利用CRISPR/Cas9技术构建飞蝗纯合突变体

摘要

本研究提供了一种基于CRISPR/Cas9核糖核酸酶的蝗虫纯合突变体构建的系统优化流程，以及蝗虫卵的冷冻保存与复苏的详细方法。

摘要

飞蝗 飞蝗不仅是全球范围内造成人类巨大经济损失的蝗灾物种之一，也是研究昆虫变态发育的重要模式生物。CRISPR/Cas9系统能够精确定位于特定DNA位点并在目标区域内部进行切割，高效引入双链断裂，从而实现目标基因的敲除或新基因片段在特定位点的整合。CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术不仅为应对蝗虫研究中遇到的科学问题提供了有力工具，也为蝗虫防控提供了极具前景的技术手段。本研究提供了在飞蝗中利用Cas9蛋白与单导向RNA（sgRNA）复合物实现CRISPR/Cas9介导基因敲除的系统性实验方案，详细阐述了靶位点的选择与sgRNA的设计方法，随后 体外 sgRNA的合成与验证。后续步骤包括卵筏收集和鞣化卵分离，以实现成功显微注射并降低死亡率，以及卵的培养。 突变率的初步估算、飞蝗的繁育，以及突变体的检测、保存和传代，以确保基因编辑飞蝗种群的稳定性。该方法可为基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术在飞蝗及其他昆虫中的应用提供参考。

引言

基因编辑技术可用于在特定基因组位点引入插入或缺失，从而有目的地人工修饰目标基因¹近年来，CRISPR/Cas9 技术发展迅速，在生命科学各个领域的应用范围不断扩大^2,3,4,5,6CRISPR/Cas9 系统最早于1987年被发现⁷，并广泛存在于细菌和古菌中。进一步研究表明，这是一种依赖RNA引导的核酸酶Cas9来抵御噬菌体的原核生物适应性免疫系统⁸人工改造的CRISPR/Cas9系统主要由两个组分构成：单链向导RNA（sgRNA）和Cas9蛋白。sgRNA由与靶序列互补的CRISPR RNA（crRNA）和相对保守的辅助性反式激活crRNA（tracrRNA）组成。当CRISPR/Cas9系统被激活时，sgRNA与Cas9蛋白结合形成核糖核蛋白复合物（RNP），并引导Cas9至其靶位点 通过 RNA-DNA相互作用的碱基配对。随后，Cas9蛋白可切割双链DNA，从而在靶位点的原间隔序列邻近基序（PAM）附近产生双链断裂（DSB）。^9,10,11,12为减轻双链断裂（DSBs）造成的损伤，细胞会激活全面的DNA损伤应答，以高效识别基因组损伤并启动修复程序。细胞内存在两种不同的修复机制：非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR）。NHEJ是最常见的修复通路，能够快速修复DNA双链断裂，防止细胞发生凋亡。然而，该机制易产生错误，常在DSB位点附近引入小片段的插入或缺失（indels），通常导致开放阅读框移码，从而实现基因敲除。相比之下，同源修复是一种较为罕见的事件。当存在与DSB周围序列同源的修复模板时，细胞偶尔会依据该模板对基因组断裂进行修复。HDR的结果是DSB被精确修复。特别是，若修复模板的同源序列之间含有额外的序列，则这些序列可通过HDR整合到基因组中，从而实现特定基因的插入。¹³.

随着sgRNA结构和Cas9蛋白变体的优化与发展，基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统也已成功应用于昆虫研究，包括但不限于 黑腹果蝇, 埃及伊蚊, 家蚕, 棉铃虫, 小菜蛾， 和 飞蝗^{14,15,16,17,18,19}据作者所知，尽管由Cas9蛋白和 体外 转录的sgRNA已用于蝗虫基因组编辑^20,21,22目前仍缺乏利用CRISPR/Cas9核糖核酸酶系统构建飞蝗纯合突变体的系统性详细实验方案。

飞蝗是一种重要的农业害虫，具有全球性分布，对粮食生产构成严重威胁，尤其对禾本科植物如小麦、玉米、水稻和小米危害显著²³基于基因组编辑技术的基因功能分析可为飞蝗的防控提供新靶点和新策略。本研究提出了一种敲除飞蝗基因的详细方法 通过 CRISPR/Cas9 系统，包括靶位点的选择和 sgRNA 的设计 体外 sgRNA的合成与验证、卵的显微注射与培养、胚胎阶段突变率的估算、突变体的检测以及突变体的传代与保种。该方案可作为绝大多数蝗虫基因操作的基础参考，也可为其他昆虫的基因组编辑提供有价值的借鉴。

方案

1. 靶位点选择与sgRNA设计

1. 通过文献调研和/或在NCBI和Locust数据库中检索目的基因的mRNA或编码DNA序列（CDS），尽可能收集该基因的序列信息²⁴.
2. 将目的基因序列与其基因组DNA序列进行比对，以区分外显子和内含子区域。
3. 根据研究目的选择目标位点设计的候选区域。设计引物对以扩增候选区域片段，并通过PCR产物的测序分析验证其野生型序列。
   注意：候选靶区域的选择有多种策略。例如，在大多数基因/蛋白功能研究中，可选择靠近起始密码子的外显子片段作为候选区域，以确保基因组编辑后（即基因敲除）整个蛋白/RNA功能完全丧失。而对于特定结构域的功能分析，则应选择该结构域起始端（或两端）的区域作为候选靶区。
4. 使用 E-CRISP 设计等在线资源²⁵ 在候选目标区域中搜索潜在的靶位点。
   1. 选择 "黑腹果蝇 BDGP6" （或其他任何昆虫）在参考基因组的下拉列表中选择 "输入为FASTA序列" 随后将目标区域的序列（以FASTA格式）粘贴到文本框中。
   2. 通过按下启动应用程序 "启动sgRNA搜索" 与 "培养基" 和 "单一设计" 根据预测得分从结果中选取1-3个潜在靶点，并据此设计相应的sgRNA。
      注意：目前有更多可用于CRISPR设计的在线平台，例如CRISPOR、CHOPCHOP、CRISPRdirect、ZiFiT等（参见 材料表）。其中一些工具具备针对其数据库中已有基因组序列数据的物种进行特异性检测的功能。然而，目前在任何在线网站上均未找到蝗虫的基因组序列。因此，在设计蝗虫的CRISPR实验时，建议使用多种在线工具。综合考虑不同网站的分析结果，依据最高特异性、最高效率和最低错配率的原则，从结果中选择合适的sgRNA。图1A，B).

2. sgRNA的合成与验证  体外

1. 根据制造商说明书使用sgRNA合成试剂盒合成sgRNA（材料表）。该过程通常包括三个步骤：DNA模板扩增、体外转录和sgRNA纯化²¹。用无核酸酶水将合成的sgRNA稀释至储存浓度为300 ng/µL，以供后续使用。
2. 扩增并纯化目的基因片段，作为CRISPR/Cas9系统体外切割实验的底物。按照制造商说明书进行这些步骤。
3. 用无核酸酶水将购买的Cas9蛋白稀释至300 ng/µL。取1 µL sgRNA（300 ng/µL）与1 µL Cas9蛋白（300 ng/µL），加入200 ng纯化的靶片段，在切割缓冲液中37 °C孵育1小时（总体积10 µL；见表1）。通过琼脂糖凝胶电泳评估sgRNA介导的Cas9切割效率（图1C）。选择活性高的sgRNA用于后续显微注射。
   注意：琼脂糖凝胶电泳结果可使用图像处理软件转换为灰度图像，并根据预期大小条带的灰度值估算切割效率。

3. 卵的显微注射与培养

1. 使用显微拉针仪（材料表）拉制玻璃毛细管以制备注射针。设置参数如下：加热温度为588，拉力为90，速度为60，时间为40。使用微磨针仪（材料表）研磨注射针尖端。
   注意：理想的针尖应开口且边缘锋利（图2A）。建议额外准备若干注射针，因为在注射过程中针尖可能被堵塞或意外折断。
2. 将1 µL Cas9蛋白（300 ng/µL）与1 µL经验证的sgRNA（300 ng/µL）混合，制备用于注射的核糖核蛋白复合物（RNPs）。加入8 µL无RNase的无菌水，使混合液终体积为10 µL。充分混匀后置于冰上保存。
   注意：Cas9蛋白和sgRNA的终浓度可根据编辑效果进行优化。避免反复冻融已配制的RNP溶液，建议即配即用。
3. 将成年雄性和雌性飞蝗在30 °C、16小时光照:8小时黑暗的光周期条件下共同饲养，并提供充足的新鲜小麦幼苗作为食物。每日观察飞蝗状态，一旦发现交配行为，立即在饲养笼中放入产卵盆（装有湿润无菌沙的塑料花盆或杯子）供其产卵。
   注意：通常，在一个饲养笼（40 cm × 40 cm × 40 cm）中饲养100对成虫足以获得单个基因敲除所需的卵量。若需要更多卵，可增加饲养的飞蝗对数。
4. 从产卵盆中收集新产下的卵荚，静置约30分钟以完成卵的鞣化过程。使用细毛刷在水中轻轻将卵从卵荚中分离，并用无菌水清洗三次。将卵置于培养皿中，并添加无菌水以保持湿润。
   注意：新产卵的鞣化过程可显著提高突变效率²¹。
5. 将制备好的RNP溶液吸入注射针中，并将其安装至显微操作仪（材料表）。
   1. 设置显微注射参数如下：注射压力（pi）为300 hPa，注射时间（ti）为0.5 s，补偿压力（pc）为25 hPa。
   2. 踩下脚踏开关以评估注射液体积。调节注射压力和注射时间，确保每次注射体积约为50–100 nL。
      注意：应排尽针内残留空气，使注射液尽可能连续且可控。针与显微操作仪的连接必须紧密。
6. 将无菌卵规则排列于注射垫上（图2B、C），并将垫置于显微镜载物台上（图3A）。调节显微镜放大倍数直至清晰观察到卵。在显微镜下调节显微注射针位置，使针尖可见并靠近待注射卵。
7. 以适当高度和30–45度角度开始注射。将针尖小心插入卵的微孔区附近（图3B），踩下脚踏开关完成注射。迅速退出针头，并移动注射垫以进行下一颗卵的注射。
   注意：显微注射过程中应观察到卵轻微膨胀。针孔处少量细胞质渗出属正常现象。若液体外流过多，应更换新针或调整注射角度。
8. 将注射后的卵转移至培养皿（含一张湿润滤纸的培养皿）中，置于30 °C恒温培养箱中培养。
   注意：在目标基因突变不影响胚胎发育的前提下，约需13–14天若虫即可孵化（图3C）。为确保获得足够数量的孵化和羽化个体以实现特定基因敲除，建议至少注射100颗卵。

4. 突变率估算与突变体筛选

1. 每天观察注射后卵子的发育情况。在注射后的前5天内，每隔24小时将注射过的卵子转移至新的培养皿中。
2. 第6天^th 注射后第1天（或更晚），随机挑选10枚卵转移至离心管中，加入两颗钢珠，使用研磨仪在60 Hz条件下充分研磨6分钟（参见 材料表）。用1 mL PBS重悬沉淀物。取5 µL混合液加入45 µL 50 mM NaOH中，95 °C裂解5 min。向裂解体系中加入5 µL 1 M Tris-HCl（pH=8.0），以终止碱性裂解反应。
   注意：在最后一次转移后的任意一天均可挑选卵进行碱裂解，可根据卵的发育情况将多个卵作为一个样本（例如，五个6日龄的胚胎可作为一个样本，两个10日龄的胚胎可作为一个样本）。有时使用碱裂解法难以获得卵的基因组DNA，此时可采用商品化的基因组DNA提取试剂盒作为替代方法，从卵中分离基因组DNA。
3. 取1 µL裂解产物作为PCR模板，扩增目标基因片段（表2 和 表3）并将PCR产物送测序。将测序结果与野生型序列进行比对，初步评估CRISPR/Cas9系统是否切割了目标基因 体内 (图4A）。在胚胎阶段检测到插入缺失突变（indels）的条件下，允许其余卵继续后续发育。
   注意：通过此方法，可在胚胎阶段初步估算突变率。如果在此步骤中未检测到插入缺失（indels），请针对目标基因设计新的sgRNA，并从步骤2.1开始重复基因敲除实验流程。
4. 将孵化的若虫转移至饲养笼中，并按照步骤3.3所述条件进行培养。当若虫发育至五龄若虫阶段时，使用塑料培养杯（1只若虫/杯）进行分装隔离。
   注意：若虫通常需要约25–35天发育至第五龄期，最明显的表型特征是翅芽延伸至第4或第5腹节。此外，建议记录死亡若虫的表型，以期在后续研究中预测目标基因与表型之间的关系。
5. 用解剖剪截取约 2 mm 长的触角，采用碱裂解法裂解（步骤 4.2）。按照上述方法（步骤 4.3）分析这些若虫的目标基因片段序列，以鉴定 G₀ 突变体（图4B).
   ​注意：用于裂解的触角切割长度可稍长一些，研磨或切碎触角有助于裂解，尽管触角也可直接进行消化。在测序结果中，靶位点附近出现多个峰的个体被判定为阳性突变体，可用于后续的培育和交配。

5. 突变株系的建立与传代

1. 使用 G₀ 突变体与野生型蝗虫进行杂交（图4B）。收集卵囊，并在 30 °C 下分别孵化。从每个卵囊中选取 3–6 个发育良好的卵，按照步骤 4.2 和 4.3 所述方法检测突变。保留突变阳性的卵囊用于后续发育，淘汰突变阴性的卵囊。
   注意：在胚胎阶段估算突变率可显著加快 G₁ 突变体的筛选。通常，可将 3–6 个发育良好的卵混合为一个样本，按上述方法进行基于 PCR 的基因分型。
2. 按照步骤 4.4 所述方法饲养 G₁ 若虫。剪取约 2 mm 长的触角，按照步骤 4.5 所述方法进行基于 PCR 的基因分型，以检测 G₁ 杂合子。根据制造商说明书（见材料表）进行 TA 克隆，以鉴定其突变类型。使用携带相同突变的 G₁ 杂合子个体进行互交，获得 G₂ 若虫。
   注意：PCR 产物的 Sanger 测序仅能提供用于识别杂合子的信息，但不足以明确具体的突变类型。因此，需对 PCR 产物进行 TA 克隆，以清晰鉴定突变位点，从而促进稳定突变品系的建立。
3. 将 G₂ 若虫饲养至五龄若虫阶段。采用步骤 5.2 所述的基于 PCR 的基因分型方法，鉴定适用于进一步研究及稳定传代的纯合子和/或杂合子个体（图4B）。
   ​注意：注意避免纯合子与杂合子混杂。建议在每一代均进行基于 PCR 的基因分型，以确认各群体的纯合性或杂合性。用于检测的蝗虫数量应根据群体规模而定。此外，可通过互交策略扩大蝗虫群体数量。

6. 胚胎冷冻保存与复苏

1. 用无菌水清洗待冷冻保存的卵，并按上述方法（步骤3.8）将卵置于培养皿中培养5-6天。将这些卵集中于培养皿中，并用滤纸碎片覆盖。用石蜡膜包裹整个培养皿。
2. 先将培养皿置于25 °C环境中保持2天，随后再置于相对较低温度（13-16 °C）下2天。然后将培养皿转移至6 °C冰箱中。每隔2周添加一次水，以维持卵所需的湿润环境（图5A）。
   注意：推测卵在30 °C下发育5-6天后，胚胎已达到转位期（katatrepsis stage）²⁶。梯度降温有助于卵的冷冻保存（Table 5）。
3. 复苏冷冻保存的卵时，将培养皿从冰箱中取出，并在25 °C下放置2天。随后将卵转移至30 °C的培养箱中，直至若虫孵化（图5B）。
   注意：在将冷冻保存的卵转移至30 °C培养箱前，必须先在25 °C下放置一段时间。尽管冷冻保存可能导致孵化率和羽化率下降，但胚胎可至少冷冻保存五个月（Table 5）。

结果

本方案包含利用Cas9蛋白与RNP复合物生成飞蝗纯合突变体的详细步骤 体外 合成的sgRNA。以下是CRISPR/Cas9介导的蝗虫靶基因敲除实验的一些代表性结果，包括靶点选择、sgRNA合成与验证（图1A）、卵的收集与显微注射、突变体筛选与传代、卵的冷冻保存及纯合子卵的复苏。

在本研究中，CRISPR/Cas9 系统的靶位点根据三个在线程序（E-CRISP、CRISPOR 和 ZiFit）的结果选定，位于第一外显子中图1B）。根据Cas9切割实验 体外 (表1），CRISPR/Cas9 RNP 可切割PCR片段（包含靶位点），切割率约为55%（图1C）。随后，使用标准显微注射系统将该RNP显微注射到120个处于单细胞阶段的受精卵中（图2 和

讨论

蝗虫自人类文明诞生以来一直是农业最具破坏性的害虫之一²³CRISPR/Cas9 基因组编辑技术是深入理解蝗虫生物学机制的有力工具，同时也是一种极具前景的害虫防控策略。因此，建立一种高效且易于操作的 CRISPR/Cas9 介导的纯合蝗虫突变体构建方法具有重要意义。尽管已有部分研究报道并初步建立了蝗虫基因组编辑的基本操作流程^18,20,21,22，整个流程的系统性优化仍然缺乏。通常，通过CRISPR/Cas9系统胚胎注射产生的纯合型蝗虫突变体可分为三个主要步骤：a）sgRNA设计、合成与筛选 体外，b）卵的收集、制备与显微注射；以及c）突变体筛选与纯合子维持。本方案提供了一个优化的工作流程，包括靶位点选择的步骤， 体外 sgRNA筛选、卵细胞显微注射以及突变体检测对于利用CRISPR/Cas9系统高效产...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10×NEBuffer r3.1	New England Biolabs	B7030S	缓冲液的  体外 Cas9 切割实验
2×Es Taq MasterMix（含染料）	Cwbio	CW0690	用于基因扩增
2xPfu 预混液（含染料）	Cwbio	CW0686	用于基因扩增
CHOPCHOP			用于设计sgRNA的在线网站，http://chopchop.cbu.uib.no/。
CRISPOR			用于设计sgRNA的在线网站，http://crispor.org。
CRISPRdirect			用于设计sgRNA的在线网站，http://crispr.dbcls.jp/。
电泳电源	LIUYI BIOLOGY	DYY-6D	不同大小核酸分子的分离
Eppendorf 管	Eppendorf	30125177	用于样本采集等
细毛刷	安尼戈尼	1235	用于清洁和分离卵。在线购买。
火焰/棕色微量移液器拉制仪	Sutter Instrument	P97	用于制作显微注射针
凝胶回收试剂盒	Cwbio	CW2302	DNA 回收与纯化
凝胶成像分析系统	OLYMPUS	凝胶成像系统 XR	观察电泳结果
GeneTouch Plus	Bioer	B-48DA	用于基因扩增
玻璃电极毛细管	Gairdner	GD-102	用于制作 带注射针头的 a 微移液器拉制仪
培养箱	MEMMERT	INplus55	用于飞蝗胚胎培养
金属浴	TIANGEN	AJ-800	用于加热样品
微型自动注射器	Eppendorf	5253000068	早期发育阶段胚胎的显微注射
微型离心机	Allsheng	MTV-1	用于混合试剂
微型研磨器	NARISHIGE	EG-401	将注射针尖接地
微量移液器吸头	Eppendorf	5242956003	用于将溶液装入注射针中。
显微操作系统	Eppendorf	TransferMan 4r	一种用于显微注射的替代性操作系统
显微镜	cnoptec	SZ780	用于显微注射
电机驱动操作器	NARISHIGE	MM-94	用于在显微注射过程中控制显微毛细管的位置
多样本组织研磨器	jingxin	Tissuelyser-64	研磨并匀浆卵子
产卵罐	常生源一	CS-11	用湿润的无菌沙填满，供蝗虫产卵。卵囊从此容器中收集。在线购买。
Parafilm	ParafilmM	PM996	用于包裹培养皿。
pEASY-T3 克隆试剂盒	TransGen Biotech	CT301-01	用于TA克隆
培养皿	NEST	752001	用于培养与保存  卵。
移液器	Eppendorf	科研增强	用于样品上样
塑料培养杯			用于单独饲养蝗虫，任何足够大的塑料杯（体积不小于1000 mL）均可。可在线购买。
精准gRNA合成试剂盒	Thermo	A29377	用于sgRNA合成
Primer Premier	PREMIER Biosoft	Primer Premier 5.00	用于引物设计
SnapGene	英杰科学	SnapGene®4.2.4	用于分析  序列
钢珠	华新港球	HXGQ60	用于样品研磨，网上购买。
提示	生物叶片	D781349	用于样品上样
反式DNA标记物II	TransGen Biotech	BM411-01	用于确定基因大小
TrueCut Cas9 蛋白 v2	赛默飞世尔科技	A36496	Cas9蛋白
UniversalGen DNA 试剂盒	Cwbio	CWY004	用于基因组DNA提取
万纳斯剪刀	电子显微镜科学公司	72932-01	用于切断触角
小麦			为饲养蝗虫准备小麦幼苗。购自当地农户。
ZiFiT			用于设计sgRNA的在线网站，http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx。