本实验方案通过机械摩擦损伤斑马鱼的眼表，以在细胞水平上评估其后续的伤口闭合情况。该方法利用眼科钻头部分去除角膜上皮，并采用扫描电子显微镜追踪伤口闭合过程中细胞形态的变化。
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本文内容
摘要
摘要
作为眼睛的透明表面，角膜对清晰视力至关重要。由于其所处位置，该组织容易受到外界环境的损伤。事实上，临床上最常见的眼部损伤即为角膜损伤。尽管斑马鱼是经典的研究模型，但目前对角膜生理学的研究多集中于小型哺乳动物（如小鼠、大鼠和兔），而忽略了包括斑马鱼在内的其他物种。
本报告描述了一种在斑马鱼上进行角膜擦伤的方法。该伤口在麻醉的活体鱼上使用眼科钻针进行in vivo操作。该方法可产生可重复的上皮损伤，同时保持眼球其他部分完整。擦伤后，连续监测伤口闭合过程达3小时，此后伤口完成再上皮化。通过扫描电子显微镜结合图像处理，可研究上皮细胞形态及顶端突起，以分析角膜上皮伤口闭合过程中的各个步骤。
斑马鱼模型的特性使得研究人员能够在组织受到挑战时，研究上皮组织的生理学特性以及上皮细胞的集体行为。此外，使用排除了泪膜影响的模型可以产生 关于角膜对压力反应的新答案。此外，该模型还可用于阐明任何上皮组织在遭受物理损伤时所涉及的细胞与分子事件。该方法可用于临床前药物有效性评估。
引言
由于大多数上皮组织均与外界环境接触，容易受到物理损伤，因此非常适合用于研究伤口愈合过程。在已被深入研究的组织中，角膜是研究伤口愈合细胞和分子机制的极佳模型。作为透明的外表面，角膜为眼睛提供物理保护，并将光线首先聚焦到视网膜上。尽管不同物种间视网膜的结构和细胞组成存在差异1，但所有相机型眼睛的角膜结构和组成在总体上是相似的，不受物种影响。
角膜主要由三层结构组成2。第一层也是最外层为上皮层，它会不断更新以维持其透明性。第二层是基质层，其中散布着称为角膜细胞（keratocytes）的细胞，这些细胞位于一层排列高度有序的胶原纤维之中。第三层也是最内层为内皮层，它允许营养物质和液体从前房扩散至角膜的外层。上皮细胞与基质细胞通过生长因子和细胞因子相互作用3。当上皮受损时，角膜细胞迅速发生凋亡并继而增殖，这一过程凸显了二者之间的相互作用4,5。在较深的伤口（如穿孔伤）情况下，角膜细胞会积极参与修复过程6。
由于角膜与外部环境直接接触，物理性损伤较为常见。其中许多损伤由微小异物7引起，例如沙粒或灰尘。揉眼的反射动作可导致广泛的上皮擦伤及角膜重塑8。根据伤口的大小和深度，这些物理性损伤可能引起疼痛，并需要数天时间才能愈合9。具有良好伤口愈合特性的模型有助于理解伤口闭合过程中的细胞与分子机制。此外，此类模型已被证实可用于测试具有促进角膜愈合潜力的新分子，此前已有相关研究证实这一点10,11。
本文所述方案旨在利用斑马鱼作为研究角膜物理损伤的相关模型。该模型非常适合药理学筛选研究，因为可将分子直接添加到养殖水体中，从而使其与正在愈合的角膜接触。本文提供的详细信息将有助于科研人员在斑马鱼模型上开展相关研究。体内角膜损伤通过钝化的眼科钻头完成。通过特异性去除中央角膜上皮，可分析邻近或远离损伤区域的上皮细胞所受影响。近年来，已有大量研究报告聚焦于啮齿类动物角膜的此类方法12,13,14,15,16,17；然而，迄今为止，仅有一篇报告将该方法应用于斑马鱼18。
由于操作简便，物理性损伤在明确上皮细胞于伤口闭合中的作用方面具有重要价值。另一种已建立的角膜损伤模型是化学性灼伤，尤其是碱性灼伤19,20,21。然而，这种方法会间接损伤整个眼表，包括周边角膜和角膜基质19。事实上，碱性灼伤可能引发角膜溃疡、穿孔、上皮混浊以及快速的新生血管化22，其不可控的后果使得该方法不适用于常规的伤口愈合研究。此外，根据具体研究目的，还有多种其他方法被用于角膜伤口愈合的研究（例如，完全上皮清创23、化学与机械损伤结合制造部分厚度伤口24、准分子激光消融造成累及基质层的伤口25）。使用眼科钻头可将损伤局限在上皮对伤口的反应，且能产生高度可重复的伤口模型。
与每种造伤方法一样，使用眼科钻头既有优点也有缺点。主要缺点是其反应主要局限于上皮层，因此不能完全模拟临床中所见的擦伤情况。然而，该方法具有多种优势，包括操作简便、精确度高、可重复性强，且属于非侵入性方法，对动物的耐受性良好。
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方案
所有实验均获得国家动物实验委员会的批准。
1. 准备工作
- 提前配制用于麻醉的三卡因（tricaine）储备液26（本实验方案中使用0.4%的储备液）。操作时应佩戴手套，并尽可能在通风橱中进行。
- 配制50 mL的0.4%溶液时，称取200 mg三卡因粉末至50 mL离心管中，加入约45 mL双蒸水溶解粉末。
- 用1 M Tris溶液（pH 8.8，约1.25 mL）将三卡因储备液的pH调节至7。分次加入Tris溶液，每次加入后充分混匀储备液，并检测pH值，直至达到目标pH。
- 实验前，配制0.02%的三卡因工作液。
- 将2 mL的0.4%储备液解冻后加入40 mL系统用水中（终浓度为0.02%），并将该溶液置于小容器中备用。
- 实验前，配制含镇痛剂的恢复用水。操作时应佩戴手套，并尽可能在通风橱中进行。
- 配制1 L恢复用水时，称取2.5 mg盐酸利多卡因（lidocaine hydrochloride）粉末，溶于新鲜的系统用水中。检测pH值，必要时调节至7。
- 实验前，配制固定液（含2.5%戊二醛的0.1 M磷酸钠（Na-PO4）溶液，pH 7.4）。操作时应佩戴手套，并在通风橱中进行。
- 配制10 mL固定液时，用移液器吸取5 mL 0.2 M Na-PO4溶液至离心管中，加入0.5 mL 50%戊二醛，再用双蒸水定容至10 mL。配制完成后避光保存，并在使用前置于冰上或冰箱中冷却。
注：若伤口处理后需在数小时内收集样本，应在使用前立即配制固定液。
- 配制10 mL固定液时，用移液器吸取5 mL 0.2 M Na-PO4溶液至离心管中，加入0.5 mL 50%戊二醛，再用双蒸水定容至10 mL。配制完成后避光保存，并在使用前置于冰上或冰箱中冷却。
- 准备创伤实验所需设备（图1）。
- 在恢复用鱼缸或较小的容器中加入系统用水。
- 准备好眼科钻头（ophthalmic burr），检查钻头尖端是否清洁。如有需要，可用湿润的棉签清除细胞碎片。
- 在软质海绵的一侧切开一个切口，用系统用水润湿海绵后，将其放置于体视显微镜的底座/载物台上。确保有足够的操作空间用于使用钻头，并提供足够的侧向和/或上方照明，以便清晰观察眼部表面。
2. 麻醉
- 用网将一条鱼尽可能轻柔地从鱼缸转移到0.02%三卡因溶液中。
- 监测麻醉状态，检查鱼对轻微机械刺激是否无反应。
注意：为确保麻醉效果一致，在对成年野生型AB鱼进行擦伤处理前，通常使用三卡因麻醉2分钟。对于其他遗传背景的鱼，可能需要不同的麻醉时间。
3. 磨损
- 用勺子将麻醉后的鱼轻轻放入海绵的切口处，使鱼头从海绵表面伸出。
- 打开磨头，将显微镜视野对准眼球表面。
- 小心地将磨头尖端接近眼球表面。当接触眼球表面时，开始以环形运动在眼球表面移动磨头尖端。避免突然移动，以防眼球在眼窝内倾斜或磨头尖端滑脱。
- 完成刮擦后，小心地将鱼放入含有镇痛剂的系统水中进行恢复。
- 使用后立即用湿润的棉签清洁磨头。
4. 样品采集
- 在预定时间点，用鱼网捞起鱼并放入0.02%三卡因溶液中。将鱼保持在该溶液中，直至鳃盖运动完全停止，且鱼对触碰无任何反应。
- 将鱼用勺子放置于培养皿中，并用镊子固定。使用解剖剪将鱼头剪除。处理样本时，避免刮伤眼部表面。
- 将组织放入含有 0.1 M Na-PO 的样品管中4.
- 用 0.1 M Na-PO 缓冲液冲洗组织4 用洁净的缓冲液冲洗，直至溶液中无血液残留。
5. 电子显微镜样品处理
- 将组织在 2.5% 戊二醛/0.1 M Na-PO4（pH 7.4）中固定约 24 小时，温度为 +4 °C。将样品置于旋转或振荡样品架上，以确保充分固定。
- 去除固定液，并用 0.1 M Na-PO4 多次冲洗样品。
- 在此步骤中对样品进行解剖。
- 将样品置于解剖板上的一滴 0.1 M Na-PO4 中。若需对同一条鱼的两只眼睛成像，可用精细解剖剪将头部样本切成两半。
- 或者，小心地将精细镊子的尖端从眼睛侧面插入眼窝，特别注意不要划伤眼球表面，然后将眼睛从眼窝中取出。
- 将解剖后的样品转移至含有 0.1 M Na-PO4 的离心管中。确保样品管中无多余组织，以免在样品处理过程中附着于眼球顶部。
- 将样品储存在 0.1 M Na-PO4 中（最多一周），温度为 +4 °C。
- 对样品进行透射电子显微镜成像处理。
- 在室温（RT）下，用含 2% 四氧化锇的 0.1 M Na-PO4 缓冲液对样品进行后固定，持续 1 小时。
- 在室温下，用 0.1 M Na-PO4 洗涤样品 3 次，每次 5 分钟。
- 在室温下，依次用 30%、50% 和 70% 乙醇对样品进行脱水处理，每种浓度处理 1 小时。
- 在室温下，将样品浸入 96% 乙醇中 2–3 小时。
- 随后，将样品在 100% 乙醇中分两次孵育：第一次 1 小时，第二次在新鲜的 100% 乙醇中过夜，温度为 +4 °C。
- 将样品置于自动临界点干燥仪中进行 30 个循环处理。
- 包埋并进行铂镀膜处理。
- 将粘性标签贴附于样品台上。若需在样品台上标记样品，可在标签上保留一小片覆盖纸，并在纸上书写样品编号。
- 将带有标签的样品台放置于解剖显微镜的底座上。
- 使用精细镊子将组织样品轻轻放置于样品台上，角膜朝上。
- 使用适当的设备对样品进行铂镀膜。镀膜完成后，将样品在室温下保存，直至成像。
6. 成像（图2）
- 按照用户手册和成像专家的建议操作设备。
- 获取所需放大倍数的图像，并使用 2,000–2,500 倍的图像进行分析。
- 调整亮度和对比度，确保图像中无过曝区域，细胞边界和微脊结构尽可能清晰可见。
注意：组织的位置和角度会影响亮度和对比度的设置，可能需要根据不同样本以及组织的不同区域进行相应调整。
7. 测量细胞形态、大小和微脊模式
- 在 Fiji ImageJ 1.5327 中打开 TIFF 图像。使用图像的比例尺设置标尺：用 直线 工具绘制一条与比例尺长度相等的线段。选择 分析 | 设置标尺，输入已知距离。从 分析 | 工具 菜单中打开 ROI 管理器。
- 对于细胞大小和圆度分析，选择 分析 | 设置测量值 | 形态描述符。使用 放大镜 工具放大观察细胞。用 多边形 工具选择细胞，并将每个选区添加到 ROI 管理器中。最后，测量所选细胞并保存测量结果。
- 微脊分析（图 3 和 图 4）
- 从 图像 | 类型 菜单确保图像为 8 位格式。
- 使用 多边形 工具选择一个细胞，并通过 编辑 | 清除外部 清除背景。
- 通过选择 处理 | 平滑 对图像进行 1 至 3 次平滑处理，并从 图像 | 调整 | 亮度/对比度 调整亮度和对比度，使微脊尽可能清晰地显现。
- 从 处理 | 滤波 | 卷积 对图像进行卷积处理，从 处理 | 二值化 | 转为二值图像 将图像转为二值图像，并通过选择 处理 | 二值化 | 骨架化 对黑白图像进行骨架化。
- 使用 分析 | 骨架 菜单中的 分析骨架 功能测量微脊参数并保存数值。
注意：在扫描电镜（SEM）中，单个图像的亮度和对比度可能存在差异。因此，分析步骤可能需要根据每张图像进行相应调整。
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结果
本研究描述了一种在斑马鱼角膜伤口愈合实验中使用眼科钻头的方法。该方法改进自先前在小鼠中开展的研究，其中已证明钻头可高效去除上皮细胞层13。斑马鱼角膜造伤的挑战包括眼睛相对较小，以及在耗时较长的实验中需要持续维持鳃部的水流（如Xu及其同事所述28）。该方法的主要优点在于其操作简便且快速。使用标准体视显微镜可实现对钻头的精确操控（图1）。由于操作时间较短（从麻醉开始约3分钟），鱼类在处理后恢复良好，且无需额外设备来维持麻醉和供氧。
观察角膜伤口的方法有多种。本方案采用扫描电子显微镜（SEM，图2），该技术在角膜研究中已有长期应用历史29,30。尽管该方法无法评估上皮下层的情况，但它能简便地估算伤口愈合速度，并可用于比较眼球不同区域的角膜表面。在伤口形成后3小...
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讨论
角膜物理性损伤是眼科患者就医的最常见原因。因此，建立相关模型以研究角膜病理生理学的不同方面具有重要意义。迄今为止，小鼠是研究角膜创伤愈合最常用的模型。然而，在小鼠受伤眼部滴加眼药水以验证特定药物对角膜创伤愈合的影响可能较为困难。在这方面，斑马鱼模型特别适用于影响角膜创伤愈合分子的药理学筛选。本文所述方法与小鼠实验方法非常相似13。
然而，必须牢记两个具体的差异。首先，使用眼科钻头需要经过练习，以确保伤口的可重复性，特别是施加在眼球上的压力，这对实现适当的刮伤至关重要。此外，当上皮不再被有效去除时，应更换研磨头。其次，尽管斑马鱼角膜的结构和形态与其他角膜相似31，但该动物具有哺乳动物所无法比拟的再生能力34,35,36。小鼠的伤口闭合通常持续48–72小时11
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢Pertti Panula提供斑马鱼实验平台的使用权限，并感谢Henri Koivula在斑马鱼实验方面提供的指导与帮助。本研究由芬兰科学院、Jane和Aatos Erkko基金会、芬兰文化基金会以及ATIP-Avenir计划资助。成像工作在生物技术研究所的电子显微镜单元和光学显微镜单元完成，该平台由HiLIFE和芬兰生物中心（Biocenter Finland）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.1M Na-PO4 (磷酸钠缓冲液)，pH 7.4 | 本实验室制备 | 溶液由1M磷酸钠缓冲液（1M Na2 HPO4 ）用1M NaH2 PO4 调节至pH 7.4配制而成。 | |
| 0.2M Na-PO4 (磷酸钠缓冲液)，pH 7.4 | 本实验室制备 | 溶液由1M磷酸钠缓冲液（1M Na2 HPO4 ）用1M NaH2 PO4 调节至pH 7.4配制而成。 | |
| 0.5 mm钻头尖端 | Alger Equipment Company | BU-5S | |
| 1M Tris，pH 8.8 | 本实验室制备 | ||
| 粘附标签 | Agar Scientific | G3347N | |
| Algerbrush钻头，完整仪器 | Alger Equipment Company | BR2-5 | |
| 棉签 | Heinz Herenz Hamburg | 1030128 | |
| 解剖板 | 本实验室制备 | ||
| 解剖工具 | Fine Science Tools | ||
| 双蒸水 | 本实验室制备 | ||
| 2 ml离心管 | 任意供应商 | ||
| 氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐 | Sigma | A5040 | 注意：可引起刺激。 |
| 戊二醛，50%水溶液，I级 | Sigma | G7651 | 注意：有毒。 |
| 盐酸利多卡因 | Sigma | L5647 | 注意：有毒。 |
| 样品台 | Agar Scientific | G301P | |
| 培养皿 | Thermo Scientific | 101VR20 | |
| pH指示试纸 | Macherey-Nagel | 92110 | |
| 塑料勺 | 任意供应商 | ||
| 15 ml塑料管 | Greiner Bio-One | 188271 | |
| 50 ml塑料管 | Greiner Bio-One | 227261 | |
| 扫描电子显微镜 | FEI | Quanta 250 FEG | |
| 软海绵 | 任意供应商 | ||
| 溅射镀膜仪 | Quorum Technologies | GQ150TS | |
| 体视显微镜 | Leica |
参考文献
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