多途径表型分析方法用于甘蔗根系特征鉴定

摘要

根系性状表征是目前仍处于起步阶段的研究领域之一，尤其是在甘蔗中。整合多种方法对甘蔗根系进行精确表型分析，可获得全面且整体性的结果，从而有助于将所鉴定的性状和机制应用于常规育种和分子育种。

摘要

根系是水分和养分吸收的主要通道，在逆境条件下对维持植物生长和产量具有关键作用。植物根系的研究在方法上存在诸多困难 原位 评估与取样，这一点在甘蔗中尤为明显（甘蔗属 spp.)。20世纪20年代的传统方法记录了甘蔗根系的基因型变异，此后关于甘蔗根系性状的研究报道甚少。 本身 直到最近。除了形态特征外，根际特性（包括化感作用和/或对微生物共生的亲和性）也决定了植物的定植与存活。

根系最终决定了甘蔗地上部分的生产力。随着对气候适应型品种需求的增加，探索和利用甘蔗根系性状的变异变得愈发重要。本文介绍了由印度农业研究委员会甘蔗育种研究所（ICAR-SBI）科研团队采用的多种甘蔗根系表型分析方法，包括通过沟槽取样进行田间挖掘、使用根芯取样器、利用抬高平台进行根系取样，以及在水培条件下种植植株等方法。

通过沟槽取样进行田间挖掘对于评估植物根系在其自然生长环境中的状况至关重要。使用模拟田间条件的抬高平台以及根芯取样器是替代方法，可显著节省时间、获得均匀的样品尺寸，并减少根系材料的损失。水培植物培养技术可用于研究根系形态、解剖特征及根际生物学，包括有机化合物的分泌以及与微生物的相互作用。利用不同取样方法开展的多种实验所产生的数据，共同丰富了关于甘蔗根系性状的信息资源。

引言

甘蔗（Saccharum spp.）是一种重要的食物和生物能源来源，是适合在热带和亚热带气候条件下种植的重要经济作物。由于具有C₄光合作用途径，甘蔗在碳同化过程中效率高，能够高效利用水和肥料等农业生产投入。甘蔗收获后的加工可产生糖和粗糖等具有经济价值的产品，同时副产品包括糖蜜、乙醇和能源。全球近100个国家种植甘蔗，总面积达2597万公顷，约占全球耕地总面积的1.5%。仅印度就占全球甘蔗产量的16%（约3.06亿吨），平均单产为70吨·公顷^{−1 1}。严重影响甘蔗生产的非生物胁迫主要包括水分亏缺、积水、温度极端以及土壤特性如养分缺乏、盐渍化、碱化和碱性等。培育抗非生物胁迫作物面临的最大挑战是确定在胁迫条件下能够显著提高产量的具体性状。

甘蔗生理学的多个方面尚未被充分理解，其中包括对甘蔗产量具有显著影响的根-茎关系。尽管甘蔗的根系存在不同类型（如种根、茎生根和成年根），可能在发育过程和功能上各不相同，但相较于茎部，其根系的研究仍较为不足。在萌发过程中，不同基因型在种根的数量和长度方面已观察到存在差异²。种根参与甘蔗芽的萌发过程，确保作物早期的正常建立，随后将被茎生根取代；茎生根更为强健，从发育中的茎基部产生³。在种根上观察到的细小分支有助于幼苗固定，并在被茎生根替代前协助水分和养分的吸收。与种根类似，茎生根也起源于甘蔗下部未伸长节间的根原基。

由于苗根在植株中存留时间较长，其直径比种茎根粗4至10倍。苗根构成了甘蔗唯一的根系，在植株后续的生长与发育过程中发挥着重要作用。苗根的活力与植株整体的营养生长活力呈正相关。种茎根与苗根的不断更替和持续发育，形成了甘蔗的"成年根系"，该根系能够持续适应不断变化的环境条件。通常情况下，根系分布越深、越发达，可为作物提供的水分和养分就越多，优于浅层根系分布。周期性解剖观察发现，当土壤含水量较高时，根系分布较浅；而随着地下水位下降，根系则向更深层发育²。甘蔗的根系在作物收获后仍保持活性，可持续支持宿根蔗的生长，直至地下芽萌发出新的苗根⁴。根系角度和分支程度是决定植物根系探索土壤体积的两个关键因素。根系角度是一种基因型性状，可通过传统育种或分子手段进行改良，以增强对生物和非生物胁迫的耐受性。相反，根系分支程度主要受环境影响，因此需要定期监测根系发育及其对局部土壤条件的响应。

已对甘蔗根系的解剖特征进行研究，以明确其在基因型和环境方面的差异。甘蔗种茎根的解剖结构与其他禾本科植物（如玉米）的成熟根相似，其皮层由排列规则、分化良好的多层细胞构成。内皮层发生木栓化，其外侧为单层的中柱鞘。后生木质部是水分和营养离子运输的主要通道，呈辐射状排列，并与韧皮部束相间分布；韧皮部由一个筛管分子和两个伴胞组成。根中央由大量未分化的细胞聚集形成髓部。不同甘蔗品种具有显著的解剖学特征差异，这些特征与根系的水分传导特性相对应，从而影响水分的运输。早期关于甘蔗根系解剖性状差异的研究表明，在低水分胁迫条件下，内皮层内侧、髓部与维管区域之间以及导管周围的细胞壁明显增厚⁵。此类细胞壁增厚可能是植物为防止汁液回流以及在胁迫条件下增强机械强度的一种适应性反应。

与甘蔗抗旱性相关的一些重要性状包括外皮层的相对厚度和层数、皮层与中柱的比率、皮层中的细胞间隙以及根毛尖端的加厚。不同甘蔗品种间，茎根皮层细胞所占面积与中柱组织所占面积的比率存在显著差异，中柱面积的表现具有较大变异性⁶。甘蔗根系的水力导度与茎根中后生木质部元件的大小和数量有关。根内疏水性细胞层可能决定了质外体水分移动的区域。内皮层以及下皮层（称为外皮层）中存在木栓化的凯氏带，可作为疏水屏障。皮层细胞的解体导致老根以及处于低氧条件下的植株形成溶生通气组织，且不受发育年龄的影响。在渍水胁迫下通气组织的形成与抗性品种维持生长能力相关⁷。

Erianthus arundinaceus [Retzius] Jeswiet（与Saccharum spp. 近缘的属）的根系形态与解剖结构与其对环境胁迫的高度耐受性密切相关⁸。Erianthus arundinaceus 的节根以较陡的角度分布，并具有密集的根毛，以促进从深层土壤区域吸收水分和营养离子。其深根系统由多条以陡峭生长角度延伸的节根组成。节根直径与大型木质部导管的大小和数量相关，直径在0.5 mm至5.0 mm之间变化较大。这些节根还形成根茎鞘，其皮层外层（外皮层）具有木质化的厚壁组织（下皮层），皮层中段具有溶生通气组织，维管柱中则含有淀粉粒。除根系结构和形态特征外，根系分泌的有机化合物在决定植物萌发、定植和存活方面也发挥重要作用，可能具有化感效应和/或促进微生物共生的能力。

在水培条件下种植的甘蔗品种中，记录了根系酶活性以及根系形态的细微特征，包括根冠色素沉着及受伤后的再生潜力⁹。根系生长对土壤环境变化具有高度可塑性，体现在根系构型和大小两个方面。最优良的甘蔗品种应具有较少或适量的分蘖，相应地根系数量也较少，从而在逆境条件下更有利于存活。因此，对根系的系统性研究应成为任何作物改良计划中的重要组成部分¹⁰。目前大多数根系相关实验主要关注发育特征，而对功能可塑性的研究往往不足¹¹。 除了结构分布外，根系的功能可塑性在逆境胁迫下的生存中起着关键作用，因此有助于育种者将根系性状纳入非生物胁迫耐受性的筛选流程，从而提升甘蔗的抗逆能力。

鉴于根系性状在逆境条件下维持甘蔗生长和产量方面的重要性，探索并利用甘蔗根系性状的内在变异十分必要。着眼于选择具有优良根系的组分性状及相关机制，是提升甘蔗在气候变化条件下作物表现的有效途径。表型评价是一个耗时且成本较高的过程；然而，整合多方面的研究方法将极大提升其在作物改良中的应用价值。本文描述了四种不同的甘蔗根系表型分析方法，每种方法均有其各自的优势与局限性，表明需要协同多种方法才能获得全面而整体的研究结果。

方案

1. 通过探槽取样进行野外挖掘

1. 按照推荐的栽培技术规范（POP），将两芽蔗段以行距120 cm、株距90 cm种植于田间，培育商业甘蔗杂交种（下文称为“品种”），以确保良好的出苗和生长。
2. 在作物成熟期结束时，使用挖掘机在田间挖掘一条深1.5 m、宽1.0 m的沟槽。通过持续的水射流冲洗，清除根区附着的土壤，同时避免损伤根系（图1）。
3. 当附着土壤松脱后，将甘蔗连同根系一起挖出，并移至实验室，人工测量根的数量、根长、体积和重量。

图1：田间根系挖掘的剖面取样方法。（A）沿田间开挖的侧向沟槽，（B）水射流冲洗，以及（C）显示沟槽深度的内部视图。请点击此处查看此图的放大版本。

2. 采用根芯取样器以减少取样误差

1. 使用由低碳钢（MS）材料制成、高61 cm、直径16 cm、重8 kg的圆柱形根钻取样器，在田间采集甘蔗根系样品。取样器底部边缘应具有锋利刃口，以便插入土壤时易于穿透；顶部配备直径为3 cm的提环，用于提升取样器（图2）。
2. 按照推荐的种植最佳实践（POP），在田间以双芽茎段种植甘蔗品种，行距为120 cm，行内株距为90 cm，以确保良好的出苗和生长。
3. 在作物成熟期，将取样器顶部边缘固定于主茎/蔗茎上，连续锤击使其达到目标土壤深度（45 cm）。将整块土壤样品取出并置于取样器中，在流动水下小心冲洗，以分离附着的根系。
4. 根系充分冲洗后，通过手工测量记录其体积、表面积、长度和重量；同时将根系平铺于透明托盘上进行扫描，利用参考软件分析所得数字化图像（见材料表）。

图 2：根系原位采样器。（A）尺寸，（B）俯视图，以及（C）采样位置。请点击此处查看此图的放大版本。

3. 用于在不同物候期促进取样的根系表型结构

1. 构建一个根系表型结构，该结构包含三个相邻的、尺寸为 4.5 m × 10.1 m 的隔间，用于甘蔗根系取样，并设计成可人工拆卸侧壁，以暴露地下根系（深度可达 80–100 cm）（图3）。侧壁采用预制板建造，预制板尺寸为长 1.8 m、宽 30 cm、厚 4 cm。
2. 用田间土壤填充并压实该结构，顶部预留约 20 cm 的空间，并设置足够的排水孔，以促进土壤通气。
3. 播种包含 Saccharum officinarum L.、Saccharum spontaneum L.、Saccharum barberi Jesw.、Saccharum sinense Roxb. 和 Saccharum robustum Brandes 和 Jeswiet ex Grassl. 的种质克隆芽片（以下称为“Saccharum spp. 克隆”），在育苗盘中使用生根基质（红壤：农家肥：沙子 = 2:2:1）进行萌发，培养 30 天。选择生长一致且健康的幼苗，按照推荐的种植最佳实践（POP），以行距 90 cm、株距 60 cm 移栽至结构中，确保作物良好定植与生长。
4. 在苗期（种植后 60–120 天 [DAP]）和快速生长期（120–150 DAP）阶段，人工拆除由预制板构成的侧壁，随后持续喷水冲洗，以暴露根系。
5. 将整套根系完整挖出并转移至实验室，人工测量其长度、体积和重量，并将根系平铺于透明托盘上进行扫描，利用指定软件分析所得数字化图像（见材料表）。
6. 在其中一个隔间内通过停止灌溉施加干旱胁迫，在第二个隔间内封堵排水孔以维持土壤饱和状态，模拟涝渍胁迫；第三个隔间则按照推荐的种植最佳实践（POP）进行灌溉，保持田间持水量，作为对照处理。

图3：根系表型结构。（A）尺寸，（B）三个区域的总体示意图，以及（C）一个区域的视图。请点击此处查看此图的放大版本。

4. 用于研究根际生物学的植物水培培养

1. 在环境可控的玻璃温室中自制水培系统，用于种植甘蔗以研究根系生物学的细微特征。向尺寸为 20 cm × 20 cm × 50 cm 的玻璃容器中加入约 15 L 的改良霍格兰营养液（表 1），并通过水族泵提供通气（图 4）。
2. 播种甘蔗品种及 Saccharum 属克隆材料的芽片，将其置于由椰糠堆肥制成的育苗盘中，萌发 30 天。选取生长一致且健康的幼苗，以每罐 3 株的密度移栽至水培罐中，注意将整条根系完全浸入营养液中。用黑色布料覆盖容器，确保根系不暴露于光照下。在玻璃罐边缘使用塑料网片（20 cm × 20 cm）支撑植株，使其保持直立。
3. 在萌发阶段结束时（第 60 天），于光合作用活性高峰期（0800 h 至 1200 h）将完整植株的根系浸入 50 mL 收集液（无菌双蒸水）中 4 小时，以收集根系分泌物。将收集的溶液通过 Whatman 滤纸过滤，随后依次通过装有阴离子交换树脂和阳离子交换树脂的玻璃层析柱¹²。将洗脱组分蒸发至干，并于 -20 °C 保存，待进一步处理。
4. 根据标准操作流程，采用高效液相色谱法（HPLC）分析处理后的根系分泌物样品中的有机酸含量¹²，并采用分光光度法测定总酚类¹³、蛋白质¹⁴、糖类¹⁵和氨基酸¹⁶的含量。
5. 每周定期监测根系生长情况，记录根尖色素沉积和根毛密度。根据标准操作流程，在第 3 个月测定过氧化物酶¹⁷和超氧化物歧化酶¹⁸的酶活性，以及总酚含量¹⁹。
6. 通过使用无菌手术刀沿主根纵向切开至根尖，造成根系损伤，进而评估其响应，并定期观察变化情况。

化学物质	终浓度
硝酸钾	0.608 g·L-1
硝酸钙	1.415 g·L-1
磷酸二氢钾	0.164 g·L-1
硫酸镁	0.560 g·L-1
EDTA-铁钠盐	6.00 g·250L-1
硼酸	1.43 g·250L-1
四水氯化锰	0.91 g·250L-1
硫酸锌	0.11 g·250L-1
硫酸铜	0.04 g·250L-1
钼酸	0.01 g·250L-1

表1：甘蔗水培培养中改良营养液的组成。

图4：水培装置。 该装置（A）为甘蔗种植定制，（B）为5个月大的作物（仅为拍摄目的移除了黑色遮布）。此图改编自 Hari 等人⁹。请点击此处查看此图的放大版本。

结果

甘蔗品种根系形态性状的差异
在图5A、B中展示了通过田间沟槽取样法挖掘出的Co 62175品种根系系统及其在水培条件下生长的代表性图像。在Co 62175和Co 99006两个品种中均观察到较长的根系（约100 cm），而Co 99006的根系重量最高（127 g·丛⁻¹）。采用根芯取样器记录根系性状，结果显示，Co 62175在总根长、根表面积和根体积方面均优于Co 99006（图5C–E）。然而，Co 99006的平均根直径高于Co 62175（图5F）。

根系形态性状的变异 甘蔗属 spp. 克隆
形态特征在形...

讨论

根系决定了甘蔗地上部分的生产力，因此必须全面探索和深入理解其各个层面，以培育出适应气候变化的品种。印度农业研究委员会-甘蔗研究所（ICAR-SBI）的一支由植物生理学家、微生物学家、农业工程师、生物化学家和植物育种专家组成的科研团队，采用了多种方法对甘蔗根系进行表型分析，包括通过沟槽取样进行田间挖掘、使用根芯取样器、搭建 elevated platforms（抬高平台）进行根系取样，以及在水培条件下种植植株。由于单一方法可能不够全面和/或具有局限性，因此需要整合多种信息，以揭示理想根系表型所包含的性状特征及其作用机制。以往的根系取样方法虽各自独立，但为本研究中所述策略的制定提供了有益基础。

Venkatraman 和 Thomas⁵率先开展了甘蔗根系的研究，提出了三种适宜的观察方法。第一种方法是在植株一侧挖掘一个深坑，使根系得以从土壤中分离出来，随后用白灰水涂刷并拍摄其自然分布状态。第二种方法是在植株两侧相对的位置挖掘深坑，在靠近植株的坑壁处紧贴设置由2英寸孔径铁丝网构成的框架，并将铁棒横穿于两坑之间的土壤中，以固定根系在原位。随后用...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带管路附件的曝气泵	购自本地来源	NA	用于甘蔗水培培养
硼酸	Sisco Research Laboratories，印度	80266	配制改良型霍格兰溶液
硝酸钙	Central Drug House，印度	27606	配制改良型霍格兰溶液
堆肥椰糠	购自本地来源	NA	用于甘蔗种茎的萌发
硫酸铜	Sisco Research Laboratories，印度	38869	配制改良型霍格兰溶液
二乙氨基乙基纤维素（DEAE-纤维素）	Sisco Research Laboratories，印度	10529	用于根系分泌物处理的阴离子交换树脂
EDTA-铁钠盐	Sisco Research Laboratories，印度	59389	配制改良型霍格兰溶液
农家肥	购自本地来源	NA	用于甘蔗种茎的萌发
玻璃水培槽	实验室自制	NA	用于甘蔗水培培养
高效液相色谱仪（HPLC）	Agilent Technologies	1200 Infinity	定量分析根系分泌物中的有机酸
硫酸镁	Sisco Research Laboratories，印度	29117	配制改良型霍格兰溶液
氯化锰	Sisco Research Laboratories，印度	75113	配制改良型霍格兰溶液
钼酸	Sisco Research Laboratories，印度	49664	配制改良型霍格兰溶液
磷酸二氢钾	Central Drug House，印度	29608	配制改良型霍格兰溶液
硝酸钾	Central Drug House，印度	29638	配制改良型霍格兰溶液
育苗穴盘（Protrays）	实验室自制	NA	用于甘蔗种茎的萌发
红壤	购自本地来源	NA	用于甘蔗种茎的萌发
根系取芯采样器	实验室自制	NA	用于原位根系取样
沙子	购自本地来源	NA	用于甘蔗种茎的萌发
阳离子交换树脂 Seralite-120	Sisco Research Laboratories，印度	14891	用于根系分泌物处理的阳离子交换树脂
支撑架	购自本地来源	NA	用于甘蔗水培培养
水泵	购自本地来源	NA	用于甘蔗水培培养
Whatman 1号滤纸	Universal Scientific	1001090	用于根系分泌物处理
WinRhizo PRO（软件）	Regent Instruments Inc.，加拿大	STD4800	配备分析软件的二维根系扫描仪
硫酸锌	Sisco Research Laboratories，印度	76455	配制改良型霍格兰溶液