斑马鱼角膜伤口愈合：从擦伤到伤口闭合的成像分析

摘要

本实验方案通过机械摩擦损伤斑马鱼的眼表，以在细胞水平上评估其后续的伤口闭合情况。该方法利用眼科钻头部分去除角膜上皮，并采用扫描电子显微镜追踪伤口闭合过程中细胞形态的变化。

摘要

作为眼睛的透明表面，角膜对清晰视力至关重要。由于其所处位置，该组织容易受到外界环境的损伤。事实上，临床上最常见的眼部损伤即为角膜损伤。尽管斑马鱼是经典的研究模型，但目前对角膜生理学的研究多集中于小型哺乳动物（如小鼠、大鼠和兔），而忽略了包括斑马鱼在内的其他物种。

本报告描述了一种在斑马鱼上进行角膜擦伤的方法。该伤口在麻醉的活体鱼上使用眼科钻针进行in vivo操作。该方法可产生可重复的上皮损伤，同时保持眼球其他部分完整。擦伤后，连续监测伤口闭合过程达3小时，此后伤口完成再上皮化。通过扫描电子显微镜结合图像处理，可研究上皮细胞形态及顶端突起，以分析角膜上皮伤口闭合过程中的各个步骤。

斑马鱼模型的特性使得研究人员能够在组织受到挑战时，研究上皮组织的生理学特性以及上皮细胞的集体行为。此外，使用排除了泪膜影响的模型可以产生 关于角膜对压力反应的新答案。此外，该模型还可用于阐明任何上皮组织在遭受物理损伤时所涉及的细胞与分子事件。该方法可用于临床前药物有效性评估。

引言

由于大多数上皮组织均与外界环境接触，容易受到物理损伤，因此非常适合用于研究伤口愈合过程。在已被深入研究的组织中，角膜是研究伤口愈合细胞和分子机制的极佳模型。作为透明的外表面，角膜为眼睛提供物理保护，并将光线首先聚焦到视网膜上。尽管不同物种间视网膜的结构和细胞组成存在差异¹，但所有相机型眼睛的角膜结构和组成在总体上是相似的，不受物种影响。

角膜主要由三层结构组成²。第一层也是最外层为上皮层，它会不断更新以维持其透明性。第二层是基质层，其中散布着称为角膜细胞（keratocytes）的细胞，这些细胞位于一层排列高度有序的胶原纤维之中。第三层也是最内层为内皮层，它允许营养物质和液体从前房扩散至角膜的外层。上皮细胞与基质细胞通过生长因子和细胞因子相互作用³。当上皮受损时，角膜细胞迅速发生凋亡并继而增殖，这一过程凸显了二者之间的相互作用^4,5。在较深的伤口（如穿孔伤）情况下，角膜细胞会积极参与修复过程⁶。

由于角膜与外部环境直接接触，物理性损伤较为常见。其中许多损伤由微小异物⁷引....

方案

所有实验均获得国家动物实验委员会的批准。

1. 准备工作

1. 提前配制用于麻醉的三卡因（tricaine）储备液²⁶（本实验方案中使用0.4%的储备液）。操作时应佩戴手套，并尽可能在通风橱中进行。
   1. 配制50 mL的0.4%溶液时，称取200 mg三卡因粉末至50 mL离心管中，加入约45 mL双蒸水溶解粉末。
   2. 用1 M Tris溶液（pH 8.8，约1.25 mL）将三卡因储备液的pH调节至7。分次加入Tris溶液，每次加入后充分混匀储备液，并检测pH值，直至达到目标pH。
2. 实验前，配制0.02%的三卡因工作液。
   1. 将2 mL的0.4%储备液解冻后加入40 mL系统用水中（终浓度为0.02%），并将该溶液置于小容器中备用。
3. 实验前，配制含镇痛剂的恢复用水。操作时应佩戴手套，并尽可能在通风橱中进行。
   1. 配制1 L恢复用水时，称取2.5 mg盐酸利多卡因（lidocaine hydrochloride）粉末，溶于新鲜的系统用水中。检测pH值，必要时调节至7。
4. 实验前，配制固定液（含2.5%戊二醛的0.1 M磷酸钠（Na-PO₄）....

结果

本研究描述了一种在斑马鱼角膜伤口愈合实验中使用眼科钻头的方法。该方法改进自先前在小鼠中开展的研究，其中已证明钻头可高效去除上皮细胞层¹³。斑马鱼角膜造伤的挑战包括眼睛相对较小，以及在耗时较长的实验中需要持续维持鳃部的水流（如Xu及其同事所述²⁸）。该方法的主要优点在于其操作简便且快速。使用标准体视显微镜可实现对钻头的精确操控（图1）。由于操作时间较短（从麻醉开始约3分钟），鱼类在处理后恢复良好，且无需额外设备来维持麻醉和供氧。

观察角膜伤口的方法有多种。本方案采用扫描电子显微镜（SEM，图2），该技术在角膜研究中已有长期应用历史^29,30。尽管该方法无法评估上皮下层的情况，但它能简便地估算伤口愈合速度，并可用于比较眼球不同区域的角膜表面。在伤口形成后3小.......

讨论

角膜物理性损伤是眼科患者就医的最常见原因。因此，建立相关模型以研究角膜病理生理学的不同方面具有重要意义。迄今为止，小鼠是研究角膜创伤愈合最常用的模型。然而，在小鼠受伤眼部滴加眼药水以验证特定药物对角膜创伤愈合的影响可能较为困难。在这方面，斑马鱼模型特别适用于影响角膜创伤愈合分子的药理学筛选。本文所述方法与小鼠实验方法非常相似¹³。

然而，必须牢记两个具体的差异。首先，使用眼科钻头需要经过练习，以确保伤口的可重复性，特别是施加在眼球上的压力，这对实现适当的刮伤至关重要。此外，当上皮不再被有效去除时，应更换研磨头。其次，尽管斑马鱼角膜的结构和形态与其他角膜相似³¹，但该动物具有哺乳动物所无法比拟的再生能力^34,35,36。小鼠的伤口闭合通常持续48–72小时¹¹

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.1M Na-PO4 (磷酸钠缓冲液)，pH 7.4	本实验室制备		溶液由1M磷酸钠缓冲液（1M Na2 HPO4 ）用1M NaH2 PO4 调节至pH 7.4配制而成。
0.2M Na-PO4 (磷酸钠缓冲液)，pH 7.4	本实验室制备		溶液由1M磷酸钠缓冲液（1M Na2 HPO4 ）用1M NaH2 PO4 调节至pH 7.4配制而成。
0.5 mm钻头尖端	Alger Equipment Company	BU-5S
1M Tris，pH 8.8	本实验室制备
粘附标签	Agar Scientific	G3347N
Algerbrush钻头，完整仪器	Alger Equipment Company	BR2-5
棉签	Heinz Herenz Hamburg	1030128
解剖板	本实验室制备
解剖工具	Fine Science Tools
双蒸水	本实验室制备
2 ml离心管	任意供应商
氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐	Sigma	A5040	注意：可引起刺激。
戊二醛，50%水溶液，I级	Sigma	G7651	注意：有毒。
盐酸利多卡因	Sigma	L5647	注意：有毒。
样品台	Agar Scientific	G301P
培养皿	Thermo Scientific	101VR20
pH指示试纸	Macherey-Nagel	92110
塑料勺	任意供应商
15 ml塑料管	Greiner Bio-One	188271
50 ml塑料管	Greiner Bio-One	227261
扫描电子显微镜	FEI	Quanta 250 FEG
软海绵	任意供应商
溅射镀膜仪	Quorum Technologies	GQ150TS
体视显微镜	Leica