需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

胫骨骨折-钢针固定模型：一种具有临床相关性的骨科损伤小鼠模型

2.3K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/63590

⸱

2022年7月28日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, Perioperative and Pain Medicine, Stanford University School of Medicine, 2Neurosciences Graduate Program, Stanford University School of Medicine

本文内容

摘要

胫骨骨折-髓内钉模型是一种具有临床相关性的骨科创伤模型，包含单侧开放性胫骨骨折、髓内钉内固定以及胫骨前肌的同时损伤。该模型中的热敏感性可通过45秒热板实验范式进行测量。

摘要

胫骨骨折-髓内针模型是一种骨科创伤与手术的小鼠模型，能够重现人类此类损伤中出现的复杂肌肉、骨骼、神经及结缔组织损伤。该模型的建立是因为既往的骨科创伤模型未包含多种组织类型（骨骼、肌肉、神经）的同时损伤，因而不能真实反映人类复杂的骨科创伤情况。因此，作者对既往骨科创伤模型进行了改进，建立了胫骨骨折-髓内针模型。该改良骨折模型包括单侧开放性胫骨骨折、髓内钉（IMN）内固定以及同时发生的胫前肌（TA）损伤，导致机械性异常性疼痛可持续至伤后5周。本系列实验方案详细阐述了实施这一临床相关性较强的骨科创伤胫骨骨折-髓内针模型的具体步骤，随后采用改良热板实验检测骨科损伤后的伤害性感受变化。总体而言，这些详细且可重复的实验方案将有助于疼痛研究者拓展研究骨科创伤诱导性疼痛的工具集。

引言

每年全球约有5亿人遭受损伤，其中骨科创伤占所有损伤的25%1,2,3。骨科创伤常伴随复杂的肌肉、骨骼、神经和结缔组织损伤，需要住院并接受手术以确保充分康复3,4。骨科创伤后的急性和慢性疼痛可导致显著的身体、心理和经济负担，影响患者的生活质量1,4。此外，用于稳定和固定骨折的骨科手术本身也常伴随严重的术后急性和慢性疼痛5,6,7,8,9。

为了开发更有效的治疗方法，需要更深入地理解急性和慢性创伤相关性疼痛的机制。为此，必须建立可靠、可重复且具有临床相关性的临床前模型。由于大多数骨科创伤的动物模型并未同时涉及多种组织类型（如骨、肌肉、神经）的损伤，因此它们并不能真实反映人类复杂的骨科创伤情况，例如跌倒、机动车事故或战争相关损伤所导致的创伤10,11。因此，我们建立了胫骨骨折-钢针固定小鼠模型，以研究此类损伤的主要表现，包括骨与肌肉组织损伤以及急性和慢性疼痛11。该胫骨骨折-钢针模型包括单侧开放性胫骨骨折、髓内钉（IMN）内固定以及同时发生的胫前肌（TA）肌肉损伤。TA肌肉的组织学切片显示，损伤后肌肉出现病理改变，早在损伤后2周即可观察到致密纤维化形成，并伴随大量成熟肌纤维的丧失。此外，显微计算机断层扫描（microCT）显示，损伤后4周即可观察到骨折愈合组织（fracture callus）的形成，并持续进行重塑过程11。

在胫骨骨折-钢钉模型中，可采用多种反射性和非反射性行为检测方法来评估疼痛的感觉成分和情感成分。例如，可使用冯·弗雷细丝（Von Frey filaments）来证明该模型中的机械性痛觉过敏。事实上，小鼠在胫骨骨折-钢钉手术后，同侧后爪会出现持久的机械性痛觉过敏11。另一种特别有用的行为范式是热板实验，传统上用于测量动物对热刺激产生爪回缩反应的潜伏期。尽管该方法已使用数十年12，堪称临床前疼痛研究的金标准，但仅测量反射性行为存在局限性13。因此，我们开发了一种改良的热板实验范式，可在热刺激条件下同时捕捉反射性和非反射性反应的特征14。

这种改良的热板实验不仅测定初始反应潜伏期（与原始热板实验相同），还延长了观察时间，以记录额外的伤害性行为。通过将这些延长出现的行为分为不同类别（抽搐、舔舐、保护性抬肢、跳跃），可以捕捉对热刺激的非反射性反应。抽搐是指足爪快速抬起和/或脚趾伸展，但肢体迅速放回热板表面。后肢和前肢的舔舐或啃咬行为在分析中均归类为舔舐。保护性抬肢是指在伤害性传入信息结束后，肢体仍持续抬离热板。最后，跳跃是指四肢完全离开热板表面。这些行为可分别进行分析，并在分组分析时需特别注意仍要记录初始反应潜伏期。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本研究中使用的所有方法均按照美国兽医协会指南和国际疼痛研究协会的规定，经斯坦福大学实验动物护理管理小组委员会（APLAC #33114）批准并合规实施。小鼠（C57BL/6J，到达时9-11周龄，研究开始时11-12周龄）每笼饲养2-5只，在温度受控的环境中维持12小时光照/12小时黑暗循环，并可自由获取食物和水。ad libitum 指自由摄食和饮水。雄性小鼠在研究开始时体重约为25 g。有关本研究中使用的所有材料的详细信息，请参见材料表。

1. 基线行为学测量

  1. 由于小鼠在热板实验中学习速度很快，因此在本实验中不要记录小鼠的基线值，而应将小鼠与未受伤的对照组进行比较。

2. 麻醉/准备

  1. 使用吸入式异氟烷（2%-4%）对小鼠进行麻醉。
  2. 用镊子夹捏小鼠脚趾，通过脚趾夹捏反射的消失来确认麻醉深度。
  3. 在小鼠眼睛上充分涂抹眼用润滑剂，以防止麻醉期间眼睛干涩。
  4. 在小鼠身下垫一块纱布，并使用电动剪毛器将右后肢从足部至膝关节处的毛发剪除。
  5. 用纱布清理手术区域的毛发，然后丢弃该纱布。
  6. 使用浸有碘溶液的棉签对手术区域进行消毒。

3. 手术

  1. 清洁手术区域并确认麻醉深度后，使用手术刀在右腿内侧从胫骨远端至近端做皮肤切口，止于膝关节下缘水平（图1A）。
  2. 使用棉签干燥手术区域，特别注意胫骨近端部位。
  3. 使用配备0.6 mm圆形磨头钻头的钻机，在胫骨结节水平的胫骨近端钻孔，位置约位于关节线远端2 mm处（图1B）。
  4. 随后将27 G针头经此孔/截骨处沿骨髓腔轴线插入骨内以建立通道，然后拔出针头（图1B）。
  5. 接下来，从外侧在胫骨中段与远端三分之一交界处（约距截骨位点远端5–6 mm）用骨锯划痕，造成胫前肌损伤（图1D）。
    关键步骤：若采用内侧入路进行骨折操作，则不会引起肌肉损伤。
  6. 用钳子夹住胫骨近端，以拇指和食指握住胫骨远端，施加反向压力完成骨折（图1C）。
  7. 重新将27 G针头插入髓腔，经胫骨近端穿过骨折部位，推进至骨的远端节段以实现骨折复位。
    注：在不宜使用金属的成像应用中，可选用尺寸相似的陶瓷植入物替代27 G针头。虽然本实验未实施，但可考虑使用陶瓷螺钉作为潜在植入物（见材料表）。
  8. 然后使用剪钳将针头/塑料植入物修剪至与胫骨皮质齐平。
  9. 清除任何血液，并确认出血已停止后再继续操作。
  10. 出血停止后，使用间断的5-0丝线缝合伤口。
    关键步骤：手术过程中任何时候均不得让动物无人看护。应持续观察动物直至其能够自主活动，并仅在其完全恢复后方可将其归还同笼动物。

4. 术后

  1. 术后根据本机构方案，通过皮下注射给予小鼠布托啡诺 0.05 mg kg-1，每日两次，持续两天。
  2. 在麻醉后恢复期及整个研究期间对小鼠进行监测：前两天每日两次，之后每日一次持续至三周，此后每周一次。
  3. 观察小鼠是否出现提示严重应激或疾病的行為变化，例如嗜睡、毛发竖立或体重减轻 >20%。注意记录任何与活动能力以及获取食物或饮水相关的问题。
    ​注意：手术及术后护理记录必须在手术后及每次检查后填写，并长期保存，以备机构动物护理与使用委员会审查。

5. 热板测试

注意：胫骨骨折-钢钉手术后 7 天可开始进行损伤后测量。为避免学习效应对此范式的影响，手术后仅进行一次测试，并与未损伤的对照组进行比较。

  1. 设置
    1. 将热板放置在顶部照明的环境中，并将塑料圆筒居中置于热板上。
    2. 将温度设定为 50 °C，并在热板前方放置一台相机，注意确保整个封闭区域均在视野范围内。
      关键点：本研究使用了一台标准的 8 位彩色工业相机，最高可录制 76 帧/秒的视频。
  2. 检测
    1. 将小鼠放入测试房间至少 30 分钟以适应环境。
      注意：确保测试房间温度不过高或过低，以免影响实验结果。
    2. 将小鼠放入圆筒中并开始录像。
    3. 从小鼠足部首次接触热板开始，记录其运动行为 45 秒。
    4. 在保持每次试验温度一致的前提下，对队列中的其余小鼠重复步骤 5.2.1–5.2.3。
    5. 测量首次反应（通常为缩足）的潜伏期（以秒为单位），这是经典的热板实验结果。
      注意：本实验室开发的以下方案额外对反射性行为（如缩足）和非反射性行为（如舔足、护足和跳跃）进行评分。
  3. 分析
    1. 使用带有毫秒级时间戳的视频播放程序对热板实验录像进行行为评分。
      1. 建议在 Mac OS 系统上使用 NCH Prism 软件。可从网上免费下载该软件（参见 图 2 和 材料表）。
      2. 下载完成后，打开程序并点击 继续使用试用版本 选项。然后点击绿色的大加号以上传热板录像文件。
      3. 上传后，双击单个文件以视频格式打开。利用窗口底部的光标缓慢拖动浏览整个视频，并开始进行行为评分。
        ​关键点：无论使用何种软件，务必在尽可能大的窗口中观看视频，以避免在拖动时间戳光标时损失时间分辨率。
    2. 按以下方式设置电子表格。
      1. 为正确运行所提供的 R 脚本，请严格按照下列顺序和格式输入列标题，不得使用大写字母或空格：mouseid, behavior, start, end。
      2. 在“start”和“end”列中以秒为单位输入时间，保留三位小数，不加前导零或冒号（例如：2.001）。
    3. 针对每段视频，记录每一次疼痛相关行为的发生（精确到 毫秒）。请注意，仅记录后肢出现的疼痛行为。不得记录两只 前肢 的行为。
      1. 将缩足/抖动行为简单记为 "flinching,"，包括足部快速回缩和/或脚趾张开，但肢体很快重新放回热板上，前提是小鼠未处于探索或行走状态。即使未完全抬起足部，仅出现脚趾张开的动作也应记为缩足。 不得将单次缩足/抖动行为记录超过 500 ms。若出现此类情况，请尽可能缓慢地拖动光标仔细检查，因为该时间段内可能包含多次缩足和/或护足行为。
      2. 观察肢体在伤害性传入信号结束后仍长时间抬高或保护的情况，并将其记为 guarding（护足）。
      3. 将后肢舔舐或啃咬行为记为 licking（舔足）。
      4. 将四肢同时离开热板的行为记为 jumping（跳跃）。
        注意：若小鼠先出现缩足，随后在足部抬起期间继续表现出舔足或护足行为，则应将这些行为分开记录，不得在时间戳上重叠。为每个实验组分别创建独立的电子表格。
    4. 使用提供的 R 脚本开始数据分析。
      1. 使用 "Behavior_Raster_v2.R" 生成点阵图（如图所示），用于可视化整体行为模式。
      2. 使用 "Behavior_duration.R" 向工作目录输出一个包含五个工作表的电子表格。
        注意：第一个工作表提供所有疼痛行为的总持续时间、首次疼痛行为的潜伏期以及疼痛行为的总次数；后续每个工作表分别提供各单一疼痛行为的对应信息。
      3. 使用 "Behavior_bins.R" 输出两个电子表格；其中一个以 500 ms 为时间窗，显示每个时间点行为的累积持续时间，另一个则显示每只小鼠行为持续时间曲线下的面积。
      4. 最后，使用 "Cumulative_Sums.R" 输出两个关于行为累积求和的电子表格。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

胫骨骨折-钢针固定正交创伤模型可重现复杂人体损伤中出现的骨骼、肌肉及类似疼痛的行为表现。如图1C所示，胫骨骨折随时间逐渐愈合，在骨折部位形成骨痂，伤后4周仍可见。由于上述步骤3.5中所述的外侧入路使用骨锯操作，胫骨前肌受到损伤，发生广泛性纤维化，表现为组织内胶原沉积显著增加（图1D）。后肢足底敏感性显著升高，表现为对机械刺激的阈值降低，该现象在损伤后至少持续5周11。此外，我们引入了新型的非反射性检测方法，以更全面地探究外周损伤后的类似疼痛行为14,15。如图3所示，正交创伤损伤导致反射性退缩反应以及非反射性行为（舔舐、保护性姿态）增加。需注意的是，在某些情况下，小鼠还会出现跳跃行为，该行为被视为非反射性行为。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

方案中的关键步骤
在整个手术过程中，必须保持无菌条件。此外，手术前、手术中及手术后的动物护理对于成功建立模型至关重要。如方案前面所述，在进行手术时，应从外侧折断骨骼，以确保肌肉损伤。注意不要在过低的位置折断胫骨（低于建议的胫骨中段与远端三分之一交界处），因为这会影响骨骼的骨折方式、研究人员使用钢针固定骨折的可行性以及骨折的愈合过程。

为了进一步确保临床前研究结果能够转化为具有临床应用价值的治疗方法，必须将胫骨骨折-钢针固定模型与具有明确人类对应指标的结局评估方法相结合。采用上述改良的热板实验，可以观察到啮齿类动物在慢性疼痛模型下对温度敏感性的变化。患有慢性病理状况的个体通常会报告在温度变化时敏感性增加并伴有疼痛。温度升高可能导致炎症加剧，并影响组织的膨胀与收缩。因此，鼓励所有临床前研究人员在设计用于评估术后急性和慢性疼痛的研究方案时考虑采用这些方法。从改良热板实验中获得可靠且可重复结果的一个重要环节是，在回看视频时遵循严格的个体行为判定规程。我们为新研究人员制定了高度规范化的视频回看培训流程，并要求他们在独立进行视频评分前，必须达到预定...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无相关利益冲突需要披露。

致谢

GM 获得美国国家科学与工程研究生奖学金（NDSEG Graduate Fellowship）和斯坦福 Bio-X 荣誉研究生奖学金的支持。VLT 获得美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所资助 #GM137906 和丽塔·艾伦基金会的支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
27 G 针头Medsitis305136https://medsitis.com/products/bd-precisionglide-27-g-x-1-1-4-hypodermic-needles-305136?variant=39724583299
5-0 缝合线esutureSN5668https://www.esutures.com/product/0-in-date/2-/132-/16552-medtronic-monosof-black-18-p-11-cutting-SN5668/
酒精棉片AmazonB00VS4F91Whttps://www.amazon.com/Dynarex-Alcohol-Prep-Sterile-Medium/dp/B00VS4F91W
替代钻头Rio Grande341602https://www.riogrande.com/product/BuschTungstenVanadiumRoundBur
Set0314mm/341602
骨锯钻头附件AmazonB07DSXR3NYhttps://www.amazon.com/dp/B07DSXR3NY
丁丙诺啡Fidelis Pharmaceuticalshttps://ethiqaxr.com/ordering/
陶瓷植入物（替代钢针）RISystemRIS.221.103https://risystem.com/platefixation/mousescrew
Chux 吸水垫Fisher ScientificNC0059881https://www.fishersci.com/shop/products/underpad-17x24-chux-300-cs/nc0059881#?keyword=true
C57BL/6J 小鼠The Jackson LaboratoryJax #00664https://www.jax.org/strain/000664
棉签UlineS-18991https://www.uline.com/Product/Detail/S-18991/First-Aid/Cotton-Tipped-Applicators-Industrial-6
剪线钳AmazonB076XYVS6Yhttps://www.amazon.com/iExcell-Diagonal-Cutting-Nippers-Chrome-Vanadium/dp/B076XYVS6Y
钻机Chewy129044https://www.chewy.com/dremel-cordless-dog-cat-rotary-nail/dp/156127
钻头AmazonB00HVIGSX2https://www.amazon.com/Universal-Diamond-Dremel-Rotary-Tool/dp/B00HVIGSX2
电动剃毛器Kent ScientificCL9990-KIThttps://www.kentscientific.com/products/trimmer-combo-kit/
眼用润滑膏AmazonB07H2NLCX5https://www.amazon.com/OptixCare-Lube-Plus-Hyaluron-Horses/dp/B07H2NLCX5
纱布垫 2" x 2"AmazonB07GHDTB53https://www.amazon.com/Covidien-Curity-Sterile-Peel-Back-Package/dp/B07GHDTB53
纱布垫 4" x 4"AmazonB00KJ6YFTChttps://www.amazon.com/Covidien-6309-Curity-Gauze-Pads/dp/B00KJ6YFTC
高清摄像机The Imaging SourceDFK 22AUC03https://www.theimagingsource.com/products/industrial-cameras/usb-2.0-color/dfk22auc03/?adsdyn&gclid=Cj0KCQiA3-yQBhD3ARIsAHuHT64uIIlImBvh_
toh-3GFSgBcL_fRc1gQTDyXlqDEa
Qu4n2_VbWEiRuIaAiueEALw_wcB
吸入式麻醉系统Kent Scientifichttps://www.kentscientific.com/products/vaporizer-with-vetflo-single-channel-anesthesia-stand/
碘溶液AmazonB005FR7XIKhttps://www.amazon.com/Dynarex-Povidone-Iodine-Scrub-Solution/dp/B005FR7XIK
碘伏棉签棒AmazonB001V9QKMGhttps://www.amazon.com/POVIDONE-IODINE-SWAB-1202-25Box/dp/B001V9QKMG
异氟烷California pet pharmacyhttps://www.californiapetpharmacy.com/fluriso-isoflurane-250ml.html
NCH Prism 软件https://www.nchsoftware.com/prism/index.html
塑料圆筒AmazonB08R5KM5B6https://www.amazon.com/FixtureDisplays-Acrylic-Diameter-Thickness-15140-8-NPF/dp/B08R5KM5B6
生理盐水Fisher ScientificNC9054335https://www.fishersci.com/shop/products/saline-injection-0-9-10ml/NC9054335
手术刀片Fisher Scientific12-000-162https://www.fishersci.com/shop/products/high-precision-10-style-scalpel-blade/12000162#?keyword=
手术刀柄AmazonB0056ZX1R8https://www.amazon.com/Swann-Morton-Scalpel-Handle-blades/dp/B0056ZX1R8
热板偏好实验装置BIOSEBBIO-T2CThttps://www.bioseb.com/en/pain-thermal-allodynia-hyperalgesia/897-thermal-place-preference-2-temperatures-choice-nociception-test.html

参考文献

  1. Edgley, C., et al. Severe acute pain and persistent post-surgical pain in orthopaedic trauma patients: a cohort study. British Journal of Anaesthesia. 123 (3), 350-359 (2019).
  2. Pointer, S. Trends in Hospitalised Injury, Australia: 1999-00 to 2010-11. Australian Institute of Health and Welfare. , (2013).
  3. James, S. L., et al. Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990–2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
  4. Shen, H., Gardner, A. M., Vyas, J., Ishida, R., Tawfik, V. L. Modeling complex orthopedic trauma in rodents: Bone, muscle and nerve injury and healing. Frontiers in Pharmacology. 11, 620485(2021).
  5. Gerbershagen, H. J., et al. Pain intensity on the first day after surgery: A prospective cohort study comparing 179 surgical procedures. Anesthesiology. 118 (4), 934-944 (2013).
  6. Clay, F. J., Watson, W. L., Newstead, S. V., McClure, R. J. A systematic review of early prognostic factors for persisting pain following acute orthopedic trauma. Pain Research and Management. 17 (1), 35-44 (2012).
  7. Williamson, O. D., et al. Predictors of moderate or severe pain 6 months after orthopaedic injury: A prospective cohort study. Journal of Orthopaedic Trauma. 23 (2), 139-144 (2009).
  8. Friesgaard, K. D., et al. Persistent pain is common 1 year after ankle and wrist fracture surgery: a register-based questionnaire study. British Journal of Anaesthesia. 116 (5), 655-661 (2016).
  9. Holmes, A., et al. Predictors of pain severity 3 months after serious injury. Pain Medicine. 11 (7), 990-1000 (2010).
  10. Guo, T. -Z., et al. Immobilization contributes to exaggerated neuropeptide signaling, inflammatory changes, and nociceptive sensitization after fracture in rats. The Journal of Pain. 15 (10), 1033-1045 (2014).
  11. Tawfik, V. L., et al. Angiotensin receptor blockade mimics the effect of exercise on recovery after orthopaedic trauma by decreasing pain and improving muscle regeneration. The Journal of Physiology. 598 (2), 317-329 (2020).
  12. Deuis, J. R., Dvorakova, L. S., Vetter, I. Methods used to evaluate pain behaviors in rodents. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 284(2017).
  13. Porreca, F., Navratilova, E. Reward, motivation, and emotion of pain and its relief. Pain. 158, Suppl 1 43-49 (2017).
  14. Corder, G. F., et al. Loss of mu-opioid receptor signaling in nociceptors, and not spinal microglia, abrogates morphine tolerance without disrupting analgesic efficacy. Nature Medicine. 23 (2), 164-173 (2017).
  15. Huck, N. A., et al. Temporal contribution of myeloid-lineage TLR4 to the transition to chronic pain: A focus on sex differences. Journal of Neuroscience. 41 (19), 4349-4365 (2021).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

视频即将推出
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。