本文介绍了一种基于光镊和离焦显微镜的集成化实验方案，用于测量细胞的流变学特性。该方案在研究红细胞在不同生理-病理条件下的黏弹性特性方面具有广泛的应用价值。
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方法文章
利用光镊与离焦显微技术对红细胞黏弹性性质的定量分析
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
红细胞的黏弹性特性已通过多种技术进行了研究。然而，已报道的实验数据存在差异。这不仅归因于细胞本身的正常变异性，还与细胞响应的方法和模型差异有关。本文采用一种结合光镊与离焦显微镜的集成化实验方案，用于获取红细胞在1 Hz至35 Hz频率范围内的流变学特征。光镊用于测量红细胞的复弹性常数，而离焦显微镜则可获得细胞的高度轮廓、体积及其形态因子——该参数可用于将复弹性常数转换为复剪切模量。此外，通过应用软玻璃态流变学模型，可获得两个模量的标度指数。该方法学能够在明确的实验条件下，针对多种生理与病理状态，系统地研究红细胞的力学行为，并表征其黏弹性参数。
引言
成熟的红细胞（RBCs），也称为红血球，能够在通过人体最狭窄的毛细血管时伸展至其原始大小的两倍以上1。这种能力归因于其在受到外力作用时发生形变的独特特性。
近年来，已有不同的研究对红细胞（RBC）表面的这一特性进行了表征2,3。描述材料在外力作用下弹性与黏性响应的物理学领域称为流变学。通常情况下，当施加外部作用力时，所产生的形变取决于材料本身的性质，可分为储存能量的弹性形变和耗散能量的黏性形变4。所有细胞（包括红细胞）均表现出黏弹性行为；换句话说，能量既被储存也被耗散。因此，细胞的黏弹性响应可通过其复数剪切模量 G*(ω) = G'(ω) + iG"(ω) 来表征，其中 G'(ω) 为储能模量，反映弹性行为，而 G"(ω) 为损耗模量，反映其黏性4。此外，已有研究采用唯象模型来描述细胞的响应，其中应用最广泛的一种称为软玻璃态流变模型5，其特征是复数剪切模量与载荷频率之间....
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方案
人血样本由成年男性和女性志愿者提供，采集过程遵循里约热内卢联邦大学研究伦理委员会批准的方案（方案编号 2.889.952），并在巴西平台注册，CAAE 编号为 88140418.5.0000.5699。所有志愿者均签署并提交了书面知情同意书。患有任何血红蛋白病和/或正在服用管制药物的个体被排除在外。整个过程遵循了该机构伦理委员会批准的指导方针。
1. 样品支架的制备
- 为每个样品槽准备两张盖玻片（24 mm × 60 mm 和 24 mm × 32 mm；厚度 = 0.13–0.17 mm）以及一个橡胶圈（直径 = 10 mm；厚度 = 2 mm）。
- 将硅脂均匀涂抹在橡胶圈表面，确保完全覆盖其整个周长。
- 将橡胶圈放置在盖玻片上，涂有硅脂的一面朝向盖玻片。静置 5 分钟以确保牢固粘附，样品槽即可用于接种细胞培养。
注意：此外，也可使用市售或自制的玻璃底培养皿，具体方法如前所述10。
2. 细胞培养
注意：以下步骤描述了如何从人血中获取健康的红细胞。每次实验前必须新鲜制备样品。
- 将20 µL血液稀释于250 µL含有137 mM NaCl、2.7 ....
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结果
图1 表示用于流变学测量的光镊系统的示意图。图2 展示了微流变学实验的示意图，其中包含两个微球以及一个典型的红细胞（RBC）。图3 显示了当压电平台产生正弦运动时，两个微球振幅随时间变化的典型曲线。参考微球（图3 - 红色曲线）随平台运动而振荡，而与红细胞连接的微球（图3 - 蓝色曲线）则以不同的振幅和相位振荡。通过测量这些参数，可以确定样品中不同红细胞的复数弹性常数 K* (ω)。图4 显示了储能弹性常数 K' (ω) 与损耗弹性常数 K" (ω) 之间的典型关系图。所观察到的线性关系表明，红细胞表面可被视为一种软玻璃态材料。接下来，为了获得细胞的整体形态因子 F
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讨论
本方案介绍了一种基于光镊与离焦显微镜的集成方法，用于定量绘制红细胞（RBC）的黏弹性特性。该方法可测定储能剪切模量和损耗剪切模量，以及表征红细胞软玻璃态流变特性的标度指数。该方案已应用于不同的实验条件，例如生理状态8下，或恶性疟原虫（P. falciparum）红细胞内发育周期的各个阶段9。
文献中的参考文献指出，红细胞（RBC）流变学存在差异，部分原因在于测量过程中未充分考虑细胞形态的变化6,7。利用动态光散射技术，在1–100 Hz频率范围内测得红细胞的储能模量和损耗模量值介于0.01–1 Pa之间6。在另一项研究中，采用光学磁扭转细胞力学技术测定了表观复数弹性模量7，但其结果与动态光散射所得数值存在差异；因此，为便于比较，引入了一个84倍的乘法因子。通过.......
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披露
作者对本文所述产品无任何财务利益，亦无其他事项需要披露。
致谢
作者谨向CENABIO高级显微镜中心的所有成员致以诚挚感谢，感谢他们提供的关键帮助。本研究工作得到了巴西科研机构国家科学技术发展委员会（CNPq）、高等教育人员进修协调委员会（CAPES）—资助代码001、里约热内卢州科研支持基金会（FAPERJ）以及国家复杂流体科学与技术研究所（INCT-FCx）与圣保罗州科研支持基金会（FAPESP）的资助。B.P. 获得了FAPERJ提供的JCNE项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 35 mm 培养皿 | 康宁 | 430165 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| 盖玻片 | 克尼特尔玻璃 | VD12460Y1A.01 和 VD12432Y1A.01 | |
| 玻璃底培养皿 | MatTek Life Sciences | P35G-0-10-C | |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| ImageJ | 美国国立卫生研究院 | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| 浸油 | 尼康 | MXA22165 | |
| 倒置显微镜 | 尼康 | Eclipse TE300 | |
| KaleidaGraph | Synergy 软件 | https://www.synergy.com/ | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| 显微镜相机 | 滨松 | C11440-10C | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| 血细胞计数板 | Sigma-Aldrich | BR717805-1EA | |
| 物镜 | 尼康 | PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H；PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H 和 Plan APO 10x XXNA PH2 | |
| 光学平台 | Thorlabs | T1020CK | |
| OT 激光器 | IPG Photonics | YLR-5-1064-LP | |
| 聚苯乙烯微球 | Polysciences | 17134-15 | |
| 橡胶环 | 永久封片剂 | NBR O型密封圈 | |
| 硅脂 | 道康宁 | Z273554 | |
| 阶段定位 | PI | P-545.3R8S | |
| 移液器 | Gilson | P1000 |
参考文献
- Fowler, V. M. The human erythrocyte plasma membrane: a Rosetta Stone for decoding membrane-cytoskeleton structure. Current Topics in Membranes. 72, 39-88 (2013).
- Tomaiuolo, G. Biomechanical properties of red bl....
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