利用CRISPR/Cas9技术构建飞蝗纯合突变体

摘要

本研究提供了一种基于CRISPR/Cas9核糖核酸酶的蝗虫纯合突变体构建的系统优化流程，以及蝗虫卵的冷冻保存与复苏的详细方法。

摘要

飞蝗 飞蝗不仅是全球范围内造成人类巨大经济损失的蝗灾物种之一，也是研究昆虫变态发育的重要模式生物。CRISPR/Cas9系统能够精确定位于特定DNA位点并在目标区域内部进行切割，高效引入双链断裂，从而实现目标基因的敲除或新基因片段在特定位点的整合。CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术不仅为应对蝗虫研究中遇到的科学问题提供了有力工具，也为蝗虫防控提供了极具前景的技术手段。本研究提供了在飞蝗中利用Cas9蛋白与单导向RNA（sgRNA）复合物实现CRISPR/Cas9介导基因敲除的系统性实验方案，详细阐述了靶位点的选择与sgRNA的设计方法，随后 体外 sgRNA的合成与验证。后续步骤包括卵筏收集和鞣化卵分离，以实现成功显微注射并降低死亡率，以及卵的培养。 突变率的初步估算、飞蝗的繁育，以及突变体的检测、保存和传代，以确保基因编辑飞蝗种群的稳定性。该方法可为基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术在飞蝗及其他昆虫中的应用提供参考。

引言

基因编辑技术可用于在特定基因组位点引入插入或缺失，从而有目的地人工修饰目标基因¹近年来，CRISPR/Cas9 技术发展迅速，在生命科学各个领域的应用范围不断扩大^2,3,4,5,6CRISPR/Cas9 系统最早于1987年被发现⁷，并广泛存在于细菌和古菌中。进一步研究表明，这是一种依赖RNA引导的核酸酶Cas9来抵御噬菌体的原核生物适应性免疫系统⁸人工改造的CRISPR/Cas9系统主要由两个组分构成：单链向导RNA（sgRNA）和Cas9蛋白。sgRNA由与靶序列互补的CRISPR RNA（crRNA）和相对保守的辅助性反式激活crRNA（tracrRNA）组成。当CRISPR/Cas9系统被激活时，sgRNA与Cas9蛋白结合形成核糖核蛋白复合物（RNP），并引导Cas9至其靶位点 通过 RNA-DNA相互作用的碱基配对。随后，Cas9蛋白可切割双链DNA，从而在靶位点的原间隔序列邻近基序（PAM）附近产生双链断裂（DSB）。

方案

1. 靶位点选择与sgRNA设计

1. 通过文献调研和/或在NCBI和Locust数据库中检索目的基因的mRNA或编码DNA序列（CDS），尽可能收集该基因的序列信息²⁴.
2. 将目的基因序列与其基因组DNA序列进行比对，以区分外显子和内含子区域。
3. 根据研究目的选择目标位点设计的候选区域。设计引物对以扩增候选区域片段，并通过PCR产物的测序分析验证其野生型序列。
   注意：候选靶区域的选择有多种策略。例如，在大多数基因/蛋白功能研究中，可选择靠近起始密码子的外显子片段作为候选区域，以确保基因组编辑后（即基因敲除）整个蛋白/RNA功能完全丧失。而对于特定结构域的功能分析，则应选择该结构域起始端（或两端）的区域作为候选靶区。
4. 使用 E-CRISP 设计等在线资源²⁵ 在候选目标区域中搜索潜在的靶位点。
   1. 选择 "黑腹果蝇 BDGP6" （或其他任何昆虫）在参考基因组的下拉列表中选择 "输入为FASTA序列" 随后将目标区域的序列（以FASTA格式）粘贴到文本框中。
   2. 通过按下启动应用程序 "启动sgRNA搜索" 与 "培养基" 和 "单一设计" 根据预测得分从结果中选取1-3个潜在靶点，并据此设计相应的s....

结果

本方案包含利用Cas9蛋白与RNP复合物生成纯合突变型迁徙蝗虫的详细步骤 体外 合成的sgRNA。以下是CRISPR/Cas9介导的蝗虫靶基因敲除实验的一些代表性结果，包括靶点选择、sgRNA合成与验证（图1A）、卵的收集与显微注射、突变体筛选与传代、卵的冷冻保存及纯合卵的复苏

在本研究中，CRISPR/Cas9 系统的靶位点根据三个在线程序（E-CRISP、CRISPOR 和 ZiFit）的结果选定，位于第一外显子内图1B）。根据Cas9切割实验 体外 (表1），CRISPR/Cas9 RNP 可切割PCR片段（包含靶位点），切割率约为55%（图1C）。随后，使用标准显微注射系统将该RNP显微注射到120个处于单细胞阶段的受精卵中图2 和

讨论

蝗虫自人类文明诞生以来一直是农业最具破坏性的害虫之一²³CRISPR/Cas9 基因组编辑技术是深入理解蝗虫生物学机制的有力工具，同时也是一种极具前景的害虫防控策略。因此，建立一种高效且易于操作的 CRISPR/Cas9 介导的纯合蝗虫突变体构建方法具有重要意义。尽管已有部分研究报道并初步建立了蝗虫基因组编辑的基本操作流程^18,20,21,22，整个流程的系统性优化仍然缺乏。通常，通过CRISPR/Cas9系统胚胎注射产生的纯合型蝗虫突变体可分为三个主要步骤：a）sgRNA设计、合成与筛选 体外，b）卵的收集、制备与显微注射；以及c）突变体筛选与纯合子维持。本方案提供了一个优化的工作流程，包括靶位点选择的步骤， 体外 sgRNA筛选、卵细胞显微注射以及突变体检测对于利用CRISPR/Cas9系统高效产.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10×NEBuffer r3.1	New England Biolabs	B7030S	缓冲液的  体外 Cas9 切割实验
2×Es Taq MasterMix（含染料）	Cwbio	CW0690	用于基因扩增
2xPfu 预混液（含染料）	Cwbio	CW0686	用于基因扩增
CHOPCHOP			用于设计sgRNA的在线网站，http://chopchop.cbu.uib.no/。
CRISPOR			用于设计sgRNA的在线网站，http://crispor.org。
CRISPRdirect			用于设计sgRNA的在线网站，http://crispr.dbcls.jp/。
电泳电源	LIUYI BIOLOGY	DYY-6D	不同大小核酸分子的分离
Eppendorf 管	Eppendorf	30125177	用于样本采集等
细毛刷	安尼戈尼	1235	用于清洁和分离卵。在线购买。
火焰/棕色微量移液器拉制仪	Sutter Instrument	P97	用于制作显微注射针
凝胶回收试剂盒	Cwbio	CW2302	DNA 回收与纯化
凝胶成像分析系统	OLYMPUS	凝胶成像系统 XR	观察电泳结果
GeneTouch Plus	Bioer	B-48DA	用于基因扩增
玻璃电极毛细管	Gairdner	GD-102	用于制作 带注射针头的 a 微移液器拉制仪
培养箱	MEMMERT	INplus55	用于飞蝗胚胎培养
金属浴	TIANGEN	AJ-800	用于加热样品
微型自动注射器	Eppendorf	5253000068	早期发育阶段胚胎的显微注射
微型离心机	Allsheng	MTV-1	用于混合试剂
微型研磨器	NARISHIGE	EG-401	将注射针尖接地
微量移液器吸头	Eppendorf	5242956003	用于将溶液装入注射针中。
显微操作系统	Eppendorf	TransferMan 4r	一种用于显微注射的替代性操作系统
显微镜	cnoptec	SZ780	用于显微注射
电机驱动操作器	NARISHIGE	MM-94	用于在显微注射过程中控制显微毛细管的位置
多样本组织研磨器	jingxin	Tissuelyser-64	研磨并匀浆卵子
产卵罐	常生源一	CS-11	用湿润的无菌沙填满，供蝗虫产卵。卵囊从此容器中收集。在线购买。
Parafilm	ParafilmM	PM996	用于包裹培养皿。
pEASY-T3 克隆试剂盒	TransGen Biotech	CT301-01	用于TA克隆
培养皿	NEST	752001	用于培养与保存  卵。
移液器	Eppendorf	科研增强	用于样品上样
塑料培养杯			用于单独饲养蝗虫，任何足够大的塑料杯（体积不小于1000 mL）均可。可在线购买。
精准gRNA合成试剂盒	Thermo	A29377	用于sgRNA合成
Primer Premier	PREMIER Biosoft	Primer Premier 5.00	用于引物设计
SnapGene	英杰科学	SnapGene®4.2.4	用于分析  序列
钢珠	华新港球	HXGQ60	用于样品研磨，网上购买。
提示	生物叶片	D781349	用于样品上样
反式DNA标记物II	TransGen Biotech	BM411-01	用于确定基因大小
TrueCut Cas9 蛋白 v2	赛默飞世尔科技	A36496	Cas9蛋白
UniversalGen DNA 试剂盒	Cwbio	CWY004	用于基因组DNA提取
万纳斯剪刀	电子显微镜科学公司	72932-01	用于切断触角
小麦			为饲养蝗虫准备小麦幼苗。购自当地农户。
ZiFiT			用于设计sgRNA的在线网站，http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx。