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方法文章

一种无需测序的RNA编辑快速检测方法

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DOI：

10.3791/63591

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2022年4月21日

 ,  , 
1Department of Bioscience and Biotechnology, Japan Advanced Institute of Science and Technology, 2BioSeeds Corporation, JAIST Venture Business Laboratory, Ishikawa Create Labo

本文内容

摘要

在基因组水平上快速检测并可靠定量RNA编辑事件仍然具有挑战性，目前主要依赖直接RNA测序方法。本文所述方案采用微温度梯度凝胶电泳（µTGGE）作为一种简单、快速且便携的RNA编辑检测方法。

摘要

RNA编辑是一种导致RNA转录后序列发生改变的过程。RNA编辑的检测与定量主要依赖于Sanger测序和RNA测序技术。然而，这些方法可能成本较高且耗时较长。在本实验方案中，采用一种便携式微温度梯度凝胶电泳（µTGGE）系统，作为无需测序即可快速检测RNA编辑的方法。该方法基于电泳原理，在核酸样品穿过聚丙烯酰胺凝胶的过程中，利用高温使其变性。在不同温度范围内，DNA片段会呈现出从完全双链DNA到部分解离的链，最终变为完全分离的单链DNA的梯度状态。含有不同核苷酸碱基的RNA编辑位点在µTGGE分析中会产生不同的熔解曲线特征。我们利用基于µTGGE的方法，对四个已编辑RNA片段与其相应的未编辑（野生型）片段之间的熔解曲线差异进行了表征。通过比较编辑与未编辑RNA所产生的条带模式，计算出模式相似性评分（PaSSs），用于评估该方法的可重复性。总体而言，本文所述平台能够以直接、简便且经济高效的方式检测RNA中的单碱基突变。预计该分析工具将有助于推动分子生物学领域的新发现。

引言

基因组RNA中的单核苷酸变异（SNVs），包括A-to-I、C-to-U和U-to-C变异，可能指示RNA编辑事件。然而，RNA中SNVs的检测仍是一项技术上具有挑战性的任务。传统上，编辑型与非编辑型RNA的比例通过直接测序、等位基因特异性实时聚合酶链式反应（PCR）或变性高效液相色谱（HPLC）方法来确定1,2,3,4,5,6。然而，这些方法在时间和成本效益方面并不理想，且由于噪声水平较高导致准确性较低，从而构成了基于RNA的SNV检测的技术瓶颈7,8。本文介绍一种基于温度梯度凝胶电泳（TGGE）的技术方案，用于鉴定单核苷酸多态性（SNPs），作为一种替代方法，可避免在RNA编辑分析中使用直接RNA测序。

电泳是生命科学实验室中用于分离和分析生物大分子的首选方法。温度梯度凝胶电泳（TGGE）能够分离长度相同但序列不同的双链DNA片段。该技术依赖于DNA片段因序列差异导致的熔解温度不同，以及其在具有线性温度梯度的多孔凝胶中迁移能力随之发生的变化9,10。DNA片段的熔解会产生特定的熔解曲线。当某一结构域的最低熔解温度达到凝胶中某一特定位置对应的温度时，DNA分子将从螺旋结构转变为部分熔解的结构，其迁移几乎停止。因此，TGGE同时利用了DNA片段的迁移率（大小信息）和温度诱导的结构转变（序列依赖性信息），使其成为表征DNA片段的有力手段。TGGE熔解图谱中的特征点对应DNA分子的三种结构转变，分别为链起始解离点、链中间解离点和链末端解离点（图1）。结构域内的序列变异，即使仅存在单碱基差异，也会影响其熔解温度，因此不同序列的分子在TGGE分析中会呈现出不同的熔解（变性）图谱。因此，TGGE可用于分析基因组RNA中的单核苷酸变异（SNV），并可作为一种极具价值的高通量RNA编辑检测方法。然而，若采用传统的基于凝胶电泳的TGGE，则会丧失其高通量优势。相比之下，一种微型化的TGGE技术——微流控温度梯度凝胶电泳（microTGGE，µTGGE）——可显著缩短电泳时间，使分析效率提高100倍11。随着PalmPAGE12的引入，µTGGE方法的简便性和紧凑性进一步提升；PalmPAGE是一种适用于现场操作、手持式且价格低廉的凝胶电泳系统。

本研究采用一种基于变性梯度凝胶电泳（TGGE）的新方案，检测四种基因中的三类RNA编辑位点（A-to-I、C-to-U和U-to-C），其中包括来自拟南芥（Arabidopsis thaliana）组织的两个基因以及在哺乳动物HEK293细胞中表达的两个基因（图1A）。该方案结合使用PalmPAGE（硬件）——一种用于快速检测RNA编辑的便携式系统，以及uMelt（软件）13。该方法平均运行时间为15–30分钟，无需依赖直接RNA测序技术，即可实现对RNA编辑的快速、可靠且简便的鉴定。

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方案

1. 目标片段的优化

注意：本实验方案的开发使用了四个经过编辑的基因，包括来自拟南芥（A. thaliana）的两个核基因（AT2G16586 和 AT5G02670），以及在 HEK293 细胞中表达的编码蓝色荧光蛋白（BFP）和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的基因。

  1. 为了识别具有不同熔解曲线特征的基因片段（代表编辑区域与非编辑区域），使用基于网络的 uMelt HETS 工具（原始 uMelt 软件的扩展版本）生成预测的熔解曲线13。
    注意：该工具可预测异源双链和同源双链产物的熔解曲线形状。
  2. 针对每个目标基因，设计三对基因片段（长度为 300–324 bp）。每对包含一个含有编辑位点的片段和一个对应的含有非编辑位点的野生型片段，分别位于 5'-末端、中间位置或 3'-末端。
  3. 选择在螺旋度轴上熔解区域差异最大的非编辑/编辑片段对，用于后续分析。对于 µTGGE 分析，通过 PCR 扩增合成所选基因片段，具体操作见下文第 2 节。
  4. 使用 DNADynamo 软件（https://www.bluetractorsoftware.com/DynamoDemo.htm） 设计正向和反向引物，并利用 NCBI Primer-BLAST 工具进行验证。
  5. 将引物稀释于 TE 缓冲液（含 1 mM EDTA·Na2 的 10 mM Tris-HCl）中，储存浓度为 100 pmol/µL。使用前，用蒸馏水将每对引物稀释至 10 pmol/µL 的工作浓度。

2. 目标片段的RNA提取与RT-PCR扩增

  1. RNA 提取
    1. 使用标准方法（如 TRIzol 提取法14 或市售试剂盒）从经编辑和未经编辑基因的来源中提取总 RNA。
    2. 按照步骤 2.2 所述的标准 RT-PCR 方案，进行相应 cDNA 的合成。
  2. 逆转录
    1. 向无核酸酶的微量离心管中加入 1 µL 寡聚(dT)引物、1 µL 10 mM dNTP 混合物、10 µL 总 RNA 和 10 µL 无菌去离子水。
    2. 在 65 °C 加热 5 分钟，然后置于冰上孵育至少 1 分钟。
    3. 以最大速度（12,000 x g）离心 2–3 秒收集管内液体，并加入 4 µL 5x ReverTra Ace 缓冲液、1 µL 0.1 M DTT 和 1 µL M-MLV（Moloney 小鼠白血病病毒）逆转录酶（200 U/µL，材料表）。
    4. 轻轻吹打混匀。若使用随机引物，则在 25 °C 孵育 5 分钟。
    5. 在数字干浴仪/金属块加热器中于 55 °C 孵育 60 分钟，随后在 70 °C 加热 15 分钟以终止反应。
    6. 使用分光光度计测定 cDNA 浓度，并于 -25 °C 保存。
  3. PCR 扩增及产物的验证性测序
    1. 向无核酸酶的微量离心管中加入以下试剂：4 µL 5x Taq 聚合酶缓冲液、2 µL 2 mM dNTP 混合物、2 µL 25 mM MgCl2、1.6 µL 引物对（正向和反向；各 10 mM）、2 µL cDNA 模板、0.1 µL Taq 聚合酶（2.5 U/µL）和 8.3 µL 无菌去离子水（终体积为 20 µL）。
    2. 进行 PCR 扩增，循环条件如下：95 °C 预变性 2 分钟；35 个循环（95 °C 变性 2 分钟，退火温度根据所用特异性引物对而定，退火 30 秒，72 °C 延伸 2 分钟）；最后在 72 °C 延伸 7 分钟。
    3. 为纯化 PCR 产物，加入 2 U 外切酶 I 和 0.5 U 虾碱性磷酸酶（ExoSAP）。将反应管置于热循环仪中，37 °C 孵育 1 小时，随后 80 °C 孵育 15 分钟，然后保持在 4 °C 直至进行下一步操作。
    4. 用于验证性测序时，取新微量离心管，加入 11.5 µL 无菌去离子水、2.5 µL 正向或反向引物以及 1 µL 经 ExoSAP 处理的 PCR 产物。
      ​注：使用 DNA 测序服务（例如 Eurofins Genomics）进行测序分析。
    5. 为验证 PCR 产物的特异性，需分别使用正向和反向引物进行测序。代表性分析中所用引物对见表 1。
    6. 用去离子水将纯化的 PCR 产物稀释至浓度为 200 ng/µL。随后，在 250 µL 管中将 6 µL 纯化产物与 3 µL 6x 上样缓冲液混合，并用无菌水补足总体积至 12 µL。将 PCR 产物于 -25 °C 保存，待进行后续 µTGGE 分析。

3. µTGGE 分析

注意：µTGGE 分析使用一种小型化且经济的系统进行。完整的系统概览如图2所示，包括凝胶盒、凝胶盒支架、水平凝胶电泳平台、电源和凝胶成像系统。

  1. 凝胶板的组装
    1. 用于µTGGE分析的凝胶板如图2A所示。该设计包含三块1英寸的凝胶板：底部凝胶板、顶部凝胶板和加样孔成型板。将顶部凝胶板夹在另外两块板之间，并将其组装到凝胶板架中以进行凝胶聚合。
  2. 聚丙烯酰胺凝胶的制备
    1. 将7.2 g尿素加入50 mL离心管中，用10 mL无菌水溶解。将样品在微波炉中加热20–30秒，然后冷却至室温（RT）。
    2. 向溶液中加入3 mL 5x Tris/硼酸/EDTA（TBE）缓冲液（材料表）、2.25 mL 40%（w/v）丙烯酰胺/双丙烯酰胺（19:1）、75 µL 10x过硫酸铵和15 µL四甲基乙二胺。
    3. 立即缓慢将凝胶溶液倒入凝胶板架中，避免产生气泡。
  3. 使用µTGGE装置生成熔解曲线图谱
    1. 使用如图2所示的微型化、经济型µTGGE装置，设置垂直于DNA迁移方向的温度梯度（25–65 °C）。
    2. 将上下电泳缓冲液垫（0.5 cm × 2.5 cm）浸泡于2 mL 1x TBE缓冲液中。
    3. 将凝胶板放入水平电泳槽单元中，并按图2所示位置放置上下缓冲液垫。
    4. 随后，将10 µL PCR产物加入中间（较长）加样孔，每侧加样孔各加入1 µL PCR产物。
    5. 等待1分钟后，连接电源，施加100 V电压，运行12分钟，同时维持25–65 °C的线性温度梯度。
    6. 电泳结束后，取出凝胶板并移除上层玻璃盖。
    7. 向凝胶上加入300 µL 10x SYBR Gold染色液。使用掌上电泳装置内置的蓝光LED手电筒观察熔解曲线图谱。
      注意：应保存凝胶图像的电子文件，用于计算模式相似性评分（PaSS）。
    8. 每个电泳实验应重复3次，以确认数据的可重复性。

4. PaSS 计算

注意：计算使用 µTGGE Analyzer 软件进行。

  1. 下载并打开软件。
  2. 打开包含凝胶图像的 JPEG 文件。请注意，该软件仅支持 JPEG 格式的文件。
  3. 点击 Frame 按钮，并选择凝胶图像的相应区域（框选范围）。
  4. 点击 Coordinate Correction 按钮，并添加两个参考点，如 图 1B 所示。
  5. 点击 Addition of Feature Points 按钮，添加样本点，如 图 1B 所示。然后将处理后的凝胶图像数据保存为 µTGGE (*.tgg) 格式。
  6. 点击 Sample 按钮，并选择 Search for Simple Points 选项，以比较两张或更多图像。

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结果

利用微变性梯度凝胶电泳（µTGGE）鉴定RNA编辑事件中的单核苷酸碱基变化
本实验方案使用了四个经过编辑的基因（表1），包括在HEK293细胞中表达的BFP基因（由载脂蛋白B mRNA编辑酶复合物的脱氨酶APOBEC1介导的C-to-U RNA编辑15）、在HEK293细胞中表达的含有赭石终止密码子（TAA）的EGFP基因（由作用于RNA的腺苷脱氨酶ADAR1介导的A-to-I RNA编辑16），以及拟南芥（A. thaliana）中的两个核基因AT2G16586和AT5G0267017,18（发生U-to-C RNA编辑）。编辑样本与相应未编辑样本之间的单核苷酸差异均通过DNA测序确认。随后进行µTGGE分析，以检测各样本熔解曲线之间的差异（图3）。

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讨论

RNA 编辑在生物学中具有重要作用；然而，目前检测 RNA 编辑的方法（如色谱法和测序法）由于成本高、耗时长且操作复杂，面临诸多挑战。本文所述的方案是一种简单、快速且成本低廉的 RNA 编辑检测方法，采用基于便携式微尺寸 TGGE 的系统。该系统可在进行 Sanger 测序前区分已编辑与未编辑的基因。具体而言，可通过 TGGE 熔解曲线谱图的变化，区分存在单碱基核苷酸修饰的已编辑与未编辑基因。由于系统中凝胶用量仅为 1 in，所需样本量极小，且可快速检测序列间的差异。此外，本方案操作简便，无论是领域专家还是初学者均可轻松掌握。目标基因片段的优化对于清晰区分已编辑与未编辑区域至关重要，而本方案简化了这一优化过程。

本方案可与使用荧光标记引物的多重分析兼容。对于定量分析，未知RNA样品（经编辑或未编辑）可在TGGE分析过程中用绿色荧光标记，并与红色荧光标记的参考标准品（经编辑或未编辑）共迁移。

除了证明 µTGGE 方法能够检测单核苷酸 RNA 编辑事件外，我们还验证了使用 µTGGE 获得的实验结果与使用 uMELT 对同一基因...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究得到了日本科学促进会科研费（17H02204 和 18K19288）的资助。Ruchika 获得了日本政府（文部科学省奖学金）的经费支持。我们感谢 Ms. Radhika Biyani（JAIST，高木实验室）和 Dr. Kirti Sharma（BioSeeds 公司）在电泳相关实验中提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2U ExoITakara2650A外切核酸酶 I
40(w/v)%-丙烯酰胺/双丙烯酰胺 (19:1)Thermo fisherAM9022
过硫酸铵 (APS)Thermo Fisher17874
微量离心机 Mini spineppendorf5452000034
数字干浴器/金属浴加热器Thermo fisherNA
Gold Taq 聚合酶预混液PromegaM7122
LATaq DNA 聚合酶TAKARARR002ATaq 聚合酶
micro-TGGE 胶片夹持器BioSeeds Corp.BS-GE-CH
micro-TGGE 电泳装置Lifetech Corp.TG
micro-TGGE 凝胶盒BioSeeds Corp.BS-TGGE-C
NanoDrop 1000Thermo fisherND-1000分光光度计
植物 Rneasy 小量提取试剂盒Qiagen74904
ReverTra Ace 预混液TOYOBOTRT101M-MLV（莫洛尼鼠白血病病毒）逆转录酶
Rneasy 小量提取试剂盒Qiagen74104
虾碱性磷酸酶Takara2660B
SYBR Gold 核酸凝胶染料Thermo fisherS11494
TBE 缓冲液Thermo fisherB52
四甲基乙二胺 (TEMED)Nacalai tesque33401-72
尿素，经核酸酶和蛋白酶检测Nacalai tesque35940-65

参考文献

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