在基因组水平上快速检测并可靠定量RNA编辑事件仍然具有挑战性，目前主要依赖直接RNA测序方法。本文所述方案采用微温度梯度凝胶电泳（µTGGE）作为一种简单、快速且便携的RNA编辑检测方法。
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本文内容
摘要
摘要
RNA编辑是一种导致RNA转录后序列发生改变的过程。RNA编辑的检测与定量主要依赖于Sanger测序和RNA测序技术。然而，这些方法可能成本较高且耗时较长。在本实验方案中，采用一种便携式微温度梯度凝胶电泳（µTGGE）系统，作为无需测序即可快速检测RNA编辑的方法。该方法基于电泳原理，在核酸样品穿过聚丙烯酰胺凝胶的过程中，利用高温使其变性。在不同温度范围内，DNA片段会呈现出从完全双链DNA到部分解离的链，最终变为完全分离的单链DNA的梯度状态。含有不同核苷酸碱基的RNA编辑位点在µTGGE分析中会产生不同的熔解曲线特征。我们利用基于µTGGE的方法，对四个已编辑RNA片段与其相应的未编辑（野生型）片段之间的熔解曲线差异进行了表征。通过比较编辑与未编辑RNA所产生的条带模式，计算出模式相似性评分（PaSSs），用于评估该方法的可重复性。总体而言，本文所述平台能够以直接、简便且经济高效的方式检测RNA中的单碱基突变。预计该分析工具将有助于推动分子生物学领域的新发现。
引言
基因组RNA中的单核苷酸变异（SNVs），包括A-to-I、C-to-U和U-to-C变异，可能指示RNA编辑事件。然而，RNA中SNVs的检测仍是一项技术上具有挑战性的任务。传统上，编辑型与非编辑型RNA的比例通过直接测序、等位基因特异性实时聚合酶链式反应（PCR）或变性高效液相色谱（HPLC）方法来确定1,2,3,4,5,6。然而，这些方法在时间和成本效益方面并不理想，且由于噪声水平较高导致准确性较低，从而构成了基于RNA的SNV检测的技术瓶颈7,8。本文介绍一种基于温度梯度凝胶电泳（TGGE）的技术方案，用于鉴定单核苷酸多态性（SNPs），作为一种替代方法，可避免在RNA编辑分析中使用直接RNA测序。
电泳是生命科学实验室中用于分离和分析生物大分子的首选方法。温度梯度凝胶电泳（TGGE）能够分离长度相同但序列不同的双链DNA片段。该技术依赖于DNA片段因序列差异导....
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方案
1. 目标片段的优化
注意：本实验方案的开发使用了四个经过编辑的基因，包括来自拟南芥（A. thaliana）的两个核基因（AT2G16586 和 AT5G02670），以及在 HEK293 细胞中表达的编码蓝色荧光蛋白（BFP）和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的基因。
- 为了识别具有不同熔解曲线特征的基因片段（代表编辑区域与非编辑区域），使用基于网络的 uMelt HETS 工具（原始 uMelt 软件的扩展版本）生成预测的熔解曲线13。
注意：该工具可预测异源双链和同源双链产物的熔解曲线形状。 - 针对每个目标基因，设计三对基因片段（长度为 300–324 bp）。每对包含一个含有编辑位点的片段和一个对应的含有非编辑位点的野生型片段，分别位于 5'-末端、中间位置或 3'-末端。
- 选择在螺旋度轴上熔解区域差异最大的非编辑/编辑片段对，用于后续分析。对于 µTGGE 分析，通过 PCR 扩增合成所选基因片段，具体操作见下文第 2 节。
- 使用 DNADynamo 软件（https://www.bluetractorsoftware.com/DynamoDemo.htm） 设计正向和反向引物，并利用 NCBI Primer-BLAST 工具进行验证。
- 将引物稀....
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结果
利用微变性梯度凝胶电泳（µTGGE）鉴定RNA编辑事件中的单核苷酸碱基变化
本实验方案使用了四个经过编辑的基因（表1），包括在HEK293细胞中表达的BFP基因（由载脂蛋白B mRNA编辑酶复合物的脱氨酶APOBEC1介导的C-to-U RNA编辑15）、在HEK293细胞中表达的含有赭石终止密码子（TAA）的EGFP基因（由作用于RNA的腺苷脱氨酶ADAR1介导的A-to-I RNA编辑16），以及拟南芥（A. thaliana）中的两个核基因AT2G16586和AT5G0267017,18（发生U-to-C RNA编辑）。编辑样本与相应未编辑样本之间的单核苷酸差异均通过DNA测序确认。随后进行µTGGE分析，以检测各样本熔解曲线之间的差异（图3）。
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讨论
RNA 编辑在生物学中具有重要作用；然而，目前检测 RNA 编辑的方法（如色谱法和测序法）由于成本高、耗时长且操作复杂，面临诸多挑战。本文所述的方案是一种简单、快速且成本低廉的 RNA 编辑检测方法，采用基于便携式微尺寸 TGGE 的系统。该系统可在进行 Sanger 测序前区分已编辑与未编辑的基因。具体而言，可通过 TGGE 熔解曲线谱图的变化，区分存在单碱基核苷酸修饰的已编辑与未编辑基因。由于系统中凝胶用量仅为 1 in，所需样本量极小，且可快速检测序列间的差异。此外，本方案操作简便，无论是领域专家还是初学者均可轻松掌握。目标基因片段的优化对于清晰区分已编辑与未编辑区域至关重要，而本方案简化了这一优化过程。
本方案可与使用荧光标记引物的多重分析兼容。对于定量分析，未知RNA样品（经编辑或未编辑）可在TGGE分析过程中用绿色荧光标记，并与红色荧光标记的参考标准品（经编辑或未编辑）共迁移。
除了证明 µTGGE 方法能够检测单核苷酸 RNA 编辑事件外，我们还验证了使用 µTGGE 获得的实验结果与使用 uMELT 对同一基因.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究得到了日本科学促进会科研费（17H02204 和 18K19288）的资助。Ruchika 获得了日本政府（文部科学省奖学金）的经费支持。我们感谢 Ms. Radhika Biyani（JAIST，高木实验室）和 Dr. Kirti Sharma（BioSeeds 公司）在电泳相关实验中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2U ExoI | Takara | 2650A | 外切核酸酶 I |
| 40(w/v)%-丙烯酰胺/双丙烯酰胺 (19:1) | Thermo fisher | AM9022 | |
| 过硫酸铵 (APS) | Thermo Fisher | 17874 | |
| 微量离心机 Mini spin | eppendorf | 5452000034 | |
| 数字干浴器/金属浴加热器 | Thermo fisher | NA | |
| Gold Taq 聚合酶预混液 | Promega | M7122 | |
| LATaq DNA 聚合酶 | TAKARA | RR002A | Taq 聚合酶 |
| micro-TGGE 胶片夹持器 | BioSeeds Corp. | BS-GE-CH | |
| micro-TGGE 电泳装置 | Lifetech Corp. | TG | |
| micro-TGGE 凝胶盒 | BioSeeds Corp. | BS-TGGE-C | |
| NanoDrop 1000 | Thermo fisher | ND-1000 | 分光光度计 |
| 植物 Rneasy 小量提取试剂盒 | Qiagen | 74904 | |
| ReverTra Ace 预混液 | TOYOBO | TRT101 | M-MLV（莫洛尼鼠白血病病毒）逆转录酶 |
| Rneasy 小量提取试剂盒 | Qiagen | 74104 | |
| 虾碱性磷酸酶 | Takara | 2660B | |
| SYBR Gold 核酸凝胶染料 | Thermo fisher | S11494 | |
| TBE 缓冲液 | Thermo fisher | B52 | |
| 四甲基乙二胺 (TEMED) | Nacalai tesque | 33401-72 | |
| 尿素，经核酸酶和蛋白酶检测 | Nacalai tesque | 35940-65 |
参考文献
- Chateigner-Boutin, A. L., Small, I. A rapid high-throughput method for the detection and quantification of RNA editing based on high-resolution melting of amplicons. Nucleic Acids Research. 35 (17), 114(2007).
- Chen, Y. C., et al.
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重印与许可
