本方案表明，可利用尺寸排阻色谱法从细胞培养条件培养基中有效分离出细胞外囊泡。
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摘要
摘要
细胞外囊泡（EVs）是一类由所有细胞释放、存在于所有生物体液中的纳米级脂质膜结构，其内含有能够反映来源细胞特征的蛋白质、核酸和脂质。将EVs与样本中的其他成分有效分离，有助于对其携带物质进行表征，并揭示其作为细胞间通讯媒介以及多种疾病无创生物标志物的潜力。在本研究中，采用超滤与尺寸排阻色谱法（SEC）相结合的前沿技术，从细胞培养基中分离少突胶质细胞来源的EVs，以实现EVs与细胞外其他蛋白质及蛋白复合物的分离。利用商业化SEC柱，从人少突胶质瘤细胞在对照条件和内质网（ER）应激条件下释放的培养基中分离出EVs。经典EV标志物CD9、CD63和CD81仅在第1–4组分中被检测到，而在第5–8组分中未见表达。高尔基体蛋白GM130和内质网固有蛋白calnexin作为阴性EV标志物，在所有组分中均未检出。进一步将第1–4组分合并浓缩为EV组分，第5–8组分合并为蛋白组分后，Western blot结果显示CD63、CD81和CD9在EV组分中表达，而GM130或calnexin在两类组分中均未检测到。通过透射电子显微镜观察对照组和ER应激组的合并组分，可见EV组分中存在囊泡结构，而蛋白组分中未见囊泡。同时，采用纳米颗粒追踪分析技术对两种条件下EV组分和蛋白组分中的颗粒进行定量分析。综上，这些数据表明，SEC是一种从条件培养基中有效分离EVs的方法。
引言
近四十年来，随着细胞外囊泡（EVs）的发现，人们对研究这些纳米级异质颗粒的兴趣激增，同时用于分离和研究EVs的技术与方法也取得了重大进展。1,2这些小型膜状结构被发现含有生物活性脂质、核酸和蛋白质，在细胞间通讯中发挥重要作用3,4所有细胞类型均可释放细胞外囊泡（EVs），因此EVs存在于各种生物体液中，包括血液血浆和血清、唾液以及尿液。这些体液中的EVs在多种疾病的无创生物标志物应用方面具有巨大潜力，包括神经炎症性和神经退行性疾病、癌症以及自身免疫性疾病。5,6,7此外， 体外 可通过细胞培养技术分离培养基中释放的细胞外囊泡，进而开展机制研究3,8,9.
为了理解细胞外囊泡（EVs）在疾病病理生理学中的作用，必须将其从所处的体液中充分分离出来。长期以来，差速....
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方案
1. 缓冲液和试剂的准备
注意：在细胞培养罩内配制细胞培养试剂，以保持无菌状态。
- 细胞培养试剂的制备
- 通过加入50 mL胎牛血清制备正常的高糖DMEM培养基 将5 mL青霉素-链球菌素（Pen-Strep）加入500 mL高糖DMEM培养基中，4 °C保存。使用该培养基进行细胞的培养与扩增。
- 通过将50 mL无外泌体胎牛血清和5 mL青霉素-链霉素溶液加入500 mL高糖DMEM中配制无外泌体高糖DMEM，4 °C保存。在细胞外囊泡分离前，用此培养基处理细胞。
- 将10 mg衣霉素加入1 mL二甲基亚砜（DMSO）中配制溶液。分装至0.2 mL离心管中，每管50 µL，于-20 °C保存。
- EV分离试剂的制备
- 在1 L量筒中，将9.89 g PBS粉末加入1 L去离子（DI）水中，配制1×磷酸盐缓冲液（PBS）。将溶液置于搅拌器上搅拌，直至PBS粉末完全溶解。
- 使用高压灭菌器在加入PBS前对玻璃器皿进行灭菌。将玻璃器皿放入灭菌锅内，关闭门，于121 °C灭菌30分钟。
- 在超净工作台内，将真空泵连接至0.22 µm滤器，并将滤器置于已灭菌的瓶子上方。缓慢将PBS倒入滤器中，收集经滤过的PBS至已灭菌的瓶中。
- 在....
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结果
Western 印迹显示 EVs 与 CCM 实现了充分分离
为了评估尺寸排阻色谱法（SEC）在分离细胞培养基中细胞外囊泡（EVs）方面的有效性，使用对照样品的各个组分进行 Western 印迹分析，检测三种典型的 EV 标志物 CD9、CD63 和 CD81 的表达情况，同时检测 GM130 和 calnexin18，后者作为阴性对照（图 3）。此外，还检测了白蛋白的表达18，以确认细胞培养基中的胞外蛋白能够与 EVs 充分分离。结果显示，CD9、CD63 和 CD81 在第 1–4 组分中表达较强，而在第 5–8 组分中几乎无表达；GM130 和 calnexin 在所有组分中均未检测到。白蛋白仅存在于第 6–8 组分中。综上，这些数据表明囊泡主要洗脱至第 1–4 组分，而第 5–8 组分主要含有胞外蛋白。因此，将第 1–4 组分合并并浓缩，定义为 EV 组分；第 5–8 组分合并并浓缩，称为蛋白组分。
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讨论
SEC 是一种用户友好的方法，可有效将细胞外囊泡（EVs）从条件培养基（CCM）中分离出来。为了特异性地分离细胞来源的 EVs，必须仔细考虑 CCM 的类型及其添加成分。许多细胞培养基需要添加胎牛血清（FBS），而 FBS 中含有来源于血清采集动物的 EVs。这些血清来源的 EVs 可能会饱和并掩盖细胞培养过程中细胞自身释放的 EVs 所产生的信号26。因此，在进行实验时，应尽可能使用去 EVs 的 FBS，以确保检测到的 EVs 来源于细胞本身，而非牛源性 EVs。去 EVs 的 FBS 可通过商业途径购买，也可根据其他文献综述中所述的多种技术在实验室内部自行制备26,27。
在通过尺寸排阻色谱柱（SEC）运行样品时，必须使用经过滤的磷酸盐缓冲液（PBS）。否则，每个洗脱组分都将被来自PBS的颗粒污染，而不仅仅是细胞来源的细胞外囊泡（EVs）和细胞外蛋白。在使用PBS进行SEC之前，通过0.22 µm滤膜过滤，可确保.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢宾夕法尼亚州立大学比伦德分校和哈莫特健康基金会提供的资金支持，以及位于宾夕法尼亚州大学公园的宾夕法尼亚州立大学显微技术中心的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-巯基乙醇 | VWR | 97064-588 | |
| 4X Laemmli 样品缓冲液 | BioRad | 1610747 | |
| Amicon Ultra-15 离心滤过装置，Ultracel，3 KDa，15 mL | Sigma-Aldrich | UFC900308 | 3 kDa 截留分子量 |
| Amicon Ultra-2 带 Ultracel-3 膜的离心滤过装置 | Sigma-Aldrich | UFC200324 | 3 kDa 截留分子量 |
| 过硫酸铵 | Sigma-Aldrich | A3678-100G | |
| 抗兔 IgG，HRP 标记抗体 | Cell Signaling Technology | 7074V | 1:1000 稀释 |
| 抗钙连蛋白抗体 | Abcam | ab22595 | 1:500 稀释 |
| 抗 CD9 小鼠单克隆抗体 | BioLegend | 312102 | 1:500 稀释 |
| 抗 GM130 抗体 [EP892Y] - 顺式高尔基体标志物 | Abcam | ab52649 | 1:500 稀释 |
| 抗小鼠 IgG，HRP 标记抗体 | Cell Signaling Technology | 7076V | 1:1000 稀释 |
| 自动馏分收集器 | Izon Science | ||
| BCA 检测试剂盒 | Bio-Rad | ||
| CCD 相机 | Gatan Orius SC200 | ||
| CD63 小鼠抗人抗体 | BD | 556019 | 1:1000 稀释 |
| CD81 抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-23962 | 1:1000 稀释 |
| Cellstar 带滤帽细胞培养瓶 | Greiner Bio-One | 660175 | |
| ChemiDoc MP 成像系统 | BioRad | ||
| Clarity 西部印迹 ECL 底物 | BioRad | 1705061 | |
| 脱氧胆酸钠 | Sigma-Aldrich | D6750-10G | |
| 二硫苏糖醇 | Sigma | 3483-12-3 | |
| DMEM/高糖含 L-谷氨酰胺；不含钠 | Cytiva | SH300022.FS | |
| 优质胎牛血清 | VWR | 97068-085 | |
| 无外泌体胎牛血清 | Thermo Scientific | A2720801 | |
| 甘氨酸 | BioRad | 1610718 | |
| Great Value 脱脂奶粉 | Amazon | B076NRD2TZ | |
| HOG 人少突胶质细胞瘤细胞系 | Sigma-Aldrich | SCC163 | |
| Izon Science Usa Ltd qev 尺寸排阻色谱柱 5 支装 | Izon Science | ||
| 甲醇 >99.8% ACS | VWR | BDH1135-4LP | |
| Mini-PROTEAN 玻璃板 | BioRad | 1653310 | 带 0.75 mm 间隔垫 |
| Mini-PROTEAN 短板 | BioRad | 1653308 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | 492016 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Sigma-Aldrich | P4458-100mL | |
| 磷酸盐缓冲液 PBS | Fisher Scientific | BP66150 | |
| Pierce BCA 蛋白检测试剂盒及试剂 | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Pierce PVDF 转膜膜 | Thermo Scientific | 88518 | |
| Pierce 西部印迹滤纸 | Thermo Scientific | 84783 | |
| 聚氧乙烯-20（TWEEN 20），500 mL | Bio Basic | TB0560 | |
| 蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物（100X） | Cell Signaling Technology | 5872S | |
| 重组抗 TSG101 抗体 [EPR7130(B)] | ABCam | ab125011 | 1:1000 稀释 |
| 氢氧化钠 | Sigma-Aldrich | SX0603 | |
| 叠氮化钠 | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
| 十二烷基硫酸钠，≥99.0% (GC)，无尘颗粒 | Sigma-Aldrich | 75746-1KG | |
| 四甲基乙二胺 | Sigma-Aldrich | T9281-25ML | |
| TGX Stain-Free FastCast 丙烯酰胺试剂盒，10% | BioRad | 1610183 | |
| 透射电子显微镜 | FEI Tecnai 12 Biotwin | ||
| Tris | BioRad | 1610716 | |
| 0.25% 胰蛋白酶（含猪胰蛋白酶），HBSS，EDTA；不含钙、镁 | Cytiva | SH30042.01 | |
| 衣霉素 | Tocris | 3516 | |
| Zeta View 软件 | Analytik | NTA 软件 |
参考文献
- Pan, B. T., Teng, K., Wu, C., Adam, M., Johnstone, R. M. Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 101 (3), 942-948 (1985).
- Harding, C., Heuser, J., Stahl, P.
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重印与许可
