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方法文章

构建与表征一种基于外泌体的多巴胺递送系统

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DOI：

10.3791/63624

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2022年4月4日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Vocational School of Health Services/İstanbul, Altinbas University, 2Chemical Metallurgy Faculty, Department of Bioengineering, Yildiz Technical University, 3Faculty of Medicine, Department of Histology & Embryology, Istinye University, 43D Bioprinting Design & Prototyping R&D Center, Istinye University, 5Stem Cell and Tissue Engineering R&D Center, Istinye University, 6Medicine Faculty, Istinye University, 7Vocational School of Health Services, Istinye University, 8The V. Akhundov National Scientific Research Medical Prophylactic Institute, 9Center for Stem Cells and Regenerative Medicine (LivMedCell), Liv Hospital

本文内容

摘要

本研究旨在通过将多巴胺载入华通氏胶间充质干细胞来源的外泌体，获得一种制剂。本方案详细描述了外泌体的分离与表征、药物载入所得外泌体的过程，以及所开发制剂的细胞毒性活性。

摘要

大小在40至200纳米之间的外泌体构成了细胞外囊泡中最小的亚群。这些由细胞分泌的生物活性囊泡在细胞间物质运输和通讯中发挥着重要作用。外泌体主要存在于血浆、脑脊液、尿液、唾液、羊水、初乳、母乳、关节液、精液和胸膜积液等体液中。鉴于外泌体的尺寸，人们认为它们可能在中枢神经系统疾病中发挥重要作用，因为其能够穿过血脑屏障（BBB）。因此，本研究旨在通过将多巴胺封装入从华通胶间充质干细胞（WJ-MSCs）中分离的外泌体，开发一种基于外泌体的纳米载体系统。通过表征的外泌体与多巴胺共孵育。孵育结束后，对载有多巴胺的外泌体重新进行表征。并通过药物释放和细胞毒性实验对载药外泌体进行了研究。结果表明，多巴胺可成功地被封装于外泌体内部，且载有多巴胺的外泌体对成纤维细胞的活力无明显影响。

引言

外泌体是一类具有重要生物学特性的活性囊泡，大小在40 nm至200 nm之间。外泌体起源于细胞膜，由内体释放而形成。1这些结构充当细胞间通讯的媒介，可与邻近细胞相互作用，促进活性分子的转移。外泌体可从多种不同来源中分离获得，包括血浆、尿液、脑脊液、唾液等体液，以及在体外培养的细胞系 体外 条件。由于外泌体含有脂质、蛋白质和核酸等生物大分子，因此在神经损伤修复中发挥着重要作用2. 神经系统的支持细胞——胶质细胞3，将蛋白质和微小 RNA 转运至神经元的轴突 通过 外泌体4.

形成髓鞘的脂质是神经传导的一个特征性成分，这些脂质也可通过少突胶质细胞以外泌体形式释放via exosomes4,5。外泌体还参与大脑中的突触可塑性、神经元应激反应、细胞间通讯以及神经发生等过程6,7。由于外泌体具有纳米级尺寸，能够穿过血脑屏障（BBB）。在穿透该膜后，存在一条从脑间质液到脑脊液的特殊转运途径8。得益于其表面特性，外泌体可作为药物递送系统高效地与靶细胞相互作用，并主动递送所载药物。

由于外泌体表面表达多种黏附蛋白（四次跨膜蛋白和整合素），这些细胞外囊泡能够轻易地与宿主细胞膜相互作用并融合9。人们认为，外泌体可作为药物递送系统，尤其适用于中枢神经系统疾病的治疗，因其具备穿透血脑屏障（BBB）的能力以及特定的表面特性。间充质干细胞（MSC）来源的外泌体相较于同种异体细胞治疗具有更低的免疫排斥风险，因此在无细胞治疗应用中可能发挥重要作用10。

多巴胺是一种分子，其在大脑中的缺乏是帕金森病（PD）的典型特征，并且症状逐日加重11,12,13。已知PD与中脑黑质中多巴胺能神经元的退化以及运动神经元功能的丧失有关14,15。多巴胺能神经元的死亡导致神经递质多巴胺无法输送至脑纹状体，进而引发PD特有的症状16。这些PD症状包括运动迟缓、姿势不稳、强直，尤其是静止性震颤12,13。尽管PD在两个多世纪前就已被首次描述，但目前仍在持续开展研究以阐明该疾病的病理机制和病因，当前普遍认为PD是一种复杂的全身性疾病17。据预测，当超过80%的神经元发生退化时，才会出现多巴胺缺乏，并表现出临床PD症状18。在疾病治疗中，通常采用不完全的多巴胺补充疗法以减轻运动症状。体内研究表明，将多巴胺直接注入动物脑内可显著缓解症状19。由于多巴胺无法直接注入人脑，且进入体内的多巴胺不能穿过血脑屏障（BBB），临床上使用多巴胺前体药物如L-DOPA（L-3,4-二羟基苯丙氨酸）以及多巴胺受体激动剂20。这类药物的疗效会随时间推移而下降。然而，目前仍无治愈PD的治疗方法。因此，迫切需要开发新的治疗策略和干预手段，以揭示疾病的发病机制，并减轻PD对患者的影响。

基于外泌体的研究最近因其在神经系统疾病治疗策略和病理学信息获取方面的潜力而受到关注。间充质干细胞（MSC）来源的外泌体已被证明可减轻神经损伤中的炎症反应，并促进神经元再生21,22,23。此外，已有报道称MSC来源的外泌体分泌组通过表现出神经营养和神经保护作用，尤其在多巴胺能神经元上，可减少细胞凋亡24,25。近年来，以外泌体作为治疗性药物递送系统的平台研究已显著加速。大量研究表明，相关药物可被轻松包载入外泌体，并安全递送至靶细胞、组织和器官26,27。孵育、冻融循环、超声处理和挤出等不同方法均可用于将药物载入外泌体28。

外泌体或类外泌体囊泡的共孵育可使疏水性小分子被动包载入这些递送系统中28,29,30。特别是姜黄素31、过氧化氢酶30、阿霉素32和紫杉醇33 等多种分子已被有效载入外泌体。研究发现，含有过氧化氢酶（具有抗氧化活性）的外泌体可高效富集于脑内的神经元和小胶质细胞中，并表现出显著的神经保护作用30。在同一项研究中，向复合物中添加皂苷以提高载药效率，结果发现其可在孵育过程中增加药物的载药率30,34。然而，仍需进一步研究以建立外泌体载药的标准。

本文描述了一种通过将多巴胺包封于从WJ-MSCs中分离的外泌体而构建纳米载体系统的方法。所有步骤，包括WJ-MSCs的培养、 外泌体的分离与表征、药物负载实验、多巴胺负载外泌体的多种技术表征，以及 体外 细胞毒性分析的详细说明。

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方案

注意：有关本实验方案中使用的所有材料和设备的详细信息，请参见材料表。

1. 华通氏胶间充质干细胞的培养与冷冻保存

  1. 从 -80 °C 冰箱中取出华通氏胶间充质干细胞（WJ-MSCs，购自 ATCC）。将细胞接种至含有添加了 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM-F12 培养基的培养瓶中。在含 5% CO2 的培养箱中，于 37 °C 下孵育。
  2. 每 2 天更换一次培养基。当细胞融合度达到 80% 时进行传代。用 5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤待传代的细胞。
    注：在加入胰蛋白酶前用 PBS 洗涤可确保细胞易于从培养瓶表面脱离。
  3. 吸除 PBS，向培养瓶中加入 5 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液。在含 5% CO2 的培养箱中，于 37 °C 孵育 5 分钟。
  4. 收集上清液至离心管中，在 1,500 x g 条件下离心 5 分钟。离心后弃去上清液，用移液器向管中加入 1 mL DMEM-F12 + 10% FBS。
  5. 将细胞转移至更大的培养瓶中，继续添加 DMEM-F12 + 10% FBS 进行培养，直至获得足够的外泌体35。
    注：培养的细胞以 100 万个/mL 的密度，加入 10% 二甲基亚砜（DMSO）后冻存于 -80 °C。

2. 脐带华通胶间充质干细胞外泌体的制备

注意：外泌体从培养的华通氏间充质干细胞（WJ-MSCs）中分离获得。当细胞覆盖培养瓶表面并达到约80%融合度时，进行外泌体分离。

  1. 从培养瓶中移除含有10% FBS的上清液，并用5 mL PBS洗涤细胞。用PBS冲洗后，向细胞中加入无血清的DMEM-F12培养基。将培养瓶置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育48 h。孵育结束后，收集无血清培养基至离心管中，并于-20 °C保存。
    注意：在步骤2.1中，收集180 mL无血清培养基并保存于-20 °C。解冻后，按以下所述开始批量离心处理。
  2. 外泌体的分离
    1. 将收集的无血清培养基在+4 °C条件下以300 × g离心10 min。小心吸取上清液并转移至另一离心管中。
    2. 将收集的上清液在+4 °C条件下以2,000 × g离心10 min。小心吸取上清液并转移至另一离心管中。
    3. 将收集的上清液在+4 °C条件下以10,000 × g离心30 min。小心吸取上清液并转移至另一离心管中。
    4. 将收集的上清液转移至超速离心管中，在+4 °C条件下以110,000 × g超速离心130 min。缓慢移除上清液，并向沉淀中加入1 mL PBS。
    5. 涡旋重悬沉淀，并在+4 °C条件下以110,000 × g再次超速离心70 min36（图1）。缓慢移除上清液，并向沉淀中加入1 mL PBS。
      注意：完成超速离心步骤后，所获得的外泌体可于-80 °C保存。所得沉淀物现已可用于表征分析。

华通胶干细胞分离流程图；细胞培养、离心、CO₂ 培养。
图 1：外泌体分离。 请点击此处查看此图的放大版本。

3. 外泌体的表征

  1. 纳米颗粒追踪分析（NTA）
    注意：纳米颗粒追踪分析用于测定分离得到的外泌体的粒径和浓度。用于配制1×PBS溶液的试剂片pH范围必须为7.3–7.5。1×PBS溶液含有10 mM磷酸盐缓冲液、137 mM氯化钠和2.7 mM氯化钾。该溶液通过将1片PBS试剂片溶于100 mL蒸馏水中配制而成。配制好的溶液需经高压灭菌处理以实现灭菌。
    1. 将10 µL外泌体加入990 µL PBS中，稀释100倍。将稀释后的悬液吸入一次性注射器中。
    2. 打开NTA设备并连接计算机，启动配套软件。
    3. 将注射器中的样品注入设备卡匣部分的管道中，关闭设备卡匣盖。
    4. 在打开的软件界面中点击开始分析按钮，按下记录按钮保存获得的结果。
  2. 动态光散射分析
    注意：用于测量Zeta电位和粒径的外泌体也需以与NTA分析相同的方式进行稀释。
    1. 将20 µL外泌体加入980 µL PBS中。
    2. 打开Zeta粒径分析仪及其连接的计算机，启动配套软件。
    3. 将步骤3.2.1所得悬液加入一次性比色皿中。打开设备盖子，将比色皿放入卡匣内，然后关闭盖子。
    4. 在设备软件中选择比色皿类型，点击开始分析按钮进行Zeta电位和粒径分析。
      注意：粒径分析和Zeta电位分析需分别进行。

4. 多巴胺载入外泌体

注意：在完成WJ-MSCs外泌体的表征后，采用孵育法将多巴胺载入外泌体，获得作为药物递送系统的载药外泌体。

  1. 向步骤 2.2.5 中的外泌体悬液加入 3 mL PBS。使用 0.22 µm 滤器过滤稀释后的悬液以实现灭菌。将 500 µL 灭菌后的外泌体悬液转移至另一管中。
  2. 用蒸馏水配制多巴胺溶液（0.5 mg/mL）。向含有外泌体的管中加入 500 µL 多巴胺溶液。
  3. 向步骤 4.2 中的悬液加入皂苷。将制备好的外泌体-多巴胺悬液在 37 °C 下孵育 24 小时。
    注意：皂苷浓度不应超过总溶液的 0.002%。
  4. 将悬液在 90,000 × g 条件下超速离心 70 分钟，以去除培养基中游离的多巴胺和皂苷。将分离得到的外泌体储存于 -20 °C，待后续分析使用37。
    注意：为保持所制备多巴胺溶液的稳定性，需加入 0.02% 抗坏血酸。

5. 多巴胺负载外泌体的表征

  1. 纳米颗粒追踪分析（NTA）
    注意：纳米颗粒追踪分析用于测定分离得到的外泌体的粒径和浓度。
    1. 按照步骤 3.1.1-3.1.4 稀释外泌体并进行 NTA 分析。
  2. 动态光散射分析
    注意：用于测定Zeta电位和粒径的外泌体，其稀释方式与纳米颗粒追踪分析类似。
    1. 按照步骤 3.2.1-3.2.4 稀释外泌体并进行动态光散射分析。
      注意：每种溶液（皂苷、多巴胺、外泌体-多巴胺）的粒径和Zeta电位需分别分析。

6. 高效液相色谱法（HPLC）

注意：通过高效液相色谱法（HPLC）测定外泌体中装载的多巴胺含量。为了检测所获得制剂中是否存在多巴胺，需通过特殊处理使外泌体破裂。

  1. 将配方置于75 °C加热器中蒸发。向悬浮液中加入乙腈（50:50比例），涡旋混匀。超声处理溶液10分钟。
  2. 在10,000 × g条件下离心10分钟。通过0.22 µm滤膜过滤上清液。
  3. 使用C18色谱柱在30 °C、流速1 mL/min的条件下分析所有待测物（流动相为H2O/乙腈）。在230 nm处测定吸光度38。

7. 药物载药量（DL）测定及 体外 药物释放动力学

  1. 载药量（DL）
    注意：使用紫外-可见光谱法（UV-Vis）定量测定外泌体中负载的多巴胺含量，在280 nm处读取吸光度。合成过程中收集的上清液用于测定未负载药物的量，并据此确定上清液中多巴胺的浓度 通过 多巴胺的标准校准曲线。
    1. 配制1 mg/mL的多巴胺储备液。用蒸馏水将储备液稀释，配制成0.05、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mg/mL的系列浓度。
      注意：为保持所配制的多巴胺溶液的稳定性，需加入0.02%的抗坏血酸。
    2. 使用紫外分光光度计在280 nm处测定多巴胺各稀释液的吸光度，绘制标准校准曲线。
    3. 在280 nm处测定上清液的吸光度。
    4. 使用公式（Eq）计算多巴胺的载药量1)39.
      DL (%) = 蛋白质结合率计算，公式：(A（总）- A（上清）)/A（总），百分比得率。 100 (1)
      注：该分析需进行三次重复实验。
  2. 体外 药物释放动力学
    注意：使用透析膜进行载多巴胺外泌体的药物释放动力学实验。以pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）作为释放介质，模拟生理微环境。
    1. 将1 mL多巴胺负载的外泌体加入透析膜中。将膜置于烧杯内，向烧杯中加入15 mL PBS。
    2. 在0.5、1、2、4、6和8小时时，从烧杯中取1 mL释放介质样品。每个时间点取样后，用新鲜的PBS补足所取样品的体积。使用紫外-可见分光光度计在280 nm波长下分析指定时间间隔采集的样品。
    3. 使用公式（Eq）计算结果2)40.
      释放率 (%) = 多巴胺释放比率公式，Σ 符号；神经递质分析的化学方程式  100  (2)
      注意：为测定制备标准曲线 体外 药物释放动力学。配制浓度分别为0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5和5.0 mg/mL的多巴胺溶液，使用紫外-可见分光光度计在280 nm处测定各浓度溶液的紫外吸光度值。

8. 体外 细胞毒性试验

  1. 成纤维细胞的复苏与培养
    1. 从 -80 °C 冰箱中取出成纤维细胞，接种至含有 DMEM-F12 + 10% FBS 的培养瓶中。
    2. 将细胞置于含 5% CO2 的 37 °C 培养箱中孵育，每 2 天更换一次培养基。
    3. 当细胞融合度达到 80% 时进行传代，按步骤 1.3–1.5 操作。以 1,500 × g 离心 5 分钟后，弃去上清液，加入 1 mL DMEM-F12 + 10% FBS，将 10,000 个细胞接种至 96 孔板的每个孔中。
      1. 加入 DMEM-F12 培养基 + 10% FBS，在含 5% CO2 的 37 °C 培养箱中孵育 18 小时。孵育结束后更换各孔中的培养基。
    4. 制备多巴胺负载外泌体悬液的储备液。用培养基将多巴胺负载外泌体制剂稀释至浓度分别为 100 µL/mL、250 µL/mL、500 µL/mL 和 1,000 µL/mL。
    5. 将配制好的不同浓度外泌体加入 96 孔板各孔的细胞中，在含 5% CO2 的 37 °C 培养箱中孵育 18 小时41。
  2. MTT 细胞活力检测
    注意：孵育结束后，通过 MTT 检测法测定细胞的活力比例。
    1. 用 PBS 配制 MTT 溶液（5 mg/mL），每孔加入 10 µL MTT 溶液，在 37 °C 孵育 4 小时。
    2. 孵育结束后，每孔加入 100 µL DMSO，在室温避光条件下孵育 30 分钟，使用酶标仪在 570 nm 波长下测定吸光度值42,43。
      注意：MTT 活力检测每组设三个重复孔。

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结果

外泌体的分离与表征
当华通胶干细胞培养达到足够密度时，将其在无血清培养基中继续培养并孵育48小时。孵育结束后，将上清液储存于-20 °C。收集的上清液用PBS稀释后进行超速离心（图1）。所得溶液通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）和动态光散射（DLS）进行分析。外泌体通过0.22 µm滤膜过滤实现灭菌。所获得的外泌体平均粒径为98 nm（视频 1）。离心结束后，共获得约100亿个外泌体颗粒。NTA与DLS分析显示的纳米颗粒数量结果相互一致。此外，源自WJ-MSCs的外泌体的Zeta电位测定值为-15.7 mV（图2 和 图3）。

视频 1：脐带华通胶来源外泌体的纳米颗粒示踪分析。

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讨论

外泌体是由大多数细胞类型分泌的直径为40-200 nm的小型膜性囊泡，例如间充质干细胞（MSCs）1。外泌体能够介导细胞间的通讯，可通过内吞作用、吞噬作用、微胞饮作用、脂质介导的内化以及膜融合等方式进入细胞33,44。与其他纳米载体系统相比，外泌体表面含有脂质和胆固醇，使其能够携带亲水性和疏水性分子，而胆固醇末端的氢键作用有助于实现紧密的分子包装45。

本研究进行了间充质干细胞（MSC）来源外泌体的分离、药物负载实验及细胞毒性检测。已知外泌体在神经发生中具有重要作用，尤其在大脑中，此外还具有运载物质及介导细胞间通讯等重要功能6,7。此外，MSC来源的外泌体具有相对良好的耐受性、内在的治疗特性，并表现出高稳定性和靶向归巢能力

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作主要由伊斯坦布尔技术大学科学研究项目（TSA-2021-4713）提供的研究经费资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 µm 膜滤器Aisimo用于灭菌过程
0.45 µm 注射器滤器Aisimo用于灭菌过程
15 mL Falcon管巢用于细胞培养步骤
25 cm2 细胞培养瓶（Falcon，TPP 细胞培养瓶）巢用于细胞培养步骤
50 mL Falcon管巢用于细胞培养步骤
75 cm2 细胞培养瓶（Falcon，TPP 细胞培养瓶）巢用于细胞培养步骤
96孔板（Falcon，TPP微孔板）默克密理博用于细胞培养步骤
乙腈Sigma271004-1L用于高效液相色谱分析
高压灭菌NUVE-OT 90L用于灭菌过程
细胞培养舱Hera Safe KS用于细胞培养过程
离心的日立CF16RN用于外泌体分离步骤
CO2 带有 Safe Cell UV 的培养箱Panasonic用于细胞培养过程
盐酸多巴胺 H8502-10GSigmaH8502-10G用于外泌体多巴胺装载
Dulbecco改良Eagle培养基/营养混合物F-12SigmaRNBJ7249用作细胞培养基
胎牛血清-FBSCapricornFBS-16A通过添加至细胞培养基中使用。
-80℃冰箱 °CPanasonicMDF-U5386S-PE用于储存细胞及其产生的外泌体
冰箱PanasonicMPR-215-PE用于储存细胞培养物及其他材料
高效液相色谱-HPLC安捷伦科技对所得制剂中多巴胺的存在进行了考察。
显微镜 - Primovert蔡司用于观察细胞培养中的细胞。
MTT 比色法Biomatik用于测定细胞活力
NanoSight NS300马尔文帕纳科马尔文帕纳科用于外泌体表征
Optima XPN-100 超速离心机贝克曼库尔特用于外泌体分离步骤
PBS片剂Biomatik43602在PBS溶液的配制过程中
青霉素/链霉素溶液CapricornPB-S添加至培养基中以防止细胞培养污染。
移液器辅助器伊索拉布
精密天平-KernKern-ABJ220-4NM用于溶液的配制
Q500 超声波破碎仪Qsonica, LLC用于在高效液相色谱分析中消化外泌体
皂苷Sigma47036-50G-F在外泌体多巴胺载药过程中，通过将其加入总体溶液中使用。
Spectrostar-Nano 分光光度法BMG LABTECH用于 MTT 和药物释放分析
SPSS 22统计软件程序
Vorteks-FinePCRFinePCR-FineVortex用于均匀混合溶液
37 ℃水浴 °C-SenovaSenova用于细胞培养步骤
沃顿’水母间充质干细胞ATCC
ZetaSizerMalvern Nano ZS马尔文纳米ZS用于外泌体表征

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