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方法文章

利用光镊与离焦显微技术对红细胞黏弹性性质的定量分析

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DOI：

10.3791/63626

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2022年3月25日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro Nacional de Biologia Estrutural e Bioimagem - CENABIO, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2Instituto de Física, Programa de Pós-graduação Multidisciplinar em Física Aplicada, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 3Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas Biofísica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 4Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro - Campus Macaé, 5Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Endocrinologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 6Instituto de Ciências Exatas, Departamento de Física, Universidade Federal de Minas Gerais, 7Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种基于光镊和离焦显微镜的集成化实验方案，用于测量细胞的流变学特性。该方案在研究红细胞在不同生理-病理条件下的黏弹性特性方面具有广泛的应用价值。

摘要

红细胞的黏弹性特性已通过多种技术进行了研究。然而，已报道的实验数据存在差异。这不仅归因于细胞本身的正常变异性，还与细胞响应的方法和模型差异有关。本文采用一种结合光镊与离焦显微镜的集成化实验方案，用于获取红细胞在1 Hz至35 Hz频率范围内的流变学特征。光镊用于测量红细胞的复弹性常数，而离焦显微镜则可获得细胞的高度轮廓、体积及其形态因子——该参数可用于将复弹性常数转换为复剪切模量。此外，通过应用软玻璃态流变学模型，可获得两个模量的标度指数。该方法学能够在明确的实验条件下，针对多种生理与病理状态，系统地研究红细胞的力学行为，并表征其黏弹性参数。

引言

成熟的红细胞（RBCs），也称为红血球，能够在通过人体最狭窄的毛细血管时伸展至其原始大小的两倍以上1。这种能力归因于其在受到外力作用时发生形变的独特特性。

近年来，已有不同的研究对红细胞（RBC）表面的这一特性进行了表征2,3。描述材料在外力作用下弹性与黏性响应的物理学领域称为流变学。通常情况下，当施加外部作用力时，所产生的形变取决于材料本身的性质，可分为储存能量的弹性形变和耗散能量的黏性形变4。所有细胞（包括红细胞）均表现出黏弹性行为；换句话说，能量既被储存也被耗散。因此，细胞的黏弹性响应可通过其复数剪切模量 G*(ω) = G'(ω) + iG"(ω) 来表征，其中 G'(ω) 为储能模量，反映弹性行为，而 G"(ω) 为损耗模量，反映其黏性4。此外，已有研究采用唯象模型来描述细胞的响应，其中应用最广泛的一种称为软玻璃态流变模型5，其特征是复数剪切模量与载荷频率之间呈幂律关系。

基于单细胞的方法已被用于表征红细胞（RBC）的黏弹性特性，其通过施加力并测量在给定载荷下的位移来实现2,3。然而，关于复数剪切模量，文献中相关结果较少。利用动态光散射技术，报道了红细胞储能模量和损耗模量的数值，在1–100 Hz频率范围内变化于0.01–1 Pa之间6。通过使用光学磁扭细胞仪，获得了表观复数弹性模量；为便于比较，有研究提出使用乘性因子可能有助于解释这些差异7。

最近，建立了一种基于光镊（OT）与散焦显微技术（DM）的新方法，作为一种集成工具，用于定量绘制人红细胞在时间依赖性载荷下的剪切储能模量与损耗模量的变化。8,9此外，采用软玻璃态流变学模型对结果进行拟合，以获得表征红细胞的幂律系数8,9.

总体而言，本研究建立的方法8,9（其具体实验方案如下文详述）通过采用实测的形态因子 Ff 值，解决了以往研究中的不一致问题。该因子用于关联红细胞（RBC）表面的力与形变同应力与应变之间的关系，并可作为一种新型诊断方法，用于定量测定来自不同血液疾病患者的红细胞的黏弹性参数及其软玻璃态特性。利用下文所述的实验方案进行此类表征，有望从力学生物学角度为理解红细胞行为开辟新的研究途径。

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方案

人血样本由成年男性和女性志愿者提供，采集过程遵循里约热内卢联邦大学研究伦理委员会批准的方案（方案编号 2.889.952），并在巴西平台注册，CAAE 编号为 88140418.5.0000.5699。所有志愿者均签署并提交了书面知情同意书。患有任何血红蛋白病和/或正在服用管制药物的个体被排除在外。整个过程遵循了该机构伦理委员会批准的指导方针。

1. 样品支架的制备

  1. 为每个样品槽准备两张盖玻片（24 mm × 60 mm 和 24 mm × 32 mm；厚度 = 0.13–0.17 mm）以及一个橡胶圈（直径 = 10 mm；厚度 = 2 mm）。
  2. 将硅脂均匀涂抹在橡胶圈表面，确保完全覆盖其整个周长。
  3. 将橡胶圈放置在盖玻片上，涂有硅脂的一面朝向盖玻片。静置 5 分钟以确保牢固粘附，样品槽即可用于接种细胞培养。
    注意：此外，也可使用市售或自制的玻璃底培养皿，具体方法如前所述10。

2. 细胞培养

注意：以下步骤描述了如何从人血中获取健康的红细胞。每次实验前必须新鲜制备样品。

  1. 将20 µL血液稀释于250 µL含有137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、1.8 mM KH2PO4、10 mM葡萄糖并添加1 mg/mL牛血清白蛋白（BSA）的1×磷酸盐缓冲液（PBS）溶液中。
  2. 在室温下以200 × g 离心2分钟，用移液器吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于1 mL 1× PBS/BSA溶液中。用缓冲液洗涤细胞2次。
  3. 使用血细胞计数板计算细胞密度，并将50,000至100,000个细胞接种至步骤1中制备的样品槽中。静置10–15分钟，使细胞非特异性贴附于盖玻片；该等待时间对细胞无影响。
  4. 向样品中加入0.2 µL 10%（v/v）聚苯乙烯微球溶液（半径 = 1.52 ± 0.02 µm），用于后续光镊实验。通过显微镜观察样品以确认充分混匀。
  5. 细胞接种后，将第二片盖玻片置于橡胶圈上方（无需涂抹润滑脂进行固定），封闭装置，完成样品制备。样品即可用于显微成像与操作。

3. 光镊显微镜装置设置

注意：光镊（OT）是一种利用高度聚焦的激光束捕获微小物体，并测量皮牛顿范围内的力和纳米尺度位移的工具。所使用的光镊激光（波长1064 nm）必须进行适当校准，具体方法如前所述10。

  1. 简而言之，使用至少两个相距数厘米（至少10–20 cm）的反射镜，将线偏振激光束导向倒置显微镜的后部入射口。精确调整激光束，使其沿直线进入显微镜（图1）。
  2. 随后，利用安装在显微镜内的二向色镜反射激光束，使其沿物镜轴线方向平行传播，并从物镜后端入射口的中心附近进入物镜。这将使激光聚焦以形成光镊（图1）。
  3. 接下来，为了利用光镊测量力，需对系统进行校准以获得光阱刚度（κOT）。有关光镊校准步骤的更详细描述，请参见文献10。一旦确定了κOT，光镊系统即可用于流变学实验。

4. DM 设置

注意：微分干涉相差显微技术（DM）是一种基于明场的光学显微技术，当显微镜轻微离焦时，可使透明物体变得可见11,12。该技术已被用于获取红细胞（RBC）的形态13。用于光镊（OT）系统的同一台显微镜也可用于DM，通过三维重建获得高度轮廓。

  1. 通过执行科勒照明14 调整显微镜照明系统，并为获得更佳分辨率，将聚光镜光圈完全打开，以进行实验。
  2. 使用压电定位系统在所有坐标方向上移动样品，并在 z 轴上实现纳米级精度。在所有轴上执行压电系统的自动校准。完成所有操作步骤后，显微镜系统即可用于数字全息显微镜（DM）实验。

5. 基于光镊的流变实验与分析

注意：流变学实验包括观察细胞对不同频率微小振荡的响应。

  1. 实验
    1. 使用光镊系统，用光镊激光捕获微球，然后通过将微球压向红细胞表面靠近顶部且接近细胞边缘的位置，将其附着于红细胞上。此步骤需借助显微镜完成。随后，捕获另一微球并重复相同的附着操作，但此次将其附着于盖玻片上，靠近细胞的位置。附着在盖玻片上的微球作为参照微球图2），这是跟踪压电位移并与红细胞球体进行比较所必需的。
    2. 确保在开始测量前，所选细胞已牢固贴附于盖玻片上，且红细胞及参考微球已分别黏附于红细胞表面和盖玻片。尽管黏附率较高（约80%–90%），仍需通过观察识别未黏附的细胞，因为这些细胞会随时间发生移动。
    3. 添加一个幅值为的正弦函数， ξ0 = 0.500 ± 0.001 μm 以及 1 Hz、7 Hz、14 Hz、21 Hz、28 Hz 和 35 Hz 的不同频率，对应的角频率 ω 分别为 6.3 rad/s、169 rad/s、88 rad/s、132 rad/s、176 rad/s 和 220 rad/s，通过压电软件输入至压电平台软件中，方法如前所述8,9.
    4. 使用压电位移台，按下启动按钮以启动压电位移，将红细胞球体稳定捕获在光镊中，并利用先前设定的正弦函数对样品施加周期性运动。采用能够以每秒790帧或更高帧率成像的相机记录样品的运动过程。实验示意图如图所示 图2.
    5. 在样品接受正弦运动的同时，激活光镊以捕获附着在红细胞表面的微球。无论选择何种温度进行实验，包括室温， 37 °C，或其他温度时，需仔细监测温度，以避免测量过程中出现温度波动。用于产生光镊（OT）的红外激光（1064 nm）几乎不会对细胞造成损伤或加热。
  2. 分析
    1. 使用 ImageJ 分析正弦运动期间获得的图像，以确定每个球体随时间变化的质心位置。
      注意：这些数据可用于生成能够显示两个球体之间相位和振幅差异的图表。此类信息对于获取红细胞的黏弹性响应至关重要。
    2. 为获取每个球体的质心，打开 ImageJ 软件，导入正弦运动过程中获得的整段视频。
    3. 在 图像 标签，单击 调节，然后选择 阈值阈值窗口将打开。请选择 B&W这将使背景变为白色，而球体变为黑色。
    4. 调整直方图下方两个滚动条的阈值，使两个球体均显示最大数量的像素。
    5. 通过单击选择参考球体 文件 > 矩形. 绘制一个矩形以选择球体。在一幅图像中选定参考球体后，确保该矩形在视频的所有其他图像中也能正确选中同一个球体。
    6. 然后，在 分析 标签，点击 设置测量参数 并选择 质心 选项。
    7. 再次点击 分析 标签并选择 分析颗粒新窗口将打开。根据球体半径定义大小和圆度。勾选以下选项框 显示结果 和 清晰的结果最后，单击 好的 以处理所有图像。
    8. 一个包含质心xy坐标的新窗口将会出现。将这些坐标值保存为.txt文件。对附着在红细胞表面的另一个球体重复此操作。
    9. 为了获取两个球体的振幅和相位差，打开分析软件，导入先前获得的 .txt 文件。
    10. 创建一个包含三列的新表格。在第一列（c0）中添加帧数，在第二列（c1）中添加参考球体的x坐标，在第三列（c2）中添加附着在红细胞表面的球体的x坐标。
      注意：在此示例中，由于正弦运动仅在 x 轴方向进行，因此只需使用两个球体的 x 坐标。
    11. 接下来，将帧与时间进行关联。单击 Windows > 公式输入将打开一个名为“公式输入”的新窗口。在此窗口中，可设置八个不同的方程式，每个方程式对应一个特定的功能键（从 F1 到 F8）。
    12. 选择 F1，输入以下公式：
      c3 = c0 /（相机帧率）
      点击 运行这将在表格中创建一个用于时间的新列（第4列）。
    13. 将每一帧的 x 坐标值减去其对应的均值。为此，指定公式输入中的任意两个键，并为每个键输入以下方程：
      c4 = (c1 - 平均值(c1）和 c5 = (c2 - 均值(c2))
      点击 运行 按钮。结果将分别显示在第5列和第6列，对应参考值和红细胞球形化结果。
    14. 将质心值从像素转换为微米。为此，使用公式输入中的另一个键，并输入以下方程：
      c4 = c 4 / 转化 数量
      对第5列重复相同的过程。
      注意：使用微米尺/直尺并通过与测量时相同的显微镜设置（包括相同的物镜）获取其图像，以完成换算。该步骤可在显微镜校准过程中进行，从而获得像素/微米的对应关系。
    15. 生成一个以两个球体质心在 y 轴、时间在 x 轴的图。为此，请单击 图集 > 线性与散点新窗口将打开。为横轴选择时间列，为纵轴选择参考点和红细胞球体的质心位置列（单位为微米）。
    16. 在图中，仅选择与第一角频率（6.3 rad/s）相关的数据。使用图中所示的工具 图3.
    17. 定义用于校正参考球体数据曲线的方程。为此，请点击 曲线拟合 > 通用与 Fit1，选择与参考球体位置相关的数据框，然后单击 定义. 将打开一个新窗口以定义方程。位置 ξ(t参考球体的)由以下公式描述：
      ξ(t) = ξ0cos(ωt)
      其中 ξ 样品的正弦运动， ω 是角频率，而 t 是时间，单位为 s。将此方程转换至分析软件中，其形式如下：
      三角函数公式，m1*cos(2*π*m2*(m0-m3))；参数：m1、m2、m3 被赋予数值。，其中 m1 是 ξ，m2 是 f，m0 是时间 t，m3 是余弦函数的相位 t = 0.
    18. 从图中估算 m1、m2 和 m3 的值。定义方程后，点击 好的数据将根据方程进行拟合，图表中将出现一条曲线和一个小方块，其中显示 m1、m2 和 m3 的数值。
    19. 定义用于调整红细胞球体数据曲线的方程。为此，请单击 曲线拟合 > 通用 并定义用于调整数据曲线的方程。位置 ρ(t红细胞球体的体积由以下公式给出：
      动态平衡方程，ρ(t) = ξ₀cos(ωt) − ξ'cos(ωt − φ)，在物理公式语境中。
      其中 ξ是反相振幅，φ 是反相角。将此公式代入分析软件后，其形式如下：
      静态平衡公式、三角方程、数学教育概念、数学分析，其中 m1、m2 和 m3 为参考球体曲线拟合所得的值，m4 为 ξ‘和 m5 是 φ。
    20. 从图中估算 m4 和 m5 的值。定义公式后，单击 好的数据将根据方程进行拟合，图表中将显示一条曲线和一个小方块，同时标出 m4 和 m5 的值。
    21. 接下来，创建一个新表格，将曲线拟合得到的数据分别填入对应的列中。定义五个不同的列，用于以下参数：角频率、参考球体的振幅、初始时间、红细胞球体的振幅以及相位差角。对所有其他频率重复相同的步骤。
    22. 使用以下方程计算储存量（K'）和损耗常数（K):
      静态平衡方程，\(K'(\omega)\)，公式示意图，用于研究简谐运动分析。
      用于描述黏弹性动力学机械分析的方程，K''(ω) = κ_OT(ξ_0/ξ')sin(φ) - ωβ。
      其中 κOT 是OT弹性常数，且 β 是斯托克斯阻力系数。将这些方程转换至分析软件中，其形式如下：
      三角函数公式方程，图示包含以下函数：c6 = (kσT) × (c1/c4) × cos(c5) - (kσT)，以及

       显示复变量方程的数学表达式，包含三角函数项和代数项。，其中 β 和 κOT 需要由系统中找到的值进行替换。
    23. 将结果绘制在图表上，x 轴用于 K y轴代表 K' (图4).

6. 获取整体细胞形态因子的DM实验与分析

  1. 视频采集
    1. 使用软件移动压电载物台的xy方向，寻找附着在盖玻片上的孤立细胞。捕获一个已知直径的聚苯乙烯微球并将其附着到红细胞表面。利用压电载物台轻微移动已被捕获且附着在红细胞表面的微球，以使细胞发生形变，随后将微球固定在盖玻片上。
      注意：也可使用OT测量中使用的同一细胞。
    2. 调整 z 轴位置以找到聚焦图像，使焦平面位于所选细胞的中央。该图像显示细胞中心的灰度值与细胞外区域（背景）的灰度值相近，对比度最小。
    3. 当位置固定后，使用相机软件以每秒25帧的速率，采集约5,000幅8位、256像素×256像素的图像，生成整个细胞的视频。然后，移动z轴位置 2 µm 向下或向上调节以获取所选细胞的离焦图像。重复上述参数，生成此情况下的视频。
    4. 最后，在不改变z轴位置的情况下，寻找一个无细胞区域，重复相同操作，以生成图像背景的视频。
  2. 对比度图像采集
    1. 将三个视频分别转换为三幅平均图像。使用 ImageJ，选择其中一个视频，点击 图像 > 堆叠 > Z 投影 并选择 平均强度 可选步骤。对其他视频重复此操作，以获得各自的图像。
    2. 将所有获得的图像从8位转换为32位浮点格式。在ImageJ中，点击 图像 > 类型 > 32位然后，单击 分析 > 设置测量参数 并选择 平均灰度值 选项。最后，再次点击 分析 > 测量.
    3. 接下来，单击 过程 > 图像计算器 将聚焦图像除以背景图像，然后将结果乘以聚焦图像的灰度平均值。通过点击获取灰度平均值 过程 > 数学 > 倍增.
    4. 为获得平均值，请选择对焦清晰的图像，然后点击 分析 > 测量代表性图像的灰度平均值为69,199。对离焦图像重复上述步骤，此时灰度平均值为69,231。 图5 显示操作前后聚焦与散焦的图像。
    5. 图像在操作过程中可能会失去视觉对比度。为了更好地观察图像，请点击 图像 > 调节 > 亮度/对比度 并选择 自动 选项
    6. 接下来，使用以下关系式计算图像对比度：
      用于化学分析研究中浓度计算公式的方程示意图，其中 N图像 是细胞的灰度值， N0 是细胞外的灰度值，是一个常数参数，对应于取决于相机的零光强时的灰度值。
    7. 寻找该值 B，使用功率计测量光强度。对于每个光强度值，必须记录一段视频；从而将不同的光强度值与不同的灰度级别相关联。最后，获得线性拟合，并将B与零光强度相关联15.
    8. 找到……的值 N0，点击 多边形选择 图标并绘制一个多边形，如图中的示例所示 图6然后，单击 分析 标签并选择 测量 用于计算所选区域的平均灰度值。每幅图像由一组像素构成，每个像素具有特定的灰度值。所有构成图像的像素所产生的灰度值集合对应于 N图像.
    9. 使用对比度方程来确定 N图像 - No 并选择执行此操作 过程 > 数学 > 减去. 将结果除以 N0 - B最后，找到聚焦的对比度（C0）和离焦图像（C1).
  3. 获取高度轮廓
    1. 为了获得高度轮廓，使用前文所述的方法13简而言之，使用哈特利变换（FHT）获取红细胞厚度。在 ImageJ 中，点击 过程 > FFT > FFT 选项，然后选择 FHT。
    2. 在 ImageJ 中减去图像 C0 和 C1 过程 > 数学 > 减去 为获得后续步骤所需的图像，计算公式为：C = C₀ - C₁。
    3. 对于图像 C，单击 过程 > FFT > FFT 选项，然后选择 FHT 对图像执行哈特利变换，然后除以空间频率 q2 使用定制插件 DivideQ2。单击 插件 > DivideQ2.
      注意：必须将文件 DivideQ2.class 复制到安装 ImageJ 的插件目录中。该插件以 .class 文件形式提供（补充文件 1) 需放入 ImageJ 的插件文件夹中。
    4. 然后，使用逆变换 FHT 过程 > FFT > FFT 获得灰度值与细胞高度成正比的图像。
    5. 最后，单击 过程 > 数学 > 倍增 使用以下常数乘以所得图像：
      光学参数方程示意图，包含折射率与厚度计算。
      根据图像、样本和实验设置的特征来定义13。在此， n = 1.51 是油的折射率， p = 0.0721 μm 是图像中微米与像素之间的关系，Δn = 0.058 是红细胞与水相介质折射率之间的差异，以及聚焦与散焦图像之间的距离（Zf1 - Z图2) = 2μm，以及图像的大小， N2 = 256 pxl2.
    6. 使用所得图像获取高度轮廓（图7）。将所得图像导入ImageJ，用于观察不同的高度轮廓。具体结果取决于黄色垂直线在细胞中的位置，例如， 图7 通过按 Ctrl + K 观察由垂直线限定的高度轮廓。
  4. 形态因子
    1. 在找到包含红细胞高度轮廓的图像后，使用 2 µm 使用离焦对比度在 ImageJ 中生成一组两幅图像。点击 图像 > 堆叠，然后选择该选项 图像堆叠. 为计算形状因子，使用 ImageJ 自定义宏分析图像栈。该 ImageJ 自定义宏可下载，地址为 补充文件 2.
      注意：该程序利用离焦图像确定细胞边缘，然后针对每个水平位置，使用包含高度轮廓的图像来计算周长。除了边缘信息外，程序还会计算周长及其倒数。将所有周长倒数值相加后乘以像素厚度，所得结果对应于形态因子的倒数。
    2. 在程序中输入像素/微米的对应关系。该数值应来自显微镜物镜校准实验。在本示例中，该值为13.87 pixel/μm.
    3. 选择堆栈中第一幅图像上黄线的水平起始位置。在细胞起始位置之前开始画线，并将线延伸至超出细胞的垂直边界。在示例中，黄线长度为153像素，起始位置位于 i = 70, y1 = 80 与 i = 70, y2 = 195 之间。然后，将黄线水平移动，直至终点位置为 f = 245, y1 = 80 与 f = 245, y2 = 195。
    4. 最后，为了确定细胞边界、周长及周长的倒数，请选择 大体 标签并点击 运行宏。该宏将生成一个表格，包含边缘位置、周长及周长的倒数，以及被分析细胞的图像。请检查该图像的边缘是否与 图7否则，请重复该步骤。
    5. 使用周长倒数之和来计算形态因子8.

7. 软玻璃态流变学模型与实验分析

  1. 将实验数据整理成表格
    1. 在分析软件中，通过点击新建一个表格 文件 表。为以下参数确定10个不同的列（从c0到c9）：所用角频率（rad/s）：c0； K' (pN/µm每个角频率下获得的值：c1； ErrK'c2 K (pN/µm每个角频率下获得的值：c3； ErrKc4 G'(Pa) 值，对应每个角频率：c5； ErrG': c6 G (Pa) 值，对应每个角频率：c7； ErrG：c8 和 Ff 及其相应的误差：c9 (图8）。使用以下公式填充以下各列：
      c5 = (3 × c1) / (8 × 1.28 × 0.087)
      c6 = (3 / (8 × 0.087 × 1.28)) × √(c2² + (c1 × 0.01 / 1.28)² + (c1 × 0.008 / 0.087)²)
      c7 = (3 × c3) / (8 × 1.28 × 0.087)
      c8 = (3 / (8 × 0.087 × c4)) × √(c4² + (c3 × 0.01 / 1.28)² + (c3 × 0.008 / 0.087)²)
  2. 绘制曲线 G' (ω）与 G (ω)
    1. 生成曲线 G' (ω）与 G (ω在分析软件中，使用上一个表格中的数据。点击 图集 > 线性 并选择 散点图 格式。
    2. 新窗口将打开。选择 G 将列为 x 轴和 G' 纵坐标作为 y 轴。最后，单击 绘图 单击按钮以获取图表。
    3. 要向图表中添加误差线，请单击 绘图 窗口，然后单击 绘图 > 误差线新窗口将会打开。首先，标记 Y Err 选项。另一个名为 误差线设置 将打开。
    4. 点击 % 的数值，选择 数据列，然后点击 柱状图 ErrG'最后，单击 好的 > 绘图，y值的误差线将会显示。接下来选择x轴数值，重复相同的步骤 X 误差平方 以及ErrG的正确列。最终的图表将类似于所示的图表。 图9.
  3. 将参数拟合到软玻璃态流变学模型
    注意：数据分析分为两部分：1）对曲线进行拟合 G' (ω）与 G (ω) 绘制曲线图以获取参数 Γ 和 Gm；2）曲线拟合 G' (ω）和 G (ω) 作为频率的函数 ω，以获得幂律指数 α.
    1. 曲线拟合 G' (ω）与 G (ω) 绘制曲线以获取参数 Γ 和 Gm.
      1. 点击 曲线拟合 标签，选择 Fit1新窗口将会打开。请选择 方形 并点击 定义 按钮。此时将出现一个名为“通用曲线拟合定义”的窗口。输入以下方程：
        m1 + m0/m2
        其中 m1 = 61.576；m2 = 1，允许误差为 1 × 10-5其中，m0 表示 G，m1 代表 Gm m2 代表 Γ.
        注意：对于 m1 和 m2，必须在曲线拟合定义过程中估算其各自的数值。上述估算基于所示示例实验。在实际实验中，应根据图中观察到的数值进行估算。
      2. 点击 好的 窗口和拟合图中均会出现按钮，如图所示 图10 - 一条黑色曲线。检查曲线拟合表中列出的 m1 和 m2 的正确数值，该表格随图表一同出现。
    2. 曲线拟合 G' 和 G 作为角频率的函数 ω
      1. 接下来，创建另外两个图，即 G' 作为 ω 的函数 G' 作为……的函数 ω仅在 y 轴上添加误差线，如前所示。
      2. 重复曲线拟合步骤，但此次在 曲线拟合选择，选择 G" 选项，然后在 整体适配 > 曲线定义，写出以下方程式：
        静态平衡方程；ΣFx=0；m1=23.683，m2=0.5；数学计算
        在此情况下，m1 被估计为该值 G (ω) = 23.683 Pa，当 ω = 6.3 时 弧度/s；m2 估计为 0.5（请记住，m2 是指数） α 且在 0 到 1 之间变化）。输入该数值 Γ = 2.0293，根据 m2 的结果 图10.
      3. 选择该选项 体重数据完成所有这些步骤后，单击 好的，以及与图中相似的曲线拟合 图11 - 会出现一条蓝色曲线。其数值为 α, α = 0.63 ± 0.02 和 G0, G0 = (3.7 ± 0.3)Pa 将出现。使用这些值来拟合下一条曲线， G' (ω).
      4. 单击下一条曲线，重复曲线拟合过程，但此次在 通用拟合曲线定义，写出以下方程式：
        化学分析中计算分子质量的公式：55.075 + 3.703 × m0^m3。
        在这种情况下，m3 仅为一个估计值 α 以确认先前获得的数值。使用以下数值 G0 = 3.703 和 G' (ω) = 23.683 Pa 当 ω = 6.3 rad/s 时。
      5. 再次加入 1 x 10-5 允许误差并标记该选项 体重数据完成所有这些步骤后，单击 好的，以及与图中相似的曲线拟合 图11 - 会出现一条绿色曲线。

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结果

图1 表示用于流变学测量的光镊系统的示意图。图2 展示了微流变学实验的示意图，其中包含两个微球以及一个典型的红细胞（RBC）。图3 显示了当压电平台产生正弦运动时，两个微球振幅随时间变化的典型曲线。参考微球（图3 - 红色曲线）随平台运动而振荡，而与红细胞连接的微球（图3 - 蓝色曲线）则以不同的振幅和相位振荡。通过测量这些参数，可以确定样品中不同红细胞的复数弹性常数 K* (ω)。图4 显示了储能弹性常数 K' (ω) 与损耗弹性常数 K" (ω) 之间的典型关系图。所观察到的线性关系表明，红细胞表面可被视为一种软玻璃态材料。接下来，为了获得细胞的整体形态因子 F

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讨论

本方案介绍了一种基于光镊与离焦显微镜的集成方法，用于定量绘制红细胞（RBC）的黏弹性特性。该方法可测定储能剪切模量和损耗剪切模量，以及表征红细胞软玻璃态流变特性的标度指数。该方案已应用于不同的实验条件，例如生理状态8下，或恶性疟原虫（P. falciparum）红细胞内发育周期的各个阶段9。

文献中的参考文献指出，红细胞（RBC）流变学存在差异，部分原因在于测量过程中未充分考虑细胞形态的变化6,7。利用动态光散射技术，在1–100 Hz频率范围内测得红细胞的储能模量和损耗模量值介于0.01–1 Pa之间6。在另一项研究中，采用光学磁扭转细胞力学技术测定了表观复数弹性模量7，但其结果与动态光散射所得数值存在差异；因此，为便于比较，引入了一个84倍的乘法因子。通过...

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披露

作者对本文所述产品无任何财务利益，亦无其他事项需要披露。

致谢

作者谨向CENABIO高级显微镜中心的所有成员致以诚挚感谢，感谢他们提供的关键帮助。本研究工作得到了巴西科研机构国家科学技术发展委员会（CNPq）、高等教育人员进修协调委员会（CAPES）—资助代码001、里约热内卢州科研支持基金会（FAPERJ）以及国家复杂流体科学与技术研究所（INCT-FCx）与圣保罗州科研支持基金会（FAPESP）的资助。B.P. 获得了FAPERJ提供的JCNE项目资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
35 mm 培养皿康宁430165
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA9418
盖玻片克尼特尔玻璃VD12460Y1A.01 和 VD12432Y1A.01
玻璃底培养皿MatTek Life SciencesP35G-0-10-C
葡萄糖Sigma-AldrichG7021
ImageJ美国国立卫生研究院https://imagej.nih.gov/ij/
浸油尼康MXA22165
倒置显微镜尼康Eclipse TE300
KaleidaGraphSynergy 软件https://www.synergy.com/
KClSigma-AldrichP5405
KH2PO4Sigma-AldrichP5655
显微镜相机滨松C11440-10C
Na2HPO4Sigma-AldrichS5136
NaClSigma-AldrichS5886
血细胞计数板Sigma-AldrichBR717805-1EA
物镜尼康PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H；PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H 和 Plan APO 10x XXNA PH2
光学平台ThorlabsT1020CK
OT 激光器IPG PhotonicsYLR-5-1064-LP
聚苯乙烯微球Polysciences17134-15
橡胶环永久封片剂NBR O型密封圈
硅脂道康宁Z273554
阶段定位PIP-545.3R8S
移液器GilsonP1000

参考文献

  1. Fowler, V. M. The human erythrocyte plasma membrane: a Rosetta Stone for decoding membrane-cytoskeleton structure. Current Topics in Membranes. 72, 39-88 (2013).
  2. Tomaiuolo, G. Biomechanical properties of red blood cells in health and disease towards microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (5), 051501(2014).
  3. Depond, M., Henry, B., Buffet, P., Ndour, P. A. Methods to investigate the deformability of RBC during malaria. Frontiers in Physiology. 10, 1613(2019).
  4. Boal, D. Mechanics of the Cell. 2 edn. , Cambridge University Press. (2012).
  5. Balland, M., et al. Power laws in microrheology experiments on living cells: Comparative analysis and modeling. Physical Review E. 74 (2), 021911(2006).
  6. Amin, M. S., et al. Microrheology of red blood cell membranes using dynamic scattering microscopy. Optics Express. 15 (25), 17001-17009 (2007).
  7. Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. Viscoelasticity of the human red blood cell. American Journal of Physiology Cell Physiology. 293 (2), 597-605 (2007).
  8. Gomez, F., et al. Effect of cell geometry in the evaluation of erythrocyte viscoelastic properties. Physical Review E. 101 (6-1), 062403(2020).
  9. Gomez, F., et al. Plasmodium falciparum maturation across the intra-erythrocytic cycle shifts the soft glassy viscoelastic properties of red blood cells from a liquid-like towards a solid-like behavior. Experimental Cell Research. 397 (2), 112370(2020).
  10. Pompeu, P., et al. Protocol to measure the membrane tension and bending modulus of cells using optical tweezers and scanning electron microscopy. STAR Protocols. 2 (1), 100283(2021).
  11. Agero, U., Mesquita, L. G., Neves, B. R., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Defocusing microscopy. Microscopy Research and Technique. 65 (3), 159-165 (2004).
  12. Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy. Physical Review E. 67 (5), 051904(2003).
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  14. Köhler, A. New method of illumination for photomicrographical purposes. Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 (1894).
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  16. Ayala, Y. A., et al. Rheological properties of cells measured by optical tweezers. BMC Biophysics. 9, 5(2016).
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红细胞力学软玻璃态流变学细胞高度轮廓剪切模量压电载物台聚苯乙烯微球
利用光镊与离焦显微技术对红细胞黏弹性性质的定量分析
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