动脉瓣穿刺成功后，移除超声耦合剂，并用无菌纱布或纸巾将小鼠擦干，然后在结扎右颈总动脉之前，小心撤出带有中心金属丝的塑料导管。
  2. 使用5-0丝线以连续缝合方式闭合皮肤。皮下注射美洛昔康（0.13 mg/kg）以镇痛，并将小鼠置于温暖的恢复笼中，侧卧于无粘连表面（如纸巾或蓬松木屑）上。

6. 假手术

  1. 按照所述执行第1-3节。对于假手术小鼠，在不破坏主动脉瓣的情况下，执行与第4节类似的步骤。
  2. 按照所述执行第5节，但假手术小鼠中不应出现任何主动脉瓣反流（AR）。

利用超声心动图和有创血流动力学测量评估主动脉瓣穿孔、心脏形态及功能

  1. 经过4周的AR后，采用超声心动图B模式、彩色多普勒模式和脉冲波多普勒模式，在主动脉弓切面评估主动脉弓血流，并根据步骤4.1及其他相关步骤测量PDVa1,12.
  2. 采用超声心动图B模式和M模式，在胸骨旁长轴切面评估左心室（LV）大小和收缩功能，测量左心室舒张末期内径（LVEDD）和收缩末期内径（LVESD）、左心室后壁舒张末期厚度（LVPWTd）和收缩末期厚度（LVPWTs），并计算左心室射血分数（LVEF）和缩短分数（LVFS）。
    注意：关于如何使用超声设备及调整超声图像视角的详细说明，此前已有 elegant 的描述12.
  3. 超声心动图成像后，以类似于步骤4.3及其他部分所述的方式进行有创血流动力学测量10记录最大收缩和舒张速率（+dp/dt 和 −dp/dt）。将微导管压力计插入左侧颈总动脉（LCCA，而非RCCA），因为右侧颈总动脉（RCCA）已在主动脉缩窄术中永久结扎。
  4. 侵入性血流动力学测量后，处死小鼠 通过 颈椎脱位。打开胸腔，先用10%甲醛灌注心脏，随后用0.9%氯化钠溶液冲洗，通过切断主动脉摘取心脏，并在左心耳下缘水平进行横向切片。使用光学显微镜采集图像。

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结果

为确保主动脉瓣反流（AR）造模成功，我们采用彩色多普勒和脉冲波多普勒超声心动图验证了反流性血流。在AR小鼠中，主动脉弓的彩色多普勒频谱显示术后即刻存在反流血流（红色），而假手术小鼠则无此现象（舒张期无血流；图3A）。与此一致，脉冲波多普勒结果显示AR小鼠的反流血流显著升高（图3B、C）。通过有创血流动力学测量进一步证实，与假手术组动物相比，AR小鼠的主动脉舒张末压（AEDP）明显降低，脉压（PP）相应升高（图3D–F）。术后2小时内围手术期死亡率约为15%，术后4周内的死亡率约为20%（已排除围手术期死亡；图4A）。左心室流出道的大体照片显示，AR小鼠的主动脉瓣出现穿孔，而假手术小鼠的瓣膜保持完整（图4B）。这些结果表明，小鼠AR模型已成功建...

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讨论

在小鼠中通过手术诱导主动脉瓣反流是一种技术上具有挑战性的新兴技术，但具有重要的转化研究意义。要掌握该技术，外科医生应事先至少熟悉小鼠的颈部和心脏解剖结构、小鼠操作技术以及超声心动图。具备有创血流动力学测量的操作经验将更有助益。为成功实施主动脉瓣反流手术，需特别关注若干关键步骤。

切开右侧颈总动脉（RCCA）是最关键的步骤。RCCA上的切口不宜过小，以免无法容纳塑料导管；也不宜过大，以防插入塑料导管时RCCA容易断裂。为满意地完成RCCA切开，应在剪切前将小型镊式剪刀略微张开。强烈建议在显微镜下进行此操作。

避免穿刺肾上腺中央动脉（RCCA）和升主动脉。当插入带有金属导丝的塑料导管时，容易穿破血管壁。 通过 右冠状动脉（RCCA）并送至主动脉口。RCCA和升主动脉穿孔将导致明显出血，大多数情况下动物会在术后1周内死亡。为避免此问题，应确保导丝前端不超过导管的开口端。此外，含导丝的导管在血管内推进时应极为轻柔。当遇到阻力时，术者应暂停前进，稍作回撤，然后再次轻柔推进。

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（81941002、82170389、82170255、81730009、81670228 和 81500191）、上海市科学技术委员会实验动物科学基金（201409004300 和 21140904400）、上海市浦东新区卫生健康委员会卫生科技项目（PW2019A-13）以及"曙光"上海东方医院优秀青年医学 人才计划（2019xrrcjh03）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
铜板JD.com Inc.定制建议尺寸为 20 × 15 cm 或更大
弯血管钳66 Vision Tech53324A用于牵拉并分离肌肉、组织和血管
加热垫JD.com Inc.长治 55用于加热铜板和小鼠
长柄弯血管钳MECHENICTS-15用于牵拉血管
金属丝（不锈钢）JD.com Inc.直径 0.18 mm与塑料导管配合使用，用于穿刺主动脉瓣
持针器上海金钟131110用于皮肤缝合
塑料导管Anilab software & instrumentsPE-0402与金属丝配合使用，用于穿刺主动脉瓣
压力导管Millar InstrumentsSPR 835规格为 1.4F
压力数据采集装置及模拟/数字转换器AD InstrumentsLabchart 5与压力导管连接
手术剪苏州世强Stronger 13Cr用于剪开皮肤
小组织剪上海金钟YBE030用于剪切血管
体视显微镜奥林巴斯公司SMZ845用于血管切开和插管  
直血管钳66 Vision Tech53320A用于牵拉并分离肌肉、组织和血管
Tergazyme 酶促清洗剂Alconox, Inc.13051.0清除导管上的蛋白质物质、组织和血液
镊子苏州世强5307B用于夹持并牵拉皮肤和肌肉
超声耦合剂PARKERAquasonic-100用于传递超声信号
超声成像系统VisualSonics2100包含 B 模式、M 模式、彩色多普勒和脉冲波多普勒
麻醉蒸发器RWD Life ScienceR540用于麻醉

参考文献

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