利用尺寸排阻色谱法从细胞条件培养基中分离细胞外囊泡

摘要

本方案表明，可利用尺寸排阻色谱法从细胞培养条件培养基中有效分离出细胞外囊泡。

摘要

细胞外囊泡（EVs）是一类由所有细胞释放、存在于所有生物体液中的纳米级脂质膜结构，其内含有能够反映来源细胞特征的蛋白质、核酸和脂质。将EVs与样本中的其他成分有效分离，有助于对其携带物质进行表征，并揭示其作为细胞间通讯媒介以及多种疾病无创生物标志物的潜力。在本研究中，采用超滤与尺寸排阻色谱法（SEC）相结合的前沿技术，从细胞培养基中分离少突胶质细胞来源的EVs，以实现EVs与细胞外其他蛋白质及蛋白复合物的分离。利用商业化SEC柱，从人少突胶质瘤细胞在对照条件和内质网（ER）应激条件下释放的培养基中分离出EVs。经典EV标志物CD9、CD63和CD81仅在第1–4组分中被检测到，而在第5–8组分中未见表达。高尔基体蛋白GM130和内质网固有蛋白calnexin作为阴性EV标志物，在所有组分中均未检出。进一步将第1–4组分合并浓缩为EV组分，第5–8组分合并为蛋白组分后，Western blot结果显示CD63、CD81和CD9在EV组分中表达，而GM130或calnexin在两类组分中均未检测到。通过透射电子显微镜观察对照组和ER应激组的合并组分，可见EV组分中存在囊泡结构，而蛋白组分中未见囊泡。同时，采用纳米颗粒追踪分析技术对两种条件下EV组分和蛋白组分中的颗粒进行定量分析。综上，这些数据表明，SEC是一种从条件培养基中有效分离EVs的方法。

引言

近四十年来，随着细胞外囊泡（EVs）的发现，人们对研究这些纳米级异质颗粒的兴趣激增，同时用于分离和研究EVs的技术与方法也取得了重大进展。^1,2这些小型膜状结构被发现含有生物活性脂质、核酸和蛋白质，在细胞间通讯中发挥重要作用^3,4所有细胞类型均可释放细胞外囊泡（EVs），因此EVs存在于各种生物体液中，包括血液血浆和血清、唾液以及尿液。这些体液中的EVs在多种疾病的无创生物标志物应用方面具有巨大潜力，包括神经炎症性和神经退行性疾病、癌症以及自身免疫性疾病。^5,6,7此外， 体外 可通过细胞培养技术分离培养基中释放的细胞外囊泡，进而开展机制研究^3,8,9.

为了理解细胞外囊泡（EVs）在疾病病理生理学中的作用，必须将其从所处的体液中充分分离出来。长期以来，差速超速离心法（dUC）一直是EVs分离的金标准¹⁰，但近年来已发展出更为精细的技术，以实现EVs与其他细胞外成分的更有效分离。这些技术包括密度梯度离心、非对称场流分离（A4F）、流式细胞术、免疫捕获、聚乙二醇沉淀以及尺寸排阻色谱法（SEC）^11,12,13。每种技术都有其各自的优缺点；然而，尤其值得注意的是，SEC已被证明在从生物体液和细胞培养上清液中分离EVs方面具有较高的有效性^8,14,15。此外，SEC还具有操作相对简便、用户友好等额外优势。

尺寸排阻色谱法（SEC）是一种根据流体组分大小进行分离的方法。该技术使用树脂柱（可自行制备或商业购买）对样品进行分级分离。样品中的小颗粒会滞留在树脂珠之间的间隙中，而较大的颗粒则能更自由地通过树脂，因此在分离过程中较早被洗脱出来。由于细胞外囊泡（EVs）的尺寸大于许多细胞外蛋白质及蛋白质聚集体，因此EVs通过色谱柱的速度更快，比细胞外蛋白质更早出现在洗脱组分中¹⁴。

在本方法学论文中，阐述了使用尺寸排阻色谱法（SEC）从人少突胶质细胞在正常对照和内质网（ER）应激条件下培养的细胞培养基（CCM）中分离细胞外囊泡（EVs）的方法。通过该方案表明，利用此技术分离出的EVs存在于特定的洗脱组分中，这些组分可合并并浓缩，用于后续表征；且所分离的EVs来源于细胞本身，而非来自补充于CCM中的外源成分，如胎牛血清（FBS）。通过蛋白质印迹法证实，在EV组分中存在典型的EV标志物CD63、CD81和CD9^16,17,18,19，而在蛋白质组分中则未检测到这些标志物。利用透射电子显微镜（TEM）对EVs进行观察，可见其具有预期的形态特征，且仅在EV组分中被检测到。同时，在正常对照和ER应激条件下的EV组分与蛋白质组分中均进行了颗粒计数，结果显示EV样本中含有大量直径在预期范围50–200 nm内的颗粒。综上所述，这些数据支持尺寸排阻色谱法是一种高效且可靠的从细胞培养基中分离EVs的方法。

方案

1. 缓冲液和试剂的准备

注意：在细胞培养罩内配制细胞培养试剂，以保持无菌状态。

1. 细胞培养试剂的制备
   1. 通过加入50 mL胎牛血清制备正常的高糖DMEM培养基 将5 mL青霉素-链球菌素（Pen-Strep）加入500 mL高糖DMEM培养基中，4 °C保存。使用该培养基进行细胞的培养与扩增。
   2. 通过将50 mL无外泌体胎牛血清和5 mL青霉素-链霉素溶液加入500 mL高糖DMEM中配制无外泌体高糖DMEM，4 °C保存。在细胞外囊泡分离前，用此培养基处理细胞。
   3. 将10 mg衣霉素加入1 mL二甲基亚砜（DMSO）中配制溶液。分装至0.2 mL离心管中，每管50 µL，于-20 °C保存。
2. EV分离试剂的制备
   1. 在1 L量筒中，将9.89 g PBS粉末加入1 L去离子（DI）水中，配制1×磷酸盐缓冲液（PBS）。将溶液置于搅拌器上搅拌，直至PBS粉末完全溶解。
   2. 使用高压灭菌器在加入PBS前对玻璃器皿进行灭菌。将玻璃器皿放入灭菌锅内，关闭门，于121 °C灭菌30分钟。
   3. 在超净工作台内，将真空泵连接至0.22 µm滤器，并将滤器置于已灭菌的瓶子上方。缓慢将PBS倒入滤器中，收集经滤过的PBS至已灭菌的瓶中。
   4. 在500 mL量筒中，将9.99 g氢氧化钠加入500 mL 1×PBS中，配制0.5 M氢氧化钠溶液。将溶液置于搅拌仪上搅拌，直至氢氧化钠完全溶解于PBS中，随后使用0.22 µm滤膜过滤至经高压灭菌的500 mL瓶中。
   5. 在500 mL量筒中，将0.25 g叠氮化钠加入500 mL 1×PBS中，配制0.05%叠氮化钠溶液。将溶液置于搅拌器上搅拌，直至叠氮化钠完全溶解，随后使用0.22 µm滤器过滤至经高压灭菌的500 mL瓶中。
3. 蛋白质分离、定量与鉴定试剂的制备
   1. 通过混合以下成分制备 100 mL RIPA 裂解缓冲液：1 mL 1 M Tris（pH 7.4）、1 mL 10% 十二烷基硫酸钠（SDS）、1 g 脱氧胆酸钠、1 mL NP-40 和 0.89 g 氯化钠（NaCl）。用去离子水定容至 100 mL。₂O，并在4 °C下保存。配制含磷酸酶和蛋白酶抑制剂的RIPA溶液时，取15 mL离心管，每1 mL RIPA裂解缓冲液中加入10 µL磷酸酶和蛋白酶抑制剂，混匀后于4 °C保存。
   2. 使用前立即配制BCA检测试剂工作液：将BCA检测试剂盒提供的10 mL试剂A与200 µL试剂B加入15 mL离心管中。使用前立即配制microBCA检测试剂工作液：将25份试剂A、24份试剂B和1份试剂C加入15 mL离心管中。
   3. 通过将30.3 g Tris碱、144 g甘氨酸和10 g SDS加入1 L去离子水中，配制10×凝胶电泳电泳缓冲液。将电泳缓冲液于4 °C保存。通过将3.03 g Tris碱、14.4 g甘氨酸和200 mL甲醇加入去离子水中并定容至1 L，配制1×转膜缓冲液。将转膜缓冲液于4 °C保存。
   4. 将2.4 g Tris碱、8 g NaCl和1 mL Tween-20加入1 L去离子水中，配制Tris缓冲盐水Tween-20（TBS-Tween）。将TBS-Tween储存于4 °C。
   5. 将5 g脱脂奶粉加入100 mL TBS-Tween中，配制5%封闭液。将封闭缓冲液于4 °C保存。
   6. 使用前立即配制化学发光底物：将 4 mL 过氧化物溶液和 4 mL 鲁米诺/增强剂溶液加入一个 15 mL 离心管中，轻轻颠倒混匀。

2. 细胞的培养与处理

1. 在两个T175细胞培养瓶中分别接种2.3 × 10⁶个人源少突胶质瘤（HOG）细胞。加入高糖DMEM培养基至终体积为25 mL，置于37 °C、含5% CO₂的细胞培养箱中培养48小时。
2. 48小时后，将无外泌体的高糖DMEM培养基在37 °C水浴中预热。处理组：向25 mL无外泌体培养基中加入25 µL浓度为10 mg/mL的衣霉素，使衣霉素终浓度为10 µg/mL，以诱导内质网应激；对照组：向25 mL无外泌体培养基中加入25 µL DMSO。
3. 移除并弃去细胞中的常规高糖DMEM培养基，用10 mL 1× PBS轻柔冲洗细胞及培养瓶，随后吸除并弃去PBS。
4. 向标记为对照组的培养瓶中加入25 mL对照培养基，向标记为处理组的培养瓶中加入含10 µg/mL衣霉素的培养基25 mL。将培养瓶放回细胞培养箱中继续培养24小时。

3. 条件培养基（CCM）的收集与浓缩（图1）

1. 将 PBS 置于 37 °C 水浴中。使用 10 倍和 100 倍物镜的复式显微镜观察培养瓶。记录各培养瓶之间的任何差异。对对照组和处理组的培养瓶均执行以下步骤。
2. 从培养瓶中移除培养基，并转移至 50 mL 离心管中。在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心 5 分钟。将上清液转移至新的 50 mL 离心管中。
3. 在 4 °C 条件下，以 2,000 × g 离心 20 分钟。将上清液转移至新的 50 mL 离心管中，并置于冰上。
4. 取四个 15 mL、截留分子量为 3 kDa 的超滤装置，向每个装置中加入 5 mL PBS。在 4 °C 条件下，以 4,000 × g 离心 10 分钟，以预处理滤膜。
   注：本实验方案使用截留分子量为 3 kDa 的超滤装置，以保留细胞释放的所有胞外蛋白。使用更高截留分子量的超滤装置（例如 30 kDa）也可行，但分子量小于 30 kDa 的胞外蛋白将被滤除并从样品中去除^20,21。
5. 移除超滤装置中的 PBS。将每种条件（对照组和衣霉素处理组）的上清液分别平均加入两个超滤装置中，每个装置约 12.5 mL 培养基。
6. 在 4 °C 条件下，以 4,000 × g 离心 1 小时 45 分钟，或直至每个超滤装置中的浓缩液（即截留液）浓缩至 250 µL 或更少。
7. 将两个对照组超滤装置中的截留液转移至一个标记好的 1.5 mL 微量离心管中。将两个处理组超滤装置中的截留液转移至另一个标记好的 1.5 mL 微量离心管中。
8. 调整每个微量离心管中截留液的总体积至 500 µL。若样品体积不足 500 µL，加入 0.22 μm 滤膜过滤的 1×PBS，使终体积达到 500 µL。将离心管置于 -80 °C 冰箱中保存。

4. 细胞收集

1. 将胰蛋白酶、PBS 和去除外泌体的 DMEM 置于 37 °C 水浴中。向对照组和处理组的培养瓶中各加入 7 mL 胰蛋白酶，并放入培养箱中孵育 5 分钟。
2. 在显微镜下观察细胞是否已脱落。若细胞未脱落，可用力轻拍培养瓶底部，使其脱离瓶壁。
3. 用 7 mL 去除外泌体的 DMEM 洗涤培养瓶。收集瓶中的细胞悬液，并转移至 15 mL 离心管中。
4. 在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，向细胞沉淀中加入 5 mL 1× PBS，轻轻吹打混匀以重悬细胞沉淀。
5. 在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，向细胞沉淀中加入 200 µL RIPA 裂解液（含磷酸酶和蛋白酶抑制剂），吹打混匀。
6. 将含有 RIPA 裂解液的细胞转移至 1.5 mL 离心管中，冰上静置 5 分钟。在 4 °C 条件下，以 14,000 × g 离心 10 分钟。
7. 将上清液转移至新的 1.5 mL 离心管中。根据处理条件和日期标记管子，并放入 -80 °C 超低温冰箱中保存。
   ​注意：本实验流程可在此处暂停。

5. 使用尺寸排阻色谱法分离EV（图2）

注意：以下步骤需分别对对照组滞留物和衣霉素处理的滞留物各执行一次。
注意：本步骤中使用的 PBS 为经 0.22 μm 滤膜过滤的 1× PBS。 

1. 打开自动组分收集器（AFC），设置收集8个组分，每个组分0.5 mL，缓冲液（空体积）体积设为默认值。
   注意： AFC运行条件如下：柱体积/床体积 = 10 mL；空体积 = 2.70 mL；冲洗体积 = 15 mL；最佳组分体积 = 500 µL；每次运行所需缓冲液体积 = 65 mL；20 °C时流速 = 1.0 mL/min；色谱柱可重复使用次数 = 5次。
2. 从4 °C取出色谱柱（见材料表），在开始实验前使其升至室温（通常约30分钟）。
3. 从-80 °C冰箱中取出截留样品，置于冰上解冻。等待期间，将八个已标记的1.5 mL离心管放入AFC转盘中，管盖朝向内侧。
4. 将色谱柱插入AFC，条形码面向读取器。按照屏幕提示操作，确认转盘中有离心管且废液收集装置正常工作后，启动收集程序。
5. 当储存缓冲液完全被色谱柱基质上部吸收后，向柱中加入15 mL 1×PBS开始冲洗。切勿过早加入PBS，否则会稀释储存缓冲液，影响充分冲洗。
6. 当15 mL PBS即将完全被基质吸收时，点击OK停止冲洗，并用移液器吸除柱基质顶部残留的PBS。注意不要触碰基质。
7. 将500 µL样品加至色谱柱中心。点击OK开始运行。观察样品完全被基质吸收后，立即快速向柱中加入8 mL PBS。
8. AFC将自动将空体积排入转盘中心，随后依次收集八个500 µL的组分。运行结束后，将各组分从转盘中取出并置于冰上。组分1–4含有EVs，组分5–8含有细胞外蛋白。清除转盘中心的空体积。
9. 收集完八个组分后，向柱中加入10 mL PBS，以洗去残留样品。待截留样品完全通过色谱柱后，再向柱中加入15 mL 1×PBS。
10. 当最后一次PBS被基质吸收时，向色谱柱基质中心加入500 µL 0.5 M氢氧化钠。待氢氧化钠被吸收后，向柱中加入30 mL 1×PBS并使其流过柱体。
11. 若需运行下一个样品，请在转盘中放入八个已标记的1.5 mL微量离心管，并重复步骤5.7–5.10。
12. 完成所有样品后，请按以下步骤处理色谱柱以备后续使用。按照步骤5.10冲洗30 mL PBS后，向柱中加入15 mL 0.05%叠氮化钠。
13. 在色谱柱基质顶部保留约5 mL叠氮化钠溶液。将色谱柱从AFC上取下，装上顶部和底部密封盖。将色谱柱放回4 °C保存（最多可使用五次）。

6. 细胞外囊泡和蛋白质组分的超滤浓缩

1. 每个样本准备两个 2 mL、截留分子量为 3 kDa 的超滤装置。一个用于浓缩细胞外囊泡（EV）组分（第 1–4 组分），另一个用于浓缩蛋白组分（第 5–8 组分）。每个装置由三部分组成：锥形管、滤膜和穿流液收集管；请正确标记各部分。
2. 组装超滤装置，在滤膜部分加入 1 mL 经 0.22 μm 滤膜过滤的 1× PBS，并用锥形管盖紧。将超滤装置倒置（锥形管朝上），在 4 °C 条件下以 3,500 × g 离心 10 分钟。
3. 从穿流液收集管中移除滤过的 PBS。将超滤装置翻转至倒置状态（锥形管朝下），在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 2 分钟。从锥形管中去除残留的 PBS。
4. 向每个超滤装置中加入相应的组分（全部 500 µL 体积），使总体积达到 2 mL。将超滤柱锥形管朝上，在 4 °C 条件下以 3,500 × g 离心 1 小时 45 分钟，或直至截留液体积浓缩至 100 µL。
5. 取下穿流液收集管，弃去穿流液。将超滤装置翻转至倒置状态（锥形管朝下），在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 2 分钟。
6. 将锥形管中的截留液转移至已标记的 1.5 mL 微量离心管中，并用 0.22 µm 滤膜过滤的 1× PBS 将各样本体积补至 150 µL。将离心管置于 -80 °C 冰箱中保存。
   ​注意：本实验方案可在此处暂停。

7. 媒体控件

1. 取两个 T175 细胞培养瓶，分别标记为对照组和处理组。将无外泌体的高糖 DMEM 培养基置于 37 °C 水浴中预热。
2. 向 25 mL 培养基中加入 25 µL 衣霉素储存液（10 mg/mL），加入标记为处理组的培养瓶中；向另一份 25 mL 培养基中加入 25 µL DMSO，加入标记为对照组的培养瓶中。将两个培养瓶置于细胞培养箱中孵育 24 小时。
3. 收集培养上清液，并按照步骤 3.2–3.8 所述方法分离细胞外囊泡（EVs）。随后，执行第 5 和第 6 部分中描述的所有步骤。

8. 蛋白质印迹法

1. 使用BCA法对细胞裂解液和蛋白质组分进行蛋白质定量
   注意：对照组和衣霉素处理组样品的蛋白质定量均按以下步骤进行。
   1. 将裂解的细胞和蛋白质组分在冰上解冻。为每个样品制备三个稀释度的样品管：1:2、1:10 和 1:100。
   2. 在96孔透明底检测板中，每孔加入25 µL牛血清白蛋白（BSA）蛋白标准品和25 µL各样品稀释液，每个样品设三个复孔。使用多通道移液器向含标准品或样品的每孔中加入200 µL工作试剂 。
   3. 将检测板在37 °C孵育30分钟，然后使用酶标仪在562 nm波长下读取吸光度。计算各样品中的蛋白浓度，并确定为获得细胞裂解液20 µg蛋白和蛋白质组分15 µg蛋白所需的样品体积。
2. 使用microBCA法对EV组分进行蛋白质定量
   1. 将EV样品在冰上解冻。为每个样品制备两个稀释度：1:50 和 1:100。
   2. 在96孔透明底检测板中，每孔加入100 µL BSA蛋白标准品和100 µL各样品稀释液，每个样品设三个复孔。使用多通道移液器向含标准品或样品的每孔中加入100 µL microBCA工作试剂。
   3. 将检测板在37 °C孵育2小时，然后使用酶标仪在562 nm波长下读取吸光度。计算各样品中的蛋白浓度，并确定为获得EV组分15 µg蛋白所需的样品体积。
3. 蛋白质印迹（Western blotting）
   注意：蛋白质印迹实验方案参照文献²²所述方法进行，并根据下述内容进行了修改。
   1. 使用凝胶制备试剂盒，按照制造商说明书配制10%聚丙烯酰胺凝胶。
   2. 进行凝胶电泳时，将细胞裂解液样品在1.5 mL离心管中混合：加入所需体积的细胞裂解液（含20 µg蛋白）、5 µL 4x Laemmli缓冲液，以及适量RIPA缓冲液，使总体积达到20 µL。
   3. 将EV和蛋白质组分样品在1.5 mL离心管中混合：加入所需体积的样品（含15 µg蛋白）、5 µL 4x Laemmli缓冲液，以及RIPA缓冲液至总体积20 µL。
   4. 将培养基对照样品在1.5 mL离心管中混合：加入15 µL样品和5 µL 4x Laemmli缓冲液。
      注意：根据所用抗体的不同，Laemmli缓冲液中可能需要或不需要添加还原剂，例如50 mM二硫苏糖醇（DTT）。
   5. 将所有样品在95 °C煮沸5分钟，转移至冰上冷却，短暂离心（10,000 × g，30秒），然后放回冰上。
   6. 将凝胶装入电泳槽，加入1x凝胶电泳运行缓冲液。每孔加入15 µL蛋白分子量标记物和20 µL样品。以200 V电压电泳30–50分钟，或直至样品迁移至凝胶底部、即将跑出为止。
   7. 在4 °C条件下，使用1x转膜缓冲液、100 V电压转膜30分钟，或直至转膜完成。 补充图1、补充图2 和 补充图3 显示了每次转膜完成后无染色成像结果。
   8. 将膜在含5%脱脂奶粉的TBS-Tween缓冲液中，室温摇床上封闭1小时。随后在4 °C摇床上与一抗溶液孵育过夜。一抗稀释比例见 表1。
   9. 次日，弃去一抗溶液，将膜在室温摇床上用TBS-Tween缓冲液洗涤3次，每次5分钟。
   10. 在含5%脱脂奶粉的TBS-Tween缓冲液中配制合适的二抗溶液。稀释比例见 表1。将二抗加入膜上，在室温摇床上孵育1小时，随后在室温摇床上用TBS-Tween缓冲液洗涤3次，每次5分钟。
   11. 向膜上加入化学发光底物，在室温摇床上孵育5分钟。使用比色法和化学发光法对印迹结果进行成像。 补充图4、补充图5 和 补充图6 显示了各印迹图的未裁剪原始图像。

9. 透射电子显微镜成像

1. 对400目碳/福尔马膜载网进行辉光放电处理²³，以去除碳氢化合物并使载网具有亲水性。
2. 向载网上滴加5 µL的EV或蛋白组分样品，在室温下孵育3–5分钟。
3. 用滤纸通过毛细作用吸除多余液体，再用5 µL超纯水洗涤载网，并再次用滤纸吸除多余水分。
4. 滴加5 µL 1%醋酸铀酰水溶液，立即用滤纸吸除，待载网干燥后，在透射电子显微镜下以120 kV电压成像，并使用电荷耦合器件相机采集图像。

10. 纳米颗粒示踪分析（NTA）

1. 从 -80 °C 取出 EV 和蛋白质组分样品，在冰上解冻。
2. 打开计算机和 NTA 仪器。启动 NTA 软件，软件将自动开始初始化。
3. 选择含有无颗粒水的合适泵，点击 冲洗仪器 以冲洗测量池。在冲洗过程中，使用注射器向仪器前端的进样口注入 10–20 mL 无颗粒水，并避免产生气泡。
4. 细胞质量检查界面将弹出；点击 确定，细胞质量检查将开始。检查成功通过后，将弹出自动校准界面，提示：请用 100 nm 校准悬浮液（稀释比例 1:250,000）填充测量池。
   1. 通过向试管中加入 10 mL 无颗粒水和 10 µL 100 nm 聚苯乙烯微球制备校准悬浮液稀释液 1（1:1,000 稀释）。轻轻颠倒混匀。稀释液 1 在 4 °C 下可保存 2–3 天。
   2. 通过向试管中加入 20 mL 无颗粒水和 80 µL 稀释液 1（1:1,000）制备校准悬浮液稀释液 2，得到 1:250,000 的稀释比例。轻轻颠倒试管混匀。稀释液 2 在室温下可保存 30–60 分钟。
5. 用 2 mL 稀释液 2（1:250,000）填充测量池。点击 确定，程序将完成自动校准（聚焦）和聚焦优化。分析选项卡将打开，生成一个曲线图，以抛物线形式显示测量池清洁度和对称性的结果。随后将弹出提示“视频显微镜现已准备就绪，可进行实验”的窗口；点击 确定，程序将返回至细胞检查选项卡。
6. 通过向进样口注入无颗粒水冲洗测量池中的聚苯乙烯微球。持续冲洗，直至检测到的颗粒数在 0–10 范围内（通常需 5–10 mL）。加入 1 mL 0.22 µm 过滤的 PBS，为第一个样品预处理测量池。
7. 用 0.22 µm 过滤的 PBS 稀释第一个样品（起始稀释比例为 1:1000），并将稀释倍数输入程序。向测量池中加入 1 mL 样品，等待 5 分钟，使颗粒运动速度减慢，因为初始阶段颗粒在视野中移动非常迅速。将灵敏度和快门值分别设为 75.0 和 100。
8. 理想样品稀释条件下，检测到的颗粒数应为 50–200 个。若检测到的颗粒数低于 50 或高于 200，需调整样品稀释倍数。若需重新稀释，先用无颗粒水冲洗测量池，直至检测到的颗粒数为 0–10。重复加样和冲洗步骤，直至找到理想稀释比例。
9. 检查全部 11 个摄像位置，确认颗粒运动已减慢，并确保各摄像位置检测到的颗粒数相近。若不同摄像位置间颗粒数差异显著，可添加更多样品。
10. 点击 测量 选项卡，然后点击 运行视频采集。在视频采集选项卡中，为样品输入自定义名称并指定安全的存储位置。勾选 autosave.txt 和 autosave.pdf 选项，以保存数据。
11. 将温度设为 25 °C，点击 488 nm 设置激光，点击 11 选择摄像位置。点击 确定 开始数据采集。程序将开始分析全部 11 个位置的颗粒数量和尺寸。在分析选项卡中，将出现柱状图，横轴为直径（nm），纵轴为颗粒数/mL。
12. 数据采集完成后，将弹出标题为“位置概览”的窗口，显示每个摄像位置的数据。若超过两个位置被排除在分析之外，请使用更多样品重复实验步骤。若未超过，点击 继续 按钮。将打开一个 PDF 和一个 txt 文件，包含实验结果。请将文件保存至安全位置。
13. 若需运行下一个样品，请转至 细胞检查 选项卡，并重复步骤 10.6 至 10.12。若已完成所有样品检测，则用无颗粒水冲洗测量池，直至检测到的颗粒数为 0–10（约 5–10 mL）。再用 1 mL 0.22 µm 过滤的 PBS 冲洗测量池，关闭程序，并关闭计算机。

结果

Western 印迹显示 EVs 与 CCM 实现了充分分离
为了评估尺寸排阻色谱法（SEC）在分离细胞培养基中细胞外囊泡（EVs）方面的有效性，使用对照样品的各个组分进行 Western 印迹分析，检测三种典型的 EV 标志物 CD9、CD63 和 CD81 的表达情况，同时检测 GM130 和 calnexin¹⁸，后者作为阴性对照（图 3）。此外，还检测了白蛋白的表达¹⁸，以确保细胞培养基中的胞外蛋白能够与 EVs 充分分离。结果显示，CD9、CD63 和 CD81 在第 1–4 组分中表达较强，而在第 5–8 组分中几乎无表达；GM130 和 calnexin 在所有组分中均未检测到。白蛋白仅存在于第 6–8 组分中。综上，这些数据表明囊泡主要洗脱至第 1–4 组分，而第 5–8 组分主要含有胞外蛋白。因此，将第 1–4 组分合并并浓缩，定义为 EV 组分；第 5–8 组分合并并浓缩，称为蛋白组分。

讨论

SEC 是一种用户友好的方法，可有效将细胞外囊泡（EVs）从条件培养基（CCM）中分离出来。为了特异性地分离细胞来源的 EVs，必须仔细考虑 CCM 的类型及其添加成分。许多细胞培养基需要添加胎牛血清（FBS），而 FBS 中含有来源于血清采集动物的 EVs。这些血清来源的 EVs 可能会饱和并掩盖细胞培养过程中细胞自身释放的 EVs 所产生的信号²⁶。因此，在进行实验时，应尽可能使用去 EVs 的 FBS，以确保检测到的 EVs 来源于细胞本身，而非牛源性 EVs。去 EVs 的 FBS 可通过商业途径购买，也可根据其他文献综述中所述的多种技术在实验室内部自行制备^26,27。

在通过尺寸排阻色谱柱（SEC）运行样品时，必须使用经过滤的磷酸盐缓冲液（PBS）。否则，每个洗脱组分都将被来自PBS的颗粒污染，而不仅仅是细胞来源的细胞外囊泡（EVs）和细胞外蛋白。在使用PBS进行SEC之前，通过0.22 µm滤膜过滤，可确保...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-巯基乙醇	VWR	97064-588
4X Laemmli 样品缓冲液	BioRad	1610747
Amicon Ultra-15 离心滤过装置，Ultracel，3 KDa，15 mL	Sigma-Aldrich	UFC900308	3 kDa 截留分子量
Amicon Ultra-2 带 Ultracel-3 膜的离心滤过装置	Sigma-Aldrich	UFC200324	3 kDa 截留分子量
过硫酸铵	Sigma-Aldrich	A3678-100G
抗兔 IgG，HRP 标记抗体	Cell Signaling Technology	7074V	1:1000 稀释
抗钙连蛋白抗体	Abcam	ab22595	1:500 稀释
抗 CD9 小鼠单克隆抗体	BioLegend	312102	1:500 稀释
抗 GM130 抗体 [EP892Y] - 顺式高尔基体标志物	Abcam	ab52649	1:500 稀释
抗小鼠 IgG，HRP 标记抗体	Cell Signaling Technology	7076V	1:1000 稀释
自动馏分收集器	Izon Science
BCA 检测试剂盒	Bio-Rad
CCD 相机	Gatan Orius SC200
CD63 小鼠抗人抗体	BD	556019	1:1000 稀释
CD81 抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-23962	1:1000 稀释
Cellstar 带滤帽细胞培养瓶	Greiner Bio-One	660175
ChemiDoc MP 成像系统	BioRad
Clarity 西部印迹 ECL 底物	BioRad	1705061
脱氧胆酸钠	Sigma-Aldrich	D6750-10G
二硫苏糖醇	Sigma	3483-12-3
DMEM/高糖含 L-谷氨酰胺；不含钠	Cytiva	SH300022.FS
优质胎牛血清	VWR	97068-085
无外泌体胎牛血清	Thermo Scientific	A2720801
甘氨酸	BioRad	1610718
Great Value 脱脂奶粉	Amazon	B076NRD2TZ
HOG 人少突胶质细胞瘤细胞系	Sigma-Aldrich	SCC163
Izon Science Usa Ltd qev 尺寸排阻色谱柱 5 支装	Izon Science
甲醇 >99.8% ACS	VWR	BDH1135-4LP
Mini-PROTEAN 玻璃板	BioRad	1653310	带 0.75 mm 间隔垫
Mini-PROTEAN 短板	BioRad	1653308
NP-40	Sigma-Aldrich	492016
青霉素-链霉素溶液	Sigma-Aldrich	P4458-100mL
磷酸盐缓冲液 PBS	Fisher Scientific	BP66150
Pierce BCA 蛋白检测试剂盒及试剂	Thermo Fisher Scientific	23227
Pierce PVDF 转膜膜	Thermo Scientific	88518
Pierce 西部印迹滤纸	Thermo Scientific	84783
聚氧乙烯-20（TWEEN 20），500 mL	Bio Basic	TB0560
蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物（100X）	Cell Signaling Technology	5872S
重组抗 TSG101 抗体 [EPR7130(B)]	ABCam	ab125011	1:1000 稀释
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	SX0603
叠氮化钠	Fisher Scientific	BP922I-500
氯化钠	Sigma-Aldrich	S9888-500G
十二烷基硫酸钠，≥99.0% (GC)，无尘颗粒	Sigma-Aldrich	75746-1KG
四甲基乙二胺	Sigma-Aldrich	T9281-25ML
TGX Stain-Free FastCast 丙烯酰胺试剂盒，10%	BioRad	1610183
透射电子显微镜	FEI Tecnai 12 Biotwin
Tris	BioRad	1610716
0.25% 胰蛋白酶（含猪胰蛋白酶），HBSS，EDTA；不含钙、镁	Cytiva	SH30042.01
衣霉素	Tocris	3516
Zeta View 软件	Analytik		NTA 软件