基于外泌体的多巴胺载体系统的配方和表征

摘要

在这里，我们旨在通过从沃顿果冻间充质干细胞中分离的干细胞外泌体的多巴胺负载来获得一种制剂。外泌体分离和表征，药物加载到所得外泌体中，以及所开发制剂的细胞毒性活性在本方案中描述。

摘要

大小在 40 到 200 nm 之间的外泌体构成了细胞外囊泡的最小亚群。这些由细胞分泌的生物活性囊泡在细胞间货物和通讯中起着积极作用。外泌体主要存在于体液中，如血浆、脑脊液、尿液、唾液、羊水、初乳、母乳、关节液、精液和胸膜酸。考虑到外泌体的大小，人们认为它们可能在中枢神经系统疾病中发挥重要作用，因为它们可以穿过血脑屏障 （BBB）。因此，本研究旨在通过将多巴胺封装到从沃顿果冻间充质干细胞（WJ-MSCs）中分离的外泌体中来开发一种基于外泌体的纳米载体系统。通过表征过程的外泌体与多巴胺一起孵育。负载多巴胺的外泌体在孵育结束时重新表征。在药物释放和细胞毒性测定中研究了多巴胺负载的外泌体。结果表明，多巴胺可以成功地包封在外泌体内，并且负载多巴胺的外泌体不影响成纤维细胞的活力。

引言

外泌体是具有显着特征的生物活性囊泡，大小范围为 40 nm 至 200 nm。外泌体起源于细胞膜，是由于内体¹ 的释放而形成的。这些结构充当细胞间的通讯器，并与相邻细胞相互作用，以促进活性分子的转移。外泌体可以从许多不同的来源分离出来。这些包括体液，如血浆、尿液、脑脊液、唾液，以及在 体外 条件下培养的细胞系。外泌体在消除神经损伤方面发挥着重要作用，这要归功于它们所含的生物大分子，如脂质、蛋白质和核酸²。胶质是神经系统³ 的支持细胞， 通过 外泌体⁴ 将蛋白质和微 RNA 转移到神经元的轴突。

形成髓鞘的脂质是神经传导的特征，也通过外泌体从少突胶质细胞中释放出来 ^4,5。外泌体还参与突触可塑性、神经元应激反应、细胞间通讯和大脑神经发生等过程 ^6,7。外泌体具有纳米尺寸的事实使它们能够通过BBB。穿透该膜后，从间质液到脑脊液有一条特殊的过渡^途径8。由于其表面....

方案

注意:有关本协议中使用的所有材料和设备的详细信息，请参阅 材料表 。

1. 沃顿果冻间充质干细胞的培养和冷冻保存

1. 从-80°C冰箱中取出WJ-MSC（来自ATCC）。将细胞接种到含有补充有 10% 胎牛血清 （FBS） 的 DMEM-F12 培养基的烧瓶中。将它们在37°C下在含有5%CO₂的培养箱中孵育。
2. 每 2 天更换一次培养基。当细胞达到 80% 汇合度时传代细胞。用 5 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤要传代的细胞。
   注意:在加入胰蛋白酶之前用PBS洗涤可确保细胞与烧瓶表面轻松分离。
3. 取出PBS，向烧瓶中加入5mL胰蛋白酶-EDTA溶液。将烧瓶在37°C下在含有5%CO₂的培养箱中孵育5分钟。
4. 将上清液收集到管中，并以1,500× g 离心5分钟。离心后，除去上清液，通过移液向管中加入 1 mL DMEM-F12 + 10% FBS。
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结果

外泌体分离和表征
当培养物达到足够的密度时，将沃顿果冻干细胞培养并在无血清培养基中孵育48小时。孵育结束后，将上清液储存在-20°C。 将收集的上清液用PBS稀释并进行超速离心（图1）。通过NTA和DLS分析分析得到的溶液。外泌体通过0.22μm过滤器进行灭菌。获得的外泌体的平均大小被确定为 98 nm（视频 1）。离心结束时获得约100亿个外泌体颗粒。NTA和DLS分析揭示的纳米颗粒数量彼此一致。此外，源自WJ-MSCs的外泌体的zeta电位测量为-15.7mV（图2 和 图3）。

视频1:沃顿果冻衍生外泌体的纳米颗粒跟踪分析。

讨论

外泌体是大多数细胞类型分泌的尺寸为 40-200 nm 的小膜囊泡，例如 MSCs¹。外泌体能够实现细胞之间的通讯，可以以不同的方式进入细胞，例如内吞作用、吞噬作用、微胞饮作用、脂质介导的内化和融合^33,44。与其他纳米载体系统相比，在外泌体表面发现的脂质和胆固醇赋予了携带亲水性和疏水性分子的能力，胆固醇末端的氢键允许紧密包装⁴⁵。

本研究采用MSC来源的外泌体分离、载药实验和细胞毒性试验等方法。众所周知，外泌体在神经发生中起着重要作用，特别是在大脑中，此外还具有重要的功能，例如货物和细胞之间的交流^6,7。此外，MSC衍生的外泌体具有相对良好的耐受性，具有固有的治疗特性，并显示出高稳定性和归巢能力^46,47<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 和微量;m 膜过滤器	Aisimo		用于灭菌过程
0.45 µm 针式过滤器	Aisimo		用于灭菌过程
15 mL Falcon 管	巢		用于细胞培养步骤
25 cm2 细胞培养瓶 （Falcon， TPP 组织培养瓶	巢		用于细胞培养步骤
50 mL Falcon 管	巢		用于细胞培养步骤
75 cm2 细胞培养瓶（Falcon、TPP 组织培养瓶	巢		用于细胞培养步骤
96 孔板（Falcon、TPP 微孔板）	Merck Millipore		用于细胞培养步骤
乙腈	Sigma	271004-1L	用于 HPLC 分析
高压灭菌器	NUVE-OT 90L		用于灭菌过程
细胞培养舱	Hera Safe KS		用于细胞培养过程
离心式	日立	CF16RN	用于外泌体分离步骤
CO2 培养箱，带 Safe Cell UV	Panasonic		用于细胞培养过程
盐酸多巴胺 H8502-10G	Sigma	H8502-10G	用于外泌体多巴胺负载
Dulbecco's 改良 Eagle's 培养基/营养混合物-F12	Sigma	RNBJ7249	用作细胞培养基
胎牛血清-FBS	Capricorn	FBS-16A	通过添加到细胞培养基中使用。
冷冻室 -80 °CC	松下	MDF-U5386S-PE	储存细胞和所得外泌体
冰箱	松下	MPR-215-PE	用于储存细胞培养物和其他材料
高效液相色谱-HPLC	安捷伦科技		研究了所得制剂含量中多巴胺的存在。
显微镜 - Primovert	Zeiss		用于观察细胞培养中的细胞。
MTT 检测	Biomatik		用于测量细胞活力
NanoSight NS300	马尔文帕尔	文帕尔科	用于外泌体表征
Optima XPN-100 超速离心机	贝克曼库尔特		用于外泌体分离步骤
PBS 片	Biomatik	43602	制备 PBS 溶液
青霉素/链霉素溶液	Capricorn	PB-S将其添加到	培养基中以防止细胞培养中的污染。
移液器辅助	Isolab
精密天平-	Kern Kern-ABJ220-4NM		用于制备溶液
Q500	Sonicator Qsonica， LLC		用于在 HPLC 分析中消化外泌体
皂苷	Sigma	47036-50G-F	在外泌体多巴胺加载过程中将其添加到总溶液中。
Spectrostar-Nano-Spectrophotometry	BMG LABTECH		用于 MTT 和药物释放分析
SPSS 22			统计包程序
Vorteks-FinePCR	FinePCR-FineVortex		用于均匀混合溶液
水浴 37 °C-Senova	Senova		用于细胞培养步骤
Wharton's 果冻间充质干细胞	ATCC
ZetaSizer	Malvern Nano ZS Malvern	Nano ZS	用于外泌体表征