利用一种简单且经济高效的DNA提取方法分析易感狼疮小鼠肠道微生物群动态变化

摘要

本方案提供了一种简单且经济高效的DNA提取方法，用于分析自身免疫性疾病发展过程中小鼠肠道微生物群的变化。

摘要

肠道微生物群在免疫系统的发育过程中发挥着重要作用。这种关系对于理解自身免疫性疾病至关重要，因为这些疾病不仅由遗传因素驱动，还受到可触发疾病发生和/或加重病程的环境因素影响。先前一项关于易患狼疮的MRL/lpr雌性小鼠肠道微生物群动态变化的研究表明，肠道微生物群的改变能够影响疾病进展。本文介绍了一种用于自身免疫研究的肠道微生物群代表性样本提取方案。微生物群样本从肛门采集并进行处理，随后采用苯酚-氯仿法提取DNA，并通过酒精沉淀法纯化。PCR扩增后，纯化的扩增子在美国阿贡国家实验室利用下一代测序平台进行测序。最后，对16S核糖体RNA基因测序数据进行分析。以MRL/lpr小鼠在有或无CX₃CR1条件下的肠道微生物群比较为例展示结果。数据显示，在包含致病菌的变形菌门（Proteobacteria）所属的属以及被认为属于健康共生微生物群的双歧杆菌属（Bifidobacterium）中存在显著差异。总之，这种简单且经济高效的DNA分离方法具有良好的可靠性，有助于研究与自身免疫性疾病相关的肠道微生物群变化。

引言

人类与细菌已共存了很长时间，建立了相互依赖且互惠互利的关系，这种关系在数量和质量上均影响宿主的免疫应答¹。近期研究表明，肠道微生物群的组成与多种自身免疫性疾病的发病机制相关，包括多发性硬化症²、类风湿关节炎³、2型糖尿病⁴、炎症性肠病⁵以及系统性红斑狼疮（SLE）⁶。然而，肠道微生物群是这些自身免疫性疾病的主要致病因素还是继发性效应，目前尚不明确⁷。肠道微生物群可能在自身免疫疾病效应阶段加重病情，也可能在调控这些疾病的诱导过程中发挥作用⁸。

已有研究报道，在雌性狼疮易感型 MRL/Mp-Faslpr (MRL/lpr) 小鼠中存在肠道菌群失调，且观察到肠道微生物群发生改变，其中乳杆菌属（Lactobacilli）显著减少⁹。当经口给予这五种乳杆菌菌株的混合物后，这些小鼠的狼疮样症状明显减轻，提示微生物群在调控系统性红斑狼疮（SLE）发病机制中具有重要作用。

以下DNA提取技术可用于追踪易感狼疮小鼠在发生类似系统性红斑狼疮（SLE）疾病过程中肠道菌群的动态变化，并对其进行定性和定量分析。无论研究目标是分析健康状态下的肠道菌群，还是界定菌群失调，都必须严格评估数据采集方法，确保其准确性与可重复性¹⁰。该过程中的每一步均至关重要。必须采用适当的方法提取微生物DNA，因为在DNA提取过程中任何可能引入偏差的问题，均会导致微生物组成表征失真。本文描述的是苯酚-氯仿法，但也有商业化的试剂盒可用于细菌DNA提取，在特定情况下效果良好¹¹。然而，这些试剂盒的应用受限于成本以及所需样本量。

本文所述方案成本低廉，仅需少量样本。该方法适用于各种类型的粪便样本，可用于研究肠道微生物群随时间的动态变化以及不同组别之间的比较。DNA通过乙醇纯化法进行分离，该方法使用苯酚、氯仿和异戊醇。基于乙醇的提取有助于清除并去除样本中的蛋白质和脂质，DNA在最后一步中沉淀析出。该方法具有显著较高的提取效率和质量，已被证实能够准确鉴定细菌种群。操作过程中一个关键注意事项是可能发生DNA污染，因此需要进行适当的样本处理¹²。

随后，使用针对16S rRNA基因的下一代测序平台（如Illumina MiSeq）对DNA进行分析。特别是对V4高变区进行分析，以实现对高阶分类单元更准确的定量¹³。后续的生物信息学分析被外包进行，然后使用标准统计方法在本实验室内部进一步分析。目前有多种开源的生物信息学软件可用于测序数据的下游分析，所采用的分析类型在很大程度上取决于具体的研究问题¹⁴。本实验方案重点关注测序前的实验步骤，提供了一种更为通用、经济、可比性强且高效的从粪便样本中提取DNA的方法。

方案

将 B6.129P2(Cg)-Cx3cr1^tm1Litt/J 小鼠的 Cx3cr1^gfp/gfp 基因座回交至 MRL/MpJ-Fas^lpr/J（MRL/lpr）小鼠中，共进行 10 代，以生成 MRL/lpr-CX₃CR1^gfp/gfp 小鼠。通过单核苷酸多态性（SNP）面板进行基因组筛查，确认新生成小鼠的遗传背景与 MRL/lpr 小鼠的相似度超过 97%。随后，小鼠在弗吉尼亚理工学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）规定的特定病原体-free 环境中饲养和维持。在小鼠 13、14 和 15 周龄时采集样本。

1. 小鼠微生物群样本的采集

1. 将每只小鼠单独从笼中取出。直接从肛门采集粪便颗粒，并在处理前储存于 -80 °C。使用无菌且洁净的镊子、离心管和手套处理样品。
   注意：可使用容器（例如烧杯）盛放等待排便的小鼠。每次使用前后均需用乙醇清洁容器。
2. 将一个冷冻的粪便颗粒加入已预先称重的 2 mL 螺旋盖离心管中。记录粪便重量（单位为克），每粒粪便的重量应在 0.02–0.05 g 之间。
3. 向粪便颗粒中加入一层薄薄的 0.1 mm 玻璃珠、500 µL 裂解缓冲液（50 mM NaCl、5 mM Tris 和 50 mM EDTA）以及 200 µL 20% SDS。
4. 在均质器中以最大功率进行珠磨震荡 4 分钟，随后涡旋震荡 3–5 分钟。
5. 短暂离心以消除气泡和泡沫（按下离心机按钮，使其达到 1,000–1,200 × g 后松开）。

2. DNA 提取

1. 取步骤1.5中获得的上清液350 µL（确保不携带任何残渣），转移至新的1.5 mL旋盖管中。加入500 µL苯酚-氯仿-异戊醇（PCI；25:24:1，v/v）混合液，涡旋振荡1分钟。
   注意：此后所有操作均需在化学通风橱内进行。PCI具有毒性。
2. 在4 °C下以6,000 × g离心3分钟。将水相（上层）180 µL转移至新的1.5 mL旋盖管中。加入180 µL（1:1）氯仿，颠倒混匀。
   注意：转移上层液体时，尽量避免底层污染。
3. 在4 °C下以18,400 × g离心3分钟。将180 µL水相转移至新的旋盖管中。
   注意：弃去PCI和氯仿后，后续步骤可在生物安全柜中进行。
4. 加入180 µL预冷的异丙醇和36 µL 5 M NH₄Ac。轻轻颠倒数次以混匀，将管子置于冰上静置20分钟。
5. 在4 °C下以18,400 × g离心20分钟。倾去上清液。用500 µL预冷的70%乙醇反复洗涤沉淀，同时轻轻颠倒。
   注意：乙醇应使用双蒸灭菌水稀释配制。
6. 在4 °C下以18,400 × g离心3分钟。弃去上清液以去除残留乙醇。
7. 将管子倒置于纸巾上晾干20分钟，直至沉淀变得透明。将沉淀溶于50 µL分子生物学级水中。在37 °C加热10分钟，以充分溶解较大的DNA沉淀。
8. 加热后短暂离心，使管盖上的冷凝液滴回到管底（3,400 × g离心1分钟）。
9. 使用分光光度计测定DNA浓度并获取260/280比值，以分子生物学级水作为空白对照。高质量DNA的260/280比值应在1.8至2.0之间。
   ​注意：每粒粪便样本预期DNA产量至少为0.03 g。

16S rRNA基因测序的样品制备

1. 将DNA样本送至阿贡国家实验室，进行文库制备，并在Illumina MiSeq上进行测序。
   1. 使用全裙边96孔板送样，样本按行排列（A1-A12、B1-B12等），并用铝箔板封膜密封。
   2. 每孔送样体积为20 µL，终浓度范围为1–50 ng/µL。
      注意：应使用分子级水进行稀释。
   3. 样本制备完成后，在室温下以600 × g 离心1分钟，随后在-80 °C冷冻24小时。
   4. 使用干冰进行 overnight 运输。

结果

阿贡国家实验室的结果由合格的生物信息学专家进行分析，随后使用标准统计方法对数据进行内部分析。典型的微生物组分析包括将相似序列聚类为操作分类单元（OTUs）或扩增子序列变体（ASVs），以此作为样本中不同微生物的代理指标。通过比较各样本中OTUs或ASVs的数量，可检验样本内（α）多样性及样本间（β）多样性的变化情况，也可用于检验在不同元数据类别中丰度存在差异的分类单元。

如图1所示，缺乏受体CX₃CR1的小鼠品系具有不同的肠道微生物群组成。与野生型MRL/lpr小鼠相比，MRL/lpr-CX₃CR1^gfp/gfp小鼠（表达绿色荧光蛋白而非CX₃CR1）在某些与潜在致病菌相关的属中表现出显著差异，例如变形菌门（Proteobacteria）中的细菌。此外，在某些“健康”的共生菌如Bifidobacterium中也观察到一些差异，但在Lactobacillus中未观察到差异。

讨论

平衡的肠道微生物群可以保护人体免受疾病侵害。一旦这种平衡被外部或内部因素打破，后果可能十分严重。本方法介绍了一种分析小鼠模型中肠道微生物群动态变化的技术。该方法不仅适用于不同组别之间的比较，还可用于追踪肠道微生物群随时间的变化，从而更有效地识别影响肠道微生物群的时间依赖性因素。

实验中的所有小鼠必须在相同的环境中进行处理。采集粪便样本时，一个需要考虑的重要因素是时间、日期和地点的一致性。小鼠具有食粪行为，这意味着它们会食用自身或周围环境中的粪便以获取必需的营养物质。因此，不能从笼子中收集粪便样本。样本必须新鲜且直接从肛门采集。最佳方法是在手持小鼠时对其进行按摩，或将小鼠放入容器中使其自然排便。此外，建议所有样本在采集后同时进行处理，并在等待全部样本收集完成期间立即于 -80 °C 冷冻保存。

DNA 提取对移液和操作极为敏感，因此所有样品应同时进行处理。另一个需要考虑的因素是避免环境污染；因此，即使某些步骤无需在化学通风橱内进行（因未使用有毒试剂），也应在生物安全柜中完成。尽管环境污染的可能性较低，且本方法中不存在允许细菌生长...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.1 mm 玻璃珠	BioSpec Products	11079101
2 mL 螺旋盖管	Thermo Fisher Scientific	3488
20% SDS	FisherScientific	BP1311-1	SDS 20%
96% 乙醇，分子生物学级	Thermo Fisher Scientific	T032021000CS
乙酸铵 (5 M)	Thermo Fisher Scientific	AM9071	NH4AC 5M
B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J	Jackson Laboratory	005582
Bullet Blender storm 24	Next Advance	4116-BBY24M	匀浆器
氯仿	FisherScientific	C298-500
DEPC 处理水	Thermo Fisher Scientific	AM9916
乙二胺四乙酸	FisherScientific	BP118-500	EDTA
铝箔板封膜	FisherScientific	NC0302491
Kimwipes-Kimtech 34256	FisherScientific	06-666C
MRL/MpJ-Faslpr/J (MRL/lpr) 小鼠	Jackson Laboratory	000485
Nanodrop 2000 分光光度计	Thermo Fisher Scientific	ND2000CLAPTOP
苯酚:氯仿:异戊醇 (25:24:1)	FisherScientific	BP1752I-400	PCI
四位小数天平	Mettler Toledo	MS205DU
带裙边的 96 孔板	Thermo Fisher Scientific	AB-0800
氯化钠	FisherScientific	15528154	NaCl
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐	FisherScientific	BP1757-100
涡旋振荡器	Scientific Industries	SI-0236